Summary
我们最近发现了一种新的 环食 素输出，温度偏好节奏（TPR），其中苍蝇的首选温度在白天上升，在夜间下降。TPR 独立于另一个昼夜输出（运动活动）进行调节。在这里，我们描述了在 德罗索菲拉TPR的设计和分析。
Abstract
昼夜钟调节生活的许多方面，包括睡眠，运动活动，和体温（BTR）节律1，2。我们最近发现了一种新的环食素输出，称为温度偏好节奏（TPR），其中苍蝇的首选温度在白天上升，在夜间下降3。令人惊讶的是，TPR和运动活性通过不同的昼夜神经元3控制。恐龙运动活动是一种众所周知的昼夜行为输出，为发现许多保存的哺乳动物昼夜钟基因和机制4提供了强有力的贡献。因此，了解TPR将导致迄今未知的分子和细胞昼夜机制的识别。在这里，我们描述如何执行和分析 TPR 分析。这项技术不仅能够解剖TPR的分子和神经机制，而且为整合不同环境信号和调节动物行为的大脑功能的基本机制提供了新的见解。此外，我们最近公布的数据表明，苍蝇TPR与哺乳动物BTR3共享功能。嗜血杆菌是息息的，其中通常调节体温的行为。因此，TPR是一种策略，用于在这些苍蝇5-8产生有节奏的体温。我们相信，进一步探索果蝇TPR将有助于描述动物体温控制机制的特征。
Introduction
温度是一种无处不在的环境线索。动物表现出各种行为，以避免有害的温度和寻求舒适的。 嗜血杆菌 表现出一个强大的温度偏好行为6，7。当苍蝇被释放到温度梯度从18-32 °C，苍蝇避免温暖和寒冷的温度，最后选择在3日早晨25°C的首选温度。暖温传感器是一组热感官神经元，交流神经元，它表达 嗜血杆菌 瞬态受体电位（TPR）通道，TRPA16，9。冷温传感器位于第三天线段，因为消融第三个天线段会导致缺乏冷温避免6。最近，TRPP蛋白布里维多（Brv）被确定为10。由于 Brv 在第三个天线段中表示并调解冷检测，Brv 是一种可能的冷感应分子，对温度偏好行为至关重要。总之，苍蝇使用这两个温度传感器来避免温暖和寒冷的温度，并找到一个首选的温度。
虽然哺乳动物产生热量来调节体温，但息热通常使体温适应环境温度11。众所周知，一些教会每天都会表现出一种TPR行为，这被认为是教会调节BTR12的策略。为了确定苍蝇是否表现出TPR，我们在24小时内重复了不同点的温度偏好行为分析。我们发现， 德罗索菲拉 每天表现出TPR，这是在早上低，在晚上高，并遵循类似于BTR在人类13的模式。
在 德罗索菲拉，大脑中有大约150个时钟神经元。调节运动活动的时钟神经元称为M和E振荡器。然而，有趣的是，M和E振荡器不调节TPR，相反，我们表明，DN2时钟神经元在大脑中调节TPR，但不是运动活动。这些数据表明，TPR独立于运动活动进行调节。值得注意的是，哺乳动物BTR也独立于运动活动调节。大鼠的消融研究表明，BTR通过特定的SCN神经元进行控制，这些神经元针对的是与控制运动活动14的神经元不同的亚参数区神经元。因此，我们的数据考虑了哺乳动物BTR和苍蝇TPR进化保存的可能性3，因为飞TPR和哺乳动物BTR都表现出昼夜时钟依赖温度的节奏，这是独立于运动运动活动的调节。
在这里，我们描述了如何分析 德罗索菲拉的TPR行为检测的细节。这种方法不仅可以研究TPR的分子机制和神经回路，还可以研究大脑如何整合不同的环境线索和内部生物钟。
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Protocol
1. 准备苍蝇
- 浅暗（LD）实验
- 在光12小时/暗12小时（LD）周期下，在孵化器中提高苍蝇（25°C/40-60%相对湿度（RH））。孵化器的光强度为 500-1，000 勒克斯。
- 在 24 小时内完成行为检测需要两个孵化器。两个孵化器都应具有具有开机功能的可编程光。它们还应有无法透射到光的实心门（即 没有玻璃或玻璃杯）。
注意：一个孵化器应指定为"日"孵化器，并设置为 LD 周期，12 小时光和 12 小时黑暗。第二个孵化器应指定为"夜间"孵化器，并设置为第一个孵化器的反向，12小时黑暗，然后是12小时光。夜间孵化器必须放置在黑暗中可访问的房间里，这样，体验夜间条件的苍蝇就可以轻松地进入实验。 - 将飞瓶放在白天或晚上的孵化器中。收集新孵化的苍蝇在一个新的小瓶，20-30每检测，并保持在同一孵化器2-3天。
- 2-3天后，使用苍蝇进行温度偏好行为检测。
- 对于日（泽格伯时间 （ZT） 0-12） 实验，从日孵化器收集苍蝇。
- 就在行为实验之前，将收集的飞瓶带出日间孵化器。
- 对于夜间（ZT 13-24）实验，从夜间孵化器收集苍蝇。
- 就在行为实验之前，将收集的飞瓶带出夜间孵化器，用铝箔包裹，放在暗室的一个盒子里，放在红灯下。
注意：由于夜间实验的温度偏好行为检测是在黑暗中进行的，所以必须防止对苍蝇的光线暴露，直到行为实验结束。
注意：在实验进行当天，苍蝇不应接触到二氧化碳。
- 恒定黑暗 （DD） 实验
-
DD日
