Name: Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a medir el ritmo de preferencia de temperatura en Drosophila con este ensayo conductual. Este método permite estudiar mecanismos circadianos independientes de la actividad locomotora en neurociencia.

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Estamos agradecidos a los Doctores Aravinthan Samuel y Marc Gershow que ayudaron a desarrollar la versión inicial del aparato conductual y a Matthew Batie que modificó el aparato conductual. Esta investigación fue apoyada por Trustee Grant del Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes y NIH R01 GM107582 a F.N.H.

1. Preparación de moscas
<ol><li>Experimentos de luz oscura (LD)
	<ol>
<li>Críe moscas en incubadoras (25 °C/40-60% de humedad relativa (RH)) bajo ciclos ligeros de 12 horas/oscuridad de 12 horas (LD). La intensidad de la luz de las incubadoras es de ~ 500-1,000 lux.</li>
		<li>Dos incubadoras son necesarias para completar los ensayos de comportamiento durante un período de 24 horas. Ambas incubadoras deben tener una luz programable con funciones ON OFF. También deben tener puertas sólidas que no sean permeables a la luz(es decir, sin vidrio o plexiglás). Nota: Una incubadora debe ser designada una incubadora de "día" y configurada a un ciclo de LD de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La segunda incubadora debe designarse como una incubadora "nocturna" y establecerse a la inversa de la primera con 12 horas de oscuridad seguida de luz de 12 horas. La incubadora nocturna debe colocarse en la habitación que es accesible en la oscuridad, de tal manera que las moscas que experimentan condiciones nocturnas pueden ser fácilmente accesibles para los experimentos.</li>
		<li>Coloque los viales de mosca en incubadoras de día o de noche. Recoger las moscas recién eclosionadas en un vial fresco, 20-30 por ensayo y mantener en la misma incubadora durante 2-3 días.</li>
		<li>Después de 2-3 días, use moscas para el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura.<ol>
<li>Para los experimentos del día (tiempo de Zeitgeber (ZT) 0-12), recoja las moscas de la incubadora del día.</li>
			<li>Justo antes de los experimentos de comportamiento, saque los viales de mosca recogidos de la incubadora de día.</li>
			<li>Para experimentos nocturnos (ZT 13-24), recoja las moscas de la incubadora nocturna.</li>
			<li>Justo antes de los experimentos de comportamiento, saque los viales de mosca recogidos de la incubadora nocturna, envuelva con papel de aluminio y colóquelos en una caja en la habitación oscura debajo de una lámpara roja. Nota: Dado que el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura se realiza bajo oscuridad para los experimentos nocturnos, la exposición a la luz a las moscas debe prevenirse hasta el final de los experimentos de comportamiento. Nota: Las moscas no deben estar expuestas al dióxido de carbono el día en que se lleven a cabo los experimentos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de oscuridad constante (DD)
	<ol>
<li>
Día DD
		<ol>
<li>Una incubadora adicional es necesaria para los experimentos de dd day, a la que nos referimos como una incubadora de "transición" para el resto del manuscrito. La incubadora de transición debe colocarse en la habitación que es accesible en la oscuridad, de tal manera que las moscas que experimentan condiciones de DD se puede acceder fácilmente para los experimentos. Un programa de luz de ejemplo para una incubadora de transición tendría la luz encendía de 1 pm a 7 pm y la luz apagada a las 7 pm-1 pm (Figura 1).</li>
			<li>Recoger las moscas que se han criado en la incubadora de día. Coloque los viales de mosca en la incubadora de transición entre la 1 pm y las 7 pm, cuando la luz esté encendda. De esta manera, las moscas están adecuadamente expuestas a la luz hasta las 7 pm, momento en el que la luz se apaga.</li>
			<li>Al día siguiente, antes de la 1 pm, en condiciones oscuras, saque los viales de mosca de la incubadora de transición, envuélvalos con papel de aluminio y colóquelos en una caja. Mantenga la caja en cualquier incubadora durante un día más.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
