Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

Resumen

Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.

Resumen

El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta poderosa para la expresión de proteínas recombinantes. Aquí lo utilizamos para producir versiones correctamente plegadas y glicosilados de la influenza A virus glicoproteínas de superficie - la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). A modo de ejemplo, hemos elegido las proteínas HA y NA expresadas por el nuevo virus H7N9 que emergió recientemente en China. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para las proteínas HA y NA expresadas por cualquier otro de la gripe A y B cepas de virus. Proteínas recombinantes HA (rHA) y NA (ARN) son reactivos importantes para ensayos inmunológicos tales como ELISPOT y ELISA, y también son de uso generalizado para la normalización de la vacuna, el descubrimiento de anticuerpos, el aislamiento y la caracterización. Además, las moléculas de NA recombinantes pueden usarse para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas y son útiles para la caracterización de la función enzimática de la AN, así como su sensibilidad a los antivirales. Proteínas HA recombinantes también son being probado como vacunas experimentales en modelos animales, y una vacuna basada en HA recombinante fue autorizado recientemente por la FDA para su uso en seres humanos. El método como se describe aquí para