- DD 日实验需要额外的孵化器，我们称之为手稿其余部分的"过渡"孵化器。过渡孵化器必须放置在黑暗中可访问的房间里，这样，体验DD条件的苍蝇就可以轻松访问进行实验。过渡孵化器的示例灯时间表将在下午 1 点到 7 点开灯，晚上 7 点到 1 点（图 1）关闭。
- 收集在日孵化器中饲养的苍蝇。当灯亮起时，在下午 1 点到 7 点之间将飞瓶放在过渡孵化器中。这样，苍蝇被正确地暴露在光线下，直到晚上7点，此时光线关闭。
- 第二天下午1点前，在黑暗条件下，将飞瓶从过渡孵化器中取出，用铝箔包裹，放在一个盒子里。将盒子放在任何孵化器中再放一天。
-
DD之夜
- 收集在暗黑中在夜孵化器中升起的苍蝇，在红灯下。或在夜间孵化器的灯光亮起时额外收集苍蝇。
- 只要灯熄灭，在黑暗中用铝箔包裹收集的小瓶，并将小瓶放在一个盒子里。将盒子放在任何孵化器中再放两天（图1B）。
注意：由于夜间实验的温度偏好行为检测是在黑暗中进行的，所以必须防止对苍蝇的光线暴露，直到行为实验结束。
-
DD日
- 恒光（LL）实验
-
LL 日
- LL日实验需要额外的孵化器。此孵化器保持LL条件（25°C，800勒克斯），并持续开灯。
- 收集在日培养箱中饲养的苍蝇。在其"白天"随时将飞瓶放在LL孵化器中。
-
LL 之夜
- 收集在夜间孵化器中饲养的苍蝇。在夜间孵化器的灯光打开期间，将飞瓶从夜间孵化器转移到LL孵化器。
注意：例如，夜间孵化器中的灯在上午 7 点关闭。早上 7 点前将飞瓶从夜间孵化器转移到 LL 孵化器，并将小瓶在 LL 孵化器中再保存 4 天。
注：在LL条件下的第4天，运动活动的振荡被废除15，16，而TPR仍然持续3。
- 收集在夜间孵化器中饲养的苍蝇。在夜间孵化器的灯光打开期间，将飞瓶从夜间孵化器转移到LL孵化器。
-
LL 日
2. 温度偏好行为测定装置
- 将玻璃杯盖（29 厘米 x 19.2 厘米）（图 4）放在铝板上。
- 监测板与盖之间的温度。六个温度探针在一条车道内盖内的不同位置连接（图2）。
注意：确保探针不接触铝板或玻璃杯盖。气温应设置为 18-32 °C 的梯度。 - 将设备放置在维持在 25 °C/65-75% RH 的环境室中。这个房间需要被封锁，远离任何外部光线。环境室通常配有风扇，以保持一定的温度和湿度。
注意：风扇的空气可能会干扰仪器上稳定的温度梯度。为了防止这种情况，我们使用透明纸张，覆盖仪器周围的区域。 - 准备温度计和催眠仪，检查环境室的温度和湿度。
注意：光影响 嗜血杆菌3的温度偏好。设备上应均匀提供相同强度的光。我们的环境室灯的强度是~800勒克斯。
注意：完成行为实验后，将从 CO2 罐连接的管子或电源放在仪器顶部孔附近，以便麻醉和清除苍蝇。
3. 准备使用设备
- 打开仪器至少30分钟，以便正确确定板表面的温度梯度（图3）。
- 将行为装置的盖子涂上防水剂，以防止苍蝇攀爬盖子的墙壁或天花板。擦去多余的防水剂，将盖子保持25-30分钟干燥。
- 去除铝板上的任何凝结物。将玻璃杯盖放在铝板上，用六个 C 夹子固定（图 2）。
注意：如果有必要，盖子密封良好是非常重要的。 - 将盖子保留至少 15 分钟。铝板和盖子之间的空气温度梯度为 18-32 °C。
4. 温度偏好行为测定
- 通过盖子每个车道中心的小孔（图 2 和 4）将苍蝇装载到铝板和仪器的玻璃盖之间的空间。用盖子遮盖孔，防止苍蝇逃跑。
- 对于黑暗的环境，关掉环境室的所有灯。当苍蝇被放入仪器时，可以使用红灯。在行为实验完成之前，确保苍蝇不会暴露在除红灯以外的任何灯光下。
- 对于每次试验，使用20-25只成年苍蝇，这些苍蝇不会在随后的试验中重复使用。行为检测执行 30 分钟。拍几张照片有或没有闪光灯。在实验过程中，要小心不要发出太大的噪音或任何突然的动作。
- 记录仪器上所有六个探针的温度。注意室温和湿度。
- 用二氧化碳气体麻醉仪器中的苍蝇，松开夹子，取下玻璃杯盖，将苍蝇从盘子中取出。每次实验后，苍蝇都会被丢弃。擦去盘子里的任何凝结物或水分。更换板上的盖子，用夹子拧紧，为下一个实验做准备。
- 为了代表全天的温度偏好，24 小时时段分为 8 个时区，白天 4 个时区，晚上 4 个时区。例如，我们使用这些 ZT 或 CT 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21 和 22-24。
注意：由于遮蔽效果引起的表型变化预计在开启 （ZT0） 或关闭 （ZT12） 之后立即发生，我们不检查这些时间的温度偏好行为（ZT 或 CT 0-1、11.5-13 和 23.5-24）。每个时区必须至少进行五次试验，以便结果在统计学上是合理的。
5. 数据分析
- 计算温度梯度如下：根据放置在沿边缘的玻璃盖顶部和底部的两个尺子（图 2A）确定温度探针的位置。
- 温度探针之间的温度梯度估计是线性的。根据温度探头的位置及其相应的记录温度，在图片的适当位置绘制代表每个温度的线条。计算位于每个度区间的苍蝇数量。不包括墙壁上的任何苍蝇或盖子的天花板。