DD Noche
		<ol>
<li>Recoger las moscas que se han criado en la incubadora nocturna en la oscuridad bajo una lámpara roja. O, además, recoger las moscas cuando la luz de la incubadora nocturna está encendía.</li>
			<li>Envuelva los viales recogidos con papel de aluminio en la oscuridad en cualquier momento que las luces estén apagadas y coloque los viales en una caja. Mantenga la caja en cualquier incubadora durante dos días más (Figura 1B). Nota: Dado que el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura se realiza bajo oscuridad para los experimentos nocturnos, la exposición a la luz a las moscas debe prevenirse hasta el final de los experimentos de comportamiento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de luz constante (LL)
	<ol>
<li>
Día ll
		<ol>
<li>Una incubadora adicional es necesaria para los experimentos del día ll. Esta incubadora mantiene la condición LL (25 °C, 800 lux), con la luz encendía continuamente.</li>
			<li>Recoger las moscas que se han criado en la incubadora de día. Coloque los viales de mosca en la incubadora LL en cualquier momento durante su "día".</li>
		</ol>
</li>
		<li>
LL Noche
		<ol>
<li>Recoger las moscas que se han criado en la incubadora nocturna. Transfiera los viales de mosca de la incubadora nocturna a la incubadora LL durante el tiempo que la luz en la incubadora nocturna esté encendida. Nota: Por ejemplo, la luz se apaga a las 7 am en la incubadora nocturna. Transfiera los viales de mosca de la incubadora nocturna a la incubadora LL antes de las 7 am y mantenga los viales en la incubadora LL durante 4 días más. Nota: Al día 4 en condiciones LL, se suprime la oscilación de la actividad locomotora15,16,mientras que el TPR se mantiene aún 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. El aparato para el ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura
<ol><li>Colocar una cubierta de plexiglás (29 cm x 19,2 cm)(Figura 4)sobre una placa de aluminio.</li>
	<li>Controle la temperatura del aire entre la placa y la cubierta. Seis sondas de temperatura están conectadas en varias posiciones en el interior de la cubierta dentro de uno de los carriles (Figura 2). Nota: Asegúrese de que las sondas no toquen la placa de aluminio ni la cubierta de plexiglás. La temperatura del aire debe establecerse en un gradiente de 18-32 °C.</li>
	<li>Coloque el aparato en una sala ambiental mantenida a 25 °C/65-75% HR. Esta habitación necesita ser sellada de cualquier luz exterior. Una sala ambiental normalmente está equipada con ventiladores para mantener una cierta temperatura y humedad. Nota: El aire del ventilador probablemente perturba un gradiente de temperatura estable en el aparato. Para evitar esto, utilizamos una lámina transparente que cubre el área que rodea el aparato.</li>
	<li>Prepare un termómetro e higrómetro para comprobar la temperatura y la humedad en la sala ambiental. Nota: La luz influye en la preferencia de temperatura de Drosophila3. La misma intensidad de luz debe suministrarse en el aparato de manera uniforme. La intensidad de las luces ambientales de nuestra habitación es de ~ 800 lux. Nota: Cuando se realicen los experimentos de comportamiento, coloque un tubo conectado desde el tanque de CO2 o suministre cerca del orificio de la parte superior del aparato para anestesiar y deshacerse de las moscas.</li>
</ol>3. Preparación de aparatos para uso
<ol><li>Encienda el aparato durante al menos 30 minutos para establecer el gradiente de temperatura correctamente en la superficie de la placa (Figura 3).</li>
	<li>Cubra la cubierta del aparato de comportamiento con repelente al agua para evitar que las moscas trepe por las paredes o el techo de la cubierta. Limpie el exceso de repelente al agua y deje la cubierta durante 25-30 minutos para secar.</li>
