Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila

El objetivo general de este procedimiento es determinar la preferencia de temperatura de Drosophila. Esto se logra preparando primero las moscas y el aparato, que se ensambla alrededor de una base de aluminio con temperatura controlada. Una vez que se establecen las temperaturas en el aparato, se carga una cohorte de moscas y, después de media hora, se marca su preferencia de temperatura.

En última instancia, el ensayo se puede utilizar con una gran variedad de condiciones experimentales. Por ejemplo, los ritmos circadianos de la preferencia de temperatura. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de ritmos objetivo.

Dado que estos ritmos objetivo de preferencia de temperatura están controlados por mecanismos diferentes a los de la actividad locomotora, este ensayo de comportamiento conducirá a la identificación de nuevos mecanismos moleculares y celulares que no se identificaron previamente utilizando enfoques de actividad locomotora. Este método también puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sensorial, como la temperatura y la sensación de dolor. Debido a que estos ensayos de comportamiento de temperatura son muy sólidos, este ensayo nos permitirá mapear el circuito neuronal desde la detección de temperatura hasta el procesamiento, lo que nos permitirá obtener más información sobre la integración sensorial.

Cría las moscas en incubadoras humidificadas con un ciclo de luz y oscuridad 1212. Este protocolo requiere que dos incubadoras de este tipo estén configuradas en horarios opuestos. La incubadora nocturna debe estar oscura durante las horas normales de trabajo.

Cuando acceda a una incubadora durante su ciclo nocturno, use luz roja para iluminar la incubadora. Recoja cohortes de 20 a 30 moscas recién eclosionadas de ambos sexos y, en cualquier proporción, manténgalas en su incubadora durante dos o tres días antes de someterlas al ensayo. Se requieren al menos cinco cohortes para cada condición probada.

Para construir una cámara de prueba de preferencia de temperatura, una cubierta de plexiglás debe estar diseñada para adaptarse a una placa de aluminio debajo de la placa. Coloque cuatro dispositivos Peltier. Cada uno de los dispositivos peltier debe estar conectado a los controladores de temperatura que pueden generar temperaturas frías o calientes para evitar que los pelters se sobrecalienten.

Un sistema de enfriamiento de computadora está conectado a tubos de agua, ventiladores de enfriamiento de aire y fuentes de alimentación para monitorear las temperaturas en la placa de aluminio. Las sondas de temperatura están incrustadas en el borde de la placa de aluminio y están conectadas a controladores de temperatura. Coloque los lados frío y caliente del plato a 12 y 36 grados centígrados respectivamente en la tapa.

Coloque seis sondas de temperatura en varias posiciones dentro de uno de los carriles. Coloque el aparato en una habitación ambientalmente controlada a 25 grados centígrados y entre 65 y 75% de humedad relativa. Asegúrese de controlar estas condiciones.

La habitación debe tener control de luz y buena circulación de aire para evitar que el aire circulante desestabilice la temperatura. Gradiente Proteja el área de prueba con una cortina de ducha. Se debe utilizar una luz uniforme en el aparato porque la luminosidad puede influir en la preferencia de temperatura.

Encienda el aparato durante al menos 30 minutos. Con el fin de establecer un gradiente de temperatura estable en la superficie de la placa. Cubra la cubierta del aparato de comportamiento con un repelente de agua para evitar que las moscas trepen por las paredes o el techo de la cubierta.

Limpie el exceso de repelente de agua y deje la cubierta para conducir durante 25 a 30 minutos si es necesario, se puede usar cinta adhesiva doble media hora después. Limpie cualquier condensación de la placa de aluminio. A continuación, coloque la cubierta de plexiglás sobre la placa de aluminio y asegúrela con seis abrazaderas C.

Es muy importante que la tapa esté sellada. Controle bien la temperatura del aire entre la placa y la cubierta. Asegúrese de que las sondas no toquen la placa de aluminio ni la cubierta de plexiglás.

Deje que la tapa se equilibre en el plato durante al menos 15 minutos. Eventualmente, el gradiente de temperatura del aire entre la placa de aluminio y la cubierta oscilará entre 18 y 32 grados centígrados. En el caso de un experimento de comportamiento diurno, saque los viales de mosca de la incubadora diurna y pruebe el ensayo de comportamiento a la luz inmediatamente antes de un experimento de comportamiento nocturno. Saque los viales para moscas de la incubadora nocturna.

Envuélvalos en papel de aluminio y colóquelos en una caja en la habitación oscura debajo de una lámpara roja. Para los experimentos durante períodos de oscuridad, las luces de la habitación deben permanecer apagadas en todo momento hasta que se realicen los experimentos de comportamiento. Sin embargo, las lámparas rojas se pueden utilizar para la iluminación por aspiración.

Cargue de 20 a 25 moscas en el espacio entre la placa de aluminio. A continuación, cubra los agujeros con cubreobjetos para evitar que las moscas se escapen. Deja que las moscas se muevan durante 30 minutos.

Cuando se complete el experimento, tome al menos dos fotos para los experimentos de luz. Es necesario usar un flash para los experimentos oscuros. Compruebe la temperatura del aparato.

Tome nota de la temperatura ambiente, así como de la humedad para eliminar las moscas conectadas al tubo de dióxido de carbono cerca del orificio en la parte superior del aparato para anestesiar las moscas, deseche las moscas. No se deben volver a probar. A continuación, limpie la condensación o la humedad de la placa.

Vuelva a colocar la cubierta en la placa y apriétela con las abrazaderas en preparación Para el próximo experimento, calcule el gradiente de temperatura de la siguiente manera. Primero, determine dónde se colocan las sondas de temperatura usando una regla basada en las ubicaciones de las sondas y sus temperaturas registradas. Dibuja líneas rectas que representen cada grado de temperatura en la posición apropiada en la foto de la posición final de la mosca.

A continuación, cuente el número de moscas entre cada intervalo de un grado centígrado. Excluya cualquier mosca en las paredes o en el techo de la cubierta. Calcule el porcentaje de moscas en cada rango de temperatura de cada carril y luego la temperatura media preferida para cada condición.

Recopilar datos de al menos cinco ensayos. A continuación, utilice los valores medios de cada ensayo para determinar la temperatura media preferida con errores. Las moscas normales criadas a 25 grados centígrados, prefieren una temperatura más baja por la mañana que por la noche.

Se midió un aumento de uno a 1,5 grados en la preferencia de temperatura durante el día y de 1,5 a dos grados centígrados. Se observó una disminución en la transición del día a la noche. El ensayo también se puede utilizar para analizar moscas mutantes.

Por ejemplo, se encontró que la preferencia de temperatura de las moscas portadoras de una mutación defectuosa en el viaje, un canal de un ion, es mayor que la de los controles. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura. Este método permite investigar los mecanismos moleculares y los circuitos neurológicos, ofa y relojes, y cómo el cerebro integra las diferentes señales ambientales y en los relojes biológicos.