- 计算每个车道每个温度范围内的苍蝇百分比。平均首选温度是通过计算每个间隔的苍蝇和温度百分比的产品计算的，如下所示：
百分比 的苍蝇 x 18.5 °C = 百分比的苍蝇 x 19.5 °C = 百分比的苍蝇 x 20.5 °C 。。 - 计算每个时区的平均首选温度：每个时区（ZT 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21 和 22-24）执行温度偏好行为>5 次。要计算每个时区的平均首选温度，每个试验的平均首选温度一起平均。s.e..m错误栏等于试验之间的错误。
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Representative Results
温度偏好节奏的示例显示在图5 中。如果行为程序成功，苍蝇应表现出TPR，在TPR中，它们更喜欢在早晨的低温和在晚上的较高温度。无论遗传背景如何，白天温度偏好的+1-1.5 °C增加应在白天观察到，因为我们显示，w1118、yw和广州 S 苍蝇在白天3中表现出类似的温度偏好。
图1。DD 日飞行准备的示意图。 （A） DD日间实验的示例。灯从下午1点到7点开，转机孵化器的灯从晚上7点到1点关闭。收集在日孵化器中饲养的苍蝇。在下午 1 点到 7 点之间将飞瓶放在过渡孵化器中。第二天下午1点前，在黑暗中将飞瓶从过渡孵化器中取出，用铝箔包裹，放在一个盒子里。（B） DD夜间实验的示例。收集在夜间孵化器中，早上 7 点到晚上 7 点或晚上 7 点到 7 点在灯光下升起的苍蝇。早上7点到晚上7点之间，在黑暗中将飞瓶从夜间孵化器中取出，用铝箔包裹，放在一个盒子里
图2。温度偏好行为装置。（A） 顶部视图。玻璃杯盖放置在铝板上，有六个 C 夹。在其中一条车道内盖内的不同位置，有六个温度探针。两个尺子被放置在丛盖的顶部和底部沿边缘，以确定温度梯度。（B）侧视图。四个Peltier装置放置在铝板下（44厘米 x 22 厘米）下方。每个 Peltier 设备都连接到产生冷或热温度的温度控制器。为防止Peltiers过热，计算机冷却系统连接到水管、空气冷却风扇和电源。温度探针嵌入铝板边缘，并连接到温度控制器，直接控制铝板上的温度。对于我们目前的设备，冷和热的侧面分别设置为12°C和36°C。
图3。仪器的图表。温度探针用作反馈控制，读取铝板上的温度。佩尔蒂埃设备连接到温度控制器。为了防止佩尔蒂埃过热，液体冷却器直接放置在佩尔蒂埃下面。四个液体冷却器通过水管连接到泵和散热器连接。散热器有两个风扇，可以冷却水的温度。泵和散热器连接到电源。
图4。丛盖的计划。这是用玻璃纤维做成的盖子的计划。盖有四条车道，除以三个 0.2 厘米厚的分隔线，每个车道（图 2A）顶部面板的中心有一个直径为 0.7厘米的孔。
图5。TPR 行为数据的示例。 W1118 的TPR飞行超过24小时。首选温度是利用温度偏好行为实验中苍蝇的分布来计算的。数据显示为每个时区的平均首选温度。数字表示检测次数。阿诺瓦， P < 0.0001.与 ZT1-3 相比，Tukey-Kramer 测试为 0.001，**P < < 0.01 或 *P < 0.05。TPR表型的这个图是改编自卡内科等人。3获得许可。
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Discussion
在这里，我们说明了温度偏好行为装置的细节和TPR行为分析。 德罗索菲拉 展示了时钟控制的 TPR 的突出、坚固和可重复的功能。然而，我们的数据表明，至少有两个因素，环境光和年龄，严重扰乱TPR行为表型。
我们观察到，光显著影响 德罗索菲拉的温度偏好。这与在LD中保存 的1118 只苍蝇比DD中的苍蝇更喜欢白天的温度更高，尽管在LD和DD3下，首选温度的有节奏变化仍然保持不变。因此，光会影响苍蝇的温度偏好，而不受昼夜时钟的影响。由于尚不清楚需要多少光强度以及调节这种光依赖温度偏好的机制，因此我们在实验期间使用相同的光强度（约 500-1，000 勒克斯）来获得可重复的结果。
苍蝇的年龄也会影响温度偏好。我们避免使用第 1 天苍蝇，因为第 1 天的 TPR 表型苍蝇（孵化后一天）是可变的。虽然第4天及以上的苍蝇表现出恒定的TPR行为，但它们更喜欢比2或3天大苍蝇更低的温度。因此，重要的是不要混合广泛的苍蝇。我们使用第2-3天苍蝇或第4-5天苍蝇组作为必要的。
在我们目前的 TPR 行为方法中，我们只检查温度偏好行为 30 分钟。原因是苍蝇在温度梯度上保持>1小时，倾向于降低温度。这可能是由于仪器中缺少食物和水。因此，我们每30分钟的行为实验后丢弃苍蝇。如果 TPR 行为可以连续测量至少 24 小时（理想情况下为 15 天），那将是一个巨大的优势。在这种情况下，TPR 行为检测将很容易完成，而无需将飞行小瓶转移到不同的孵化器。更重要的是，与其他昼夜行为（如运动活动）相比，TPR表型会更高效。