	<li>Retire cualquier condensación en la placa de aluminio. Coloque la cubierta de plexiglás sobre la placa de aluminio y asegure con seis abrazaderas en C(Figura 2). Nota: Es muy importante que la cubierta esté bien sellada, si es necesario se puede utilizar cinta adhesiva doble.</li>
	<li>Deje la cubierta durante al menos 15 min. El gradiente de temperatura del aire entre la placa de aluminio y la cubierta se crea a partir de 18-32 °C.</li>
</ol>4. Ensayo de comportamiento de preferencia de temperatura
<ol><li>Cargue las moscas en el espacio entre la placa de aluminio y la cubierta de plexiglás del aparato a través de pequeños agujeros en el centro de cada carril de la cubierta (Figuras 2 y 4). Cubra los agujeros con resbalones de cubierta para evitar que las moscas escapen.</li>
	<li>Para las condiciones de oscuridad, apague todas las luces de la sala ambiental. Se puede utilizar una lámpara roja cuando las moscas se colocan en el aparato. Asegúrese de que las moscas no estén expuestas a ninguna luz excepto a una lámpara roja hasta que se realicen los experimentos de comportamiento.</li>
	<li>Para cada ensayo, use de 20 a 25 moscas adultas, que no deben reutilizarse en ensayos posteriores. El ensayo de comportamiento se realiza durante 30 min. Tome algunas fotos con o sin flash. Tenga cuidado de no hacer mucho ruido o cualquier movimiento repentino durante los experimentos.</li>
	<li>Registre la temperatura de las seis sondas del aparato. Tome nota de la temperatura ambiente, así como la humedad.</li>
	<li>Anestesiar las moscas en el aparato con gas de dióxido de carbono, aflojar las abrazaderas, quitar la cubierta de plexiglás, y quitar las moscas de la placa. Después de cada experimento, las moscas se desechan. Limpie cualquier condensación o humedad de la placa. Substituya la tapa de la placa y apriete con las abrazaderas en preparación para el próximo experimento.</li>
	<li>Para tener una representación de la preferencia de temperatura a lo largo de todo el día, el período de 24 horas se divide en ocho zonas horarias, cuatro durante el día y cuatro por la noche. Por ejemplo, usamos estos ZT o CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 y 22-24. Nota: Dado que las variaciones de fenotipo causadas por los efectos de enmascaramiento se esperan justo después de que la luz se enciende (ZT0) o apagado (ZT12), no examinamos el comportamiento de preferencia de temperatura durante estos tiempos (ZT o CT 0-1, 11.5-13 y 23.5-24). Se deben realizar al menos cinco ensayos en cada zona horaria para que los resultados sean estadísticamente sólidos.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Calcule el gradiente de temperatura de la siguiente manera: Determine dónde se colocan las sondas de temperatura en función de las dos reglas que se colocan en el lado superior e inferior de la cubierta de plexiglás a lo largo de los bordes (Figura 2A).</li>
	<li>Se estima que el gradiente de temperatura entre las sondas de temperatura es lineal. Basándose en las ubicaciones de las sondas de temperatura, así como sus correspondientes temperaturas registradas, dibuje líneas que representen cada grado de temperatura en la posición adecuada en las imágenes. Cuente el número de moscas ubicadas en cada intervalo de grados. Excluir cualquier mosca en las paredes o el techo de la cubierta.</li>
	<li>Calcula el porcentaje de moscas en cada rango de temperatura de cada carril. Una temperatura media preferida se calcula sumando los productos del porcentaje de moscas y temperatura de cada intervalo, como se muestra a continuación: % de moscas x 18,5 °C + % de moscas x 19,5 °C + % de moscas x 20,5 °C ....+ % de moscas x 31,5 °C + % de moscas x 32,5 °C.</li>
	<li>Calcular la temperatura media preferida en cada zona horaria: el comportamiento de preferencia de temperatura se realiza >5 veces durante cada zona horaria (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 y 22-24). Para calcular la temperatura media preferida en cada zona horaria, la temperatura media preferida de cada ensayo se promedia en conjunto. Las barras de error s.e.m. son iguales al error entre las pruebas.</li>
</ol>

