Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila

La temperatura es una señal ambiental ubicua. Los animales exhiben una variedad de comportamientos con el fin de evitar temperaturas dañinas y buscar temperaturas cómodas. Drosophila exhibe un comportamiento robusto de la preferencia de la temperatura^6,7. Cuando las moscas se liberan en un gradiente de temperatura de 18-32 °C, las moscas evitan las temperaturas cálidas y frías y finalmente eligen una temperatura preferida de 25 °C por la mañana³. Los sensores de temperatura cálida son un conjunto de neuronas termosensoriales, neuronas AC, que expresan el potencial del receptor transitorio de Drosophila (TPR) canal, TRPA1^6,9. Los sensores de temperatura fría están situados en los segmentos de la 3ª antena, ya que la ablación de los segmentos de la 3ª antena provoca la falta de evitación de la temperatura fría^6. Recientemente, se identificó la proteína TRPP Brivido (Brv)^10. Dado que Brv se expresa en los segmentos de la 3ª antena y media la detección de frío, Brv es una posible molécula de detección de frío, que es crítica para el comportamiento de preferencia de temperatura. En resumen, las moscas utilizan estos dos sensores de temperatura para evitar las temperaturas cálidas y frías y encontrar una temperatura preferida.

Mientras que los mamíferos generan calor para regular su temperatura corporal, los ectotermos generalmente adaptan su temperatura corporal a la temperatura ambiente^11. Algunos ectotherms se saben para exhibir un comportamiento diario de TPR que se cree para ser una estrategia para que los ectotherms regulen su BTR^12. Para determinar si las moscas exhibieron TPR, repetimos el análisis del comportamiento de la preferencia de la temperatura en los varios puntos durante un palmo de 24 horas. Encontramos que Drosophila exhibe un TPR diario, que es bajo por la mañana y alto por la noche y sigue un patrón similar al de BTR en humanos¹³.

En Drosophila,hay ~ 150 neuronas del reloj en el cerebro. Las neuronas del reloj que regulan la actividad locomotriz se llaman osciladores M y E. Sin embargo, curiosamente, los osciladores M y E no regulan la TPR, en su lugar, mostramos que las neuronas de reloj DN2 en el cerebro regulan la TPR pero no la actividad locomotriz. Estos datos indican que TPR está regulado independientemente de actividad locomotriz. Notablemente, el BTR de mamíferos también está regulado independientemente de la actividad locomotriz. Los estudios de ablación en ratas muestran que la BTR se controla a través de neuronas SCN específicas que se dirigen a un subconjunto diferente de neuronas de la zona subparaventricular que las que controlan la actividad locomotriz^14. Por lo tanto, nuestros datos consideran la posibilidad de que el BTR mamífero y la mosca TPR se conservan evolutivamente³, ya que tanto la mosca TPR y mamífero BTR exhiben ritmos de temperatura circadianos dependientes del reloj, que se regulan independientemente de la actividad locomotora.

Aquí, describimos los detalles de cómo analizar el ensayo de comportamiento TPR en Drosophila. Este método permite la investigación no sólo del mecanismo molecular y los circuitos neuronales de TPR, sino también de cómo el cerebro integra diversas señales ambientales y relojes biológicos internos.