动物对环境的微小变化非常敏感。结果表明，苍蝇的温度偏好行为不仅受时钟调节，而且受到光的强烈影响。TPR 可能是一种行为输出，由所有环境线索和内部状态集成。 Drosophila 是一个复杂的模型系统，通过使用各种遗传工具、相对简单的大脑结构和多功能的行为检测来解剖大脑功能的基本机制。因此，研究温度偏好行为分析可以揭示大脑如何整合不同信息以产生最佳行为的基本机制。
此外，我们最近公布的数据表明，苍蝇TPR与哺乳动物BTR3共享功能。由于控制苍蝇睡眠的机制类似于控制哺乳动物睡眠17-20的机制，我们相信，进一步探索 果蝇 TPR将有助于更好地了解昼夜节律和睡眠行为。
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Disclosures
没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢阿拉文森·塞缪尔博士和马克·格肖博士帮助开发了行为装置的初始版本，马修·巴蒂博士修改了行为装置。这项研究得到了辛辛那提儿童医院、JST/PRESTO、迪姆斯和NIH R01 GM107582到F.N.H.的受托人格兰特的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright Lab Jr. Safelight | Amazon | #B00013J8UY | Red light for dark rooms |
| Rain X | SOPUS products | Water repellent: Apply the plexiglass cover | |
| C-Clamp | Home Depot | ||
| Temperature/hygrometer | Fisher | 15-077-963 | |
| Peltier devices | TE Technology, Inc. | HP-127-1.4-1.15-71P | |
| Thermometer | Fluke | Fluke 52II | |
| Bench top controller | Oven Industries | 5R6-570-15R and 5R6-570-24R | |
| Temperature sensor probe | Oven Industries | TR67-32 | |
| Generic 480 Watt ATX power supply | computer cooling system | ||
| MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir | Swiftech | computer cooling system | |
| MCP350 In-Line 12V DC pump | Swiftech | computer cooling system | |
| MCW50 graphics Card liquid cooler | Swiftech | computer cooling system | |
| Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan | Crazy PC | computer cooling system |
References
- Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
- Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
- Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
- Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
- Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B.
- Viswanath, V., et al.
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
- Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
- Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
- Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
- Crocker, A., Sehgal, A.
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
- Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).