<ol><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li>
<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li>
<li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li>
<li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li>
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<li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li>
<li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Thermal+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Therm.+Biol%22%5BJournal%5D)">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li>
<li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li>
<li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+rhythm+of+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li>
<li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li>
<li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li>
<li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li>
<li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li>
</ol>

No hay nada que revelar.

Aquí, ilustramos los detalles del aparato de comportamiento de preferencia de temperatura y el análisis del comportamiento de TPR. Drosophila exhiben las características salientes, robustas, y reproducibles de TPR reloj-controlado. Sin embargo, nuestros datos sugieren que por lo menos dos factores, luz ambiente y edad, disturben perceptiblemente los fenotipos del comportamiento de TPR.
Observamos que la luz afecta significativamente la preferencia de temperatura en Drosophila.</em...

La temperatura es una señal ambiental ubicua. Los animales exhiben una variedad de comportamientos con el fin de evitar temperaturas dañinas y buscar temperaturas cómodas. Drosophila exhibe un comportamiento robusto de la preferencia de la temperatura6,7. Cuando las moscas se liberan en un gradiente de temperatura de 18-32 °C, las moscas evitan las temperaturas cálidas y frías y finalmente eligen una temperatura preferida de 25 °C por la mañana3. Los sensores de temperatura cálida son un conjunto de neuronas termosensoriales, neuronas AC, que expresan el potencial del receptor transitorio de Drosophila (TPR) canal, TRPA16,9. Los sensores de temperatura fría están situados en los segmentos de la 3ª antena, ya que la ablación de los segmentos de la 3ª antena provoca la falta de evitación de la temperatura fría6. Recientemente, se identificó la proteína TRPP Brivido (Brv)10. Dado que Brv se expresa en los segmentos de la 3ª antena y media la detección de frío, Brv es una posible molécula de detección de frío, que es crítica para el comportamiento de preferencia de temperatura. En resumen, las moscas utilizan estos dos sensores de temperatura para evitar las temperaturas cálidas y frías y encontrar una temperatura preferida.
Mientras que los mamíferos generan calor para regular su temperatura corporal, los ectotermos generalmente adaptan su temperatura corporal a la temperatura ambiente11. Algunos ectotherms se saben para exhibir un comportamiento diario de TPR que se cree para ser una estrategia para que los ectotherms regulen su BTR12. Para determinar si las moscas exhibieron TPR, repetimos el análisis del comportamiento de la preferencia de la temperatura en los varios puntos durante un palmo de 24 horas. Encontramos que Drosophila exhibe un TPR diario, que es bajo por la mañana y alto por la noche y sigue un patrón similar al de BTR en humanos13.
En Drosophila,hay ~ 150 neuronas del reloj en el cerebro. Las neuronas del reloj que regulan la actividad locomotriz se llaman osciladores M y E. Sin embargo, curiosamente, los osciladores M y E no regulan la TPR, en su lugar, mostramos que las neuronas de reloj DN2 en el cerebro regulan la TPR pero no la actividad locomotriz. Estos datos indican que TPR está regulado independientemente de actividad locomotriz. Notablemente, el BTR de mamíferos también está regulado independientemente de la actividad locomotriz. Los estudios de ablación en ratas muestran que la BTR se controla a través de neuronas SCN específicas que se dirigen a un subconjunto diferente de neuronas de la zona subparaventricular que las que controlan la actividad locomotriz14. Por lo tanto, nuestros datos consideran la posibilidad de que el BTR mamífero y la mosca TPR se conservan evolutivamente3, ya que tanto la mosca TPR y mamífero BTR exhiben ritmos de temperatura circadianos dependientes del reloj, que se regulan independientemente de la actividad locomotora.
Aquí, describimos los detalles de cómo analizar el ensayo de comportamiento TPR en Drosophila. Este método permite la investigación no sólo del mecanismo molecular y los circuitos neuronales de TPR, sino también de cómo el cerebro integra diversas señales ambientales y relojes biológicos internos.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>Luz roja para habitaciones oscuras</td></tr><tr><td>Productos</td><td></td><td>Rain X SOPUS</td><td>Repelente al agua: Aplique la cubierta de plexiglás</td></tr><tr><td>C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura/higrómetro</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos Peltier</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Fluke</td><td>Fluke 52II</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de sobremesa</td><td>Oven Industries</td><td>5R6-570-15R y 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de sensor de temperatura</td><td>Oven Industries</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>Genérico 480 vatios Fuente de</td><td></td><td></td> alimentación ATX sistema de <td>refrigeración para ordenador</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES Radiador doble de 120 mm con depósito&nbsp;</td><td>Sistema de enfriamiento de computadora</td> <td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de CC en línea MCP350 de 12 V Sistema de enfriamiento de</td><td>computadora</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador líquido de tarjeta gráfica MCW50</td><td>Sistema de enfriamiento de computadora</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Guadaña Kaze-Jyuni Ventilador de SY1225SL12SH</td> Crazy <td>Sistema de enfriamiento de computadora</td> <td>PC</td><td></td></tr></tbody></table> loco

diseño y análisis del comportamiento de preferencia de temperatura y su ritmo circadiano en drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