1. Preparación de moscas

1. Experimentos de luz oscura (LD)
   1. Críe moscas en incubadoras (25 °C/40-60% de humedad relativa (RH)) bajo ciclos ligeros de 12 horas/oscuridad de 12 horas (LD). La intensidad de la luz de las incubadoras es de ~ 500-1,000 lux.
   2. Dos incubadoras son necesarias para completar los ensayos de comportamiento durante un período de 24 horas. Ambas incubadoras deben tener una luz programable con funciones ON OFF. También deben tener puertas sólidas que no sean permeables a la luz(es decir, sin vidrio o plexiglás).
      Nota: Una incubadora debe ser designada una incubadora de "día" y configurada a un ciclo de LD de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La segunda incubadora debe designarse como una incubadora "nocturna" y establecerse a la inversa de la primera con 12 horas de oscuridad seguida de luz de 12 horas. La incubadora nocturna debe colocarse en la habitación que es accesible en la oscuridad, de tal manera que las moscas que experimentan condiciones nocturnas pueden ser fácilmente accesibles para los experimentos.
   3. Coloque los viales de mosca en incubadoras de día o de noche. Recoger las moscas recién eclosionadas en un vial fresco, 20-30 por ensayo y mantener en la misma incubadora durante 2-3 días.
   4. Después de 2-3 días, use moscas para el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura.
      1. Para los experimentos del día (tiempo de Zeitgeber (ZT) 0-12), recoja las moscas de la incubadora del día.
      2. Justo antes de los experimentos de comportamiento, saque los viales de mosca recogidos de la incubadora de día.
      3. Para experimentos nocturnos (ZT 13-24), recoja las moscas de la incubadora nocturna.
      4. Justo antes de los experimentos de comportamiento, saque los viales de mosca recogidos de la incubadora nocturna, envuelva con papel de aluminio y colóquelos en una caja en la habitación oscura debajo de una lámpara roja.
         Nota: Dado que el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura se realiza bajo oscuridad para los experimentos nocturnos, la exposición a la luz a las moscas debe prevenirse hasta el final de los experimentos de comportamiento.
         Nota: Las moscas no deben estar expuestas al dióxido de carbono el día en que se lleven a cabo los experimentos.
2. Experimentos de oscuridad constante (DD)
   1. Día DD
      1. Una incubadora adicional es necesaria para los experimentos de dd day, a la que nos referimos como una incubadora de "transición" para el resto del manuscrito. La incubadora de transición debe colocarse en la habitación que es accesible en la oscuridad, de tal manera que las moscas que experimentan condiciones de DD se puede acceder fácilmente para los experimentos. Un programa de luz de ejemplo para una incubadora de transición tendría la luz encendía de 1 pm a 7 pm y la luz apagada a las 7 pm-1 pm (Figura 1).
      2. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora de día. Coloque los viales de mosca en la incubadora de transición entre la 1 pm y las 7 pm, cuando la luz esté encendda. De esta manera, las moscas están adecuadamente expuestas a la luz hasta las 7 pm, momento en el que la luz se apaga.
      3. Al día siguiente, antes de la 1 pm, en condiciones oscuras, saque los viales de mosca de la incubadora de transición, envuélvalos con papel de aluminio y colóquelos en una caja. Mantenga la caja en cualquier incubadora durante un día más.
   2. DD Noche
      1. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora nocturna en la oscuridad bajo una lámpara roja. O, además, recoger las moscas cuando la luz de la incubadora nocturna está encendía.
      2. Envuelva los viales recogidos con papel de aluminio en la oscuridad en cualquier momento que las luces estén apagadas y coloque los viales en una caja. Mantenga la caja en cualquier incubadora durante dos días más (Figura 1B).
         Nota: Dado que el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura se realiza bajo oscuridad para los experimentos nocturnos, la exposición a la luz a las moscas debe prevenirse hasta el final de los experimentos de comportamiento.
3. Experimentos de luz constante (LL)
   1. Día ll
      1. Una incubadora adicional es necesaria para los experimentos del día ll. Esta incubadora mantiene la condición LL (25 °C, 800 lux), con la luz encendía continuamente.
      2. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora de día. Coloque los viales de mosca en la incubadora LL en cualquier momento durante su "día".
   2. LL Noche
      1. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora nocturna. Transfiera los viales de mosca de la incubadora nocturna a la incubadora LL durante el tiempo que la luz en la incubadora nocturna esté encendida.
         Nota: Por ejemplo, la luz se apaga a las 7 am en la incubadora nocturna. Transfiera los viales de mosca de la incubadora nocturna a la incubadora LL antes de las 7 am y mantenga los viales en la incubadora LL durante 4 días más.
         Nota: Al día 4 en condiciones LL, se suprime la oscilación de la actividad locomotora^15,16,mientras que el TPR se mantiene ^{aún 3.}

2. El aparato para el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura

1. Colocar una cubierta de plexiglás (29 cm x 19,2 cm)(Figura 4)sobre una placa de aluminio.
2. Controle la temperatura del aire entre la placa y la cubierta. Seis sondas de temperatura están conectadas en varias posiciones en el interior de la cubierta dentro de uno de los carriles (Figura 2).
   Nota: Asegúrese de que las sondas no toquen la placa de aluminio ni la cubierta de plexiglás. La temperatura del aire debe establecerse en un gradiente de 18-32 °C.
3. Coloque el aparato en una sala ambiental mantenida a 25 °C/65-75% HR. Esta habitación necesita ser sellada de cualquier luz exterior. Una sala ambiental normalmente está equipada con ventiladores para mantener una cierta temperatura y humedad.
   Nota: El aire del ventilador probablemente perturba un gradiente de temperatura estable en el aparato. Para evitar esto, utilizamos una lámina transparente que cubre el área que rodea el aparato.
4. Prepare un termómetro e higrómetro para comprobar la temperatura y la humedad en la sala ambiental.
   Nota: La luz influye en la preferencia de temperatura de Drosophila³. La misma intensidad de luz debe suministrarse en el aparato de manera uniforme. La intensidad de las luces ambientales de nuestra habitación es de ~ 800 lux.
   Nota: Cuando se realicen los experimentos de comportamiento, coloque un tubo conectado desde el tanque de CO₂ o suministre cerca del orificio de la parte superior del aparato para anestesiar y deshacerse de las moscas.