El reloj circadiano regula muchos aspectos de la vida, incluyendo el sueño, la actividad locomotriz y los ritmos de temperatura corporal (BTR)1,2. Recientemente hemos identificado una nueva producción circadiana de Drosophila, llamada ritmo de preferencia de temperatura (TPR), en la que la temperatura preferida en moscas sube durante el día y desciende durante la noche 3. Sorprendentemente, la TPR y la actividad locomotriz se controlan a través de distintas neuronas circadianas3. La actividad locomotriz de Drosophila es una salida de comportamiento circadiana bien conocida y ha proporcionado fuertes contribuciones al descubrimiento de muchos genes y mecanismos conservados del reloj circadiano de mamíferos4. Por lo tanto, la comprensión de TPR llevará a la identificación de mecanismos circadianos moleculares y celulares hasta ahora desconocidos. Aquí, describimos cómo realizar y analizar el ensayo TPR. Esta técnica no solo permite diseccionar los mecanismos moleculares y neuronales de la TPR, sino que también proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos fundamentales de las funciones cerebrales que integran diferentes señales ambientales y regulan los comportamientos de los animales. Además, nuestros datos publicados recientemente sugieren que la mosca TPR comparte características con el mamífero BTR3. Drosophila son ectotherms, en los cuales la temperatura del cuerpo se regula típicamente comportamiento. Por lo tanto, TPR es una estrategia utilizada para generar una temperatura corporal rítmica en estas moscas5-8. Creemos que la exploración adicional de Drosophila TPR facilitará la caracterización de los mecanismos subyacentes al control de la temperatura corporal en animales.

Un ejemplo del ritmo de preferencia de temperatura se muestra en la Figura 5. Si el procedimiento de comportamiento se realiza con éxito, las moscas deben exhibir un TPR en el que prefieren una temperatura baja por la mañana y una temperatura más alta por la noche. El aumento de ~ 1-1.5 ° C durante el día en la preferencia de temperatura debe observarse durante el transcurso del día, independientemente del fondo genético, ya que mostramos que w1118, yw y canton S mos...

Recientemente se identificó una nueva producción circadiana de Drosophila, ritmo de preferencia de temperatura (TPR), en el que la temperatura preferida en moscas se eleva durante el día y cae durante la noche. TPR se regula independientemente de otra salida circadiana, actividad locomotriz. Aquí describimos el diseño y análisis de TPR en Drosophila.

Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la preferencia de temperatura de drosófila. Esto se logra primero preparando las moscas y el aparato, que se monta alrededor de una base de aluminio con control de temperatura. Una vez establecidas las temperaturas en el aparato, se introduce un grupo de moscas y, después de media hora, se registra su preferencia térmica.En última instancia, el ensayo puede utilizarse con una gran variedad de condiciones experimentales. Por ejemplo, los ritmos circadianos de preferencia de temperatura. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de los ritmos objetivo.Dado que estos ritmos objetivo de preferencia de temperatura están controlados por mecanismos diferentes a los de la actividad locomotora, este ensayo de comportamiento permitirá identificar nuevos mecanismos moleculares y celulares que no se habían identificado previamente mediante enfoques de actividad locomotora. Este método también puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sensorial, como la sensación de temperatura y dolor. Debido a que estos ensayos de comportamiento térmico son muy robustos, el ensayo nos permitirá trazar el circuito neuronal desde la detección hasta el procesamiento de la temperatura, lo que nos brindará mayor comprensión sobre la integración sensorial.Criar las moscas en incubadoras humedecidas con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Este protocolo requiere dos incubadoras configuradas con horarios opuestos. La incubadora nocturna debe permanecer oscura durante el horario laboral habitual.Al acceder a una incubadora durante su ciclo nocturno, utilice luz roja para iluminarla. Recolecte cohortes de 20 a 30 moscas recién eclosionadas de cualquier sexo y en cualquier proporción, y manténgalas dentro de la incubadora durante dos o tres días antes de utilizarlas en el ensayo. Se requieren al menos cinco cohortes para cada condición evaluada.Para construir una cámara de prueba de preferencia térmica, se debe diseñar una cubierta de plexiglás que encaje debajo de una placa de aluminio. Coloque cuatro dispositivos Peltier. Cada uno de los dispositivos Peltier debe conectarse a controladores de temperatura que puedan generar temperaturas frías o calientes para evitar que los Peltier se sobrecalienten.Un sistema de refrigeración de computadora está conectado a tubos de agua, ventiladores de enfriamiento de aire y fuentes de alimentación para monitorear las temperaturas en la placa de aluminio. Las sondas de temperatura están incrustadas en el borde de la placa de aluminio y están conectadas a controladores de temperatura. Configure los lados frío y caliente de la placa a 12 y 36 grados Celsius, respectivamente, en la tapa.Coloque seis sondas de temperatura en diversas posiciones dentro de uno de los carriles. Coloque el aparato en una habitación con condiciones ambientales controladas a 25 grados Celsius y entre 65 y 75 % de humedad relativa. Asegúrese de monitorear estas condiciones.La habitación debe tener control de luz y una buena circulación de aire para evitar que el aire circulante desestabilice la temperatura. Aísle el área de prueba con una cortina de ducha para protegerla del gradiente térmico. Se debe utilizar una luz uniforme en el aparato porque la luminosidad puede influir en la preferencia de temperatura.Encienda el aparato durante al menos 30 minutos, con el fin de establecer un gradiente de temperatura estable en la superficie de la placa. Cubra la tapa del aparato de comportamiento con un agente hidrorrepelente para evitar que las moscas trepen por las paredes o el techo de la tapa.Limpie el exceso de repelente de agua y deje que la tapa se seque durante 25 a 30 minutos; si es necesario, puede utilizarse cinta adhesiva doble cara media hora después. Elimine cualquier condensación presente en la placa de aluminio. Luego coloque la tapa de plexiglás sobre la placa de aluminio y sujétela con seis abrazaderas en forma de C.Es muy importante que la tapa esté sellada. Monitorearemos la temperatura del aire entre la placa y la tapa. Asegúrese de que las sondas no toquen ni la placa de aluminio ni la tapa de plexiglás.Deje que la tapa se equilibre sobre la placa durante al menos 15 minutos. Eventualmente, el gradiente de temperatura entre la placa de aluminio y la tapa oscilará entre 18 y 32 grados Celsius. En el caso de un experimento conductual diurno, retire los viales de moscas del incubador diurno y realice el ensayo conductual a la luz inmediatamente antes de un experimento conductual nocturno. Saque los viales de moscas del incubador nocturno.Envuélvalos en papel de aluminio y colóquelos en una caja en la habitación oscura bajo una lámpara roja. Para experimentos durante los períodos oscuros, las luces de la habitación deben permanecer apagadas en todo momento hasta que finalicen los experimentos de comportamiento. Sin embargo, se pueden utilizar lámparas rojas para la iluminación mediante aspiración.Cargue de 20 a 25 moscas en el espacio entre la placa de aluminio. Luego cubra los orificios con laminillas para evitar que las moscas escapen. Permita que las moscas se muevan durante 30 minutos.Una vez finalizado el experimento, tome al menos dos fotografías para los experimentos con luz. Es necesario utilizar un flash para los experimentos en la oscuridad. Verifique la temperatura del aparato.Tome nota de la temperatura ambiente y la humedad para eliminar las moscas conectando el tubo de dióxido de carbono cerca del orificio en la parte superior del aparato para anestesiar a las moscas; deseche las moscas. No deben volverse a probar. A continuación, limpie cualquier condensación o humedad del plato.Sustituya la tapa en la placa y apriete con las abrazaderas en preparación. Para el siguiente experimento, calcule el gradiente de temperatura de la siguiente manera. Primero, determine la ubicación de los sensores de temperatura utilizando una regla, basándose en las posiciones de los sensores y sus temperaturas registradas. Dibuje líneas rectas que representen cada grado de temperatura en la posición adecuada sobre la foto de la posición final de la mosca.A continuación, cuente el número de moscas en cada intervalo de un grado Celsius. Excluya cualquier mosca que se encuentre en las paredes o en el techo de la cubierta. Calcule el porcentaje de moscas en cada rango de temperatura de cada carril y luego la temperatura preferida media para cada condición.Recopile datos de al menos cinco ensayos. Luego utilice los valores medios de cada ensayo para determinar la temperatura preferida promedio con sus errores. Las moscas normales criadas a 25 grados Celsius prefieren una temperatura más baja por la mañana que por la tarde.Se midió un aumento de uno a 1,5 grados en la preferencia de temperatura durante el día, y se observó una disminución de 1,5 a dos grados Celsius en la transición de día a noche. El ensayo también puede utilizarse para probar moscas mutantes.Por ejemplo, se descubrió que la preferencia de temperatura de moscas portadoras de una mutación defectuosa en el gen trip, un canal iónico, es mayor que la de los controles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo de comportamiento de preferencia térmica. Este método permite investigar los mecanismos moleculares y los circuitos neuronales, dea y relojes, y cómo el cerebro integra las diferentes señales ambientales en los relojes biológicos.

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Research

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