3. Preparación de aparatos para uso

1. Encienda el aparato durante al menos 30 minutos para establecer el gradiente de temperatura correctamente en la superficie de la placa (Figura 3).
2. Cubra la cubierta del aparato de comportamiento con repelente al agua para evitar que las moscas trepe por las paredes o el techo de la cubierta. Limpie el exceso de repelente al agua y deje la cubierta durante 25-30 minutos para secar.
3. Retire cualquier condensación en la placa de aluminio. Coloque la cubierta de plexiglás sobre la placa de aluminio y asegure con seis abrazaderas en C(Figura 2).
   Nota: Es muy importante que la cubierta esté bien sellada, si es necesario se puede utilizar cinta adhesiva doble.
4. Deje la cubierta durante al menos 15 min. El gradiente de temperatura del aire entre la placa de aluminio y la cubierta se crea a partir de 18-32 °C.

4. Ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura

1. Cargue las moscas en el espacio entre la placa de aluminio y la cubierta de plexiglás del aparato a través de pequeños agujeros en el centro de cada carril de la cubierta (Figuras 2 y 4). Cubra los agujeros con resbalones de cubierta para evitar que las moscas escapen.
2. Para las condiciones de oscuridad, apague todas las luces de la sala ambiental. Se puede utilizar una lámpara roja cuando las moscas se colocan en el aparato. Asegúrese de que las moscas no estén expuestas a ninguna luz excepto a una lámpara roja hasta que se realicen los experimentos de comportamiento.
3. Para cada ensayo, use de 20 a 25 moscas adultas, que no deben reutilizarse en ensayos posteriores. El ensayo de comportamiento se realiza durante 30 min. Tome algunas fotos con o sin flash. Tenga cuidado de no hacer mucho ruido o cualquier movimiento repentino durante los experimentos.
4. Registre la temperatura de las seis sondas del aparato. Tome nota de la temperatura ambiente, así como la humedad.
5. Anestesiar las moscas en el aparato con gas de dióxido de carbono, aflojar las abrazaderas, quitar la cubierta de plexiglás, y quitar las moscas de la placa. Después de cada experimento, las moscas se desechan. Limpie cualquier condensación o humedad de la placa. Substituya la tapa de la placa y apriete con las abrazaderas en preparación para el próximo experimento.
6. Para tener una representación de la preferencia de temperatura a lo largo de todo el día, el período de 24 horas se divide en ocho zonas horarias, cuatro durante el día y cuatro por la noche. Por ejemplo, usamos estos ZT o CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 y 22-24.
   Nota: Dado que las variaciones de fenotipo causadas por los efectos de enmascaramiento se esperan justo después de que la luz se enciende (ZT0) o apagado (ZT12), no examinamos el comportamiento de preferencia de temperatura durante estos tiempos (ZT o CT 0-1, 11.5-13 y 23.5-24). Se deben realizar al menos cinco ensayos en cada zona horaria para que los resultados sean estadísticamente sólidos.

5. Análisis de datos

1. Calcule el gradiente de temperatura de la siguiente manera: Determine dónde se colocan las sondas de temperatura en función de las dos reglas que se colocan en el lado superior e inferior de la cubierta de plexiglás a lo largo de los bordes (Figura 2A).
2. Se estima que el gradiente de temperatura entre las sondas de temperatura es lineal. Basándose en las ubicaciones de las sondas de temperatura, así como sus correspondientes temperaturas registradas, dibuje líneas que representen cada grado de temperatura en la posición adecuada en las imágenes. Cuente el número de moscas ubicadas en cada intervalo de grados. Excluir cualquier mosca en las paredes o el techo de la cubierta.
3. Calcula el porcentaje de moscas en cada rango de temperatura de cada carril. Una temperatura media preferida se calcula sumando los productos del porcentaje de moscas y temperatura de cada intervalo, como se muestra a continuación:
   % de moscas x 18,5 °C + % de moscas x 19,5 °C + % de moscas x 20,5 °C ....+ % de moscas x 31,5 °C + % de moscas x 32,5 °C.
4. Calcular la temperatura media preferida en cada zona horaria: el comportamiento de preferencia de temperatura se realiza >5 veces durante cada zona horaria (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 y 22-24). Para calcular la temperatura media preferida en cada zona horaria, la temperatura media preferida de cada ensayo se promedia en conjunto. Las barras de error s.e.m. son iguales al error entre las pruebas.

Un ejemplo del ritmo de preferencia de temperatura se muestra en la Figura 5. Si el procedimiento de comportamiento se realiza con éxito, las moscas deben exhibir un TPR en el que prefieren una temperatura baja por la mañana y una temperatura más alta por la noche. El aumento de ~ 1-1.5 ° C durante el día en la preferencia de temperatura debe observarse durante el transcurso del día, independientemente del fondo genético, ya que mostramos que w1118, yw y canton S moscas exhiben una preferencia de temperatura similar durante el día3.

Figura 1. Un esquema de la preparación de la mosca en el día DD. (A) Un ejemplo de un experimento diurno DD. La luz está encendía de 1 pm a 7 pm y la luz se apaga de 7 pm a 1 pm en la incubadora de transición. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora de día. Coloque los viales de mosca en la incubadora de transición en algún momento entre la 1 pm y las 7 pm. Al día siguiente, antes de la 1 pm, saque los viales de mosca de la incubadora de transición en la oscuridad, envuélvalos con papel de aluminio y colóquelos en una caja. (B) Un ejemplo de un experimento nocturno DD. Recoger las moscas que se han criado en la incubadora nocturna, ya sea en la oscuridad durante 7am a 7pm o en la luz durante 7pm a 7am. Saque los viales de mosca de la incubadora nocturna en la oscuridad entre las 7 am y las 7 pm, y envuélvalos con papel de aluminio y colóquelos en una caja

Figura 2. Aparato de comportamiento de preferencia de temperatura. (A) Vista superior. La cubierta de plexiglás se coloca en la placa de aluminio con seis abrazaderas en C. Seis sondas de temperatura están conectadas en varias posiciones en el interior de la cubierta dentro de uno de los carriles. Dos reglas se colocan en la parte superior e inferior de la cubierta de plexiglás a lo largo de los bordes para determinar el gradiente de temperatura. b) Vista lateral. Cuatro dispositivos Peltier se colocan debajo de una placa de aluminio (44 cm x 22 cm). Cada dispositivo Peltier está conectado a los controladores de temperatura que generan temperaturas frías o calientes. Para evitar que los Peltiers se sobrecalienten, el sistema de refrigeración de la computadora está conectado a tubos de agua, ventiladores de refrigeración por aire y fuentes de alimentación. Las sondas de temperatura están incrustadas en el borde de la placa de aluminio y están conectadas a los controladores de temperatura para controlar directamente las temperaturas en la placa de aluminio. Para nuestro aparato actual, los lados frío y caliente se establecen en 12 °C y 36 °C, respectivamente.

Figura 3. Un diagrama del aparato. Las sondas de temperatura se emplean como un control de retroalimentación que lee la temperatura en la placa de aluminio. Los dispositivos Peltier están conectados a los controladores de temperatura. Para evitar el sobrecalentamiento de los Peltiers, los enfriadores líquidos se colocan directamente debajo de los Peltiers. Los cuatro enfriadores de líquidos están conectados por tubos de agua que se conectan a la bomba y al radiador. El radiador tiene dos ventiladores que enfrían la temperatura del agua. La bomba y el radiador están conectados a la fuente de alimentación.

Figura 4. El plano de la cubierta de plexiglás. Este es el plan para la cubierta que está hecha de plexiglás. La cubierta tiene cuatro carriles divididos por tres divisores de 0,2 cm de espesor, y un agujero de 0,7 cm de diámetro se encuentra en el centro del panel superior en cada carril (Figura 2A).

Figura 5. Un ejemplo de los datos de comportamiento de TPR. TPR de w1118 vuela sobre 24 horas. Las temperaturas preferidas se calcularon utilizando la distribución de moscas en los experimentos de comportamiento de preferencia de temperatura. Los datos se muestran como la temperatura media preferida en cada zona horaria. Los números representan el número de ensayos. ANOVA, P < 0.0001. Prueba de Tukey-Kramer comparada con ZT1-3, ***P < 0,001, **P < 0,01 o *P < 0,05. Esta figura del fenotipo TPR está adaptada de Kaneko et al. 3 con permiso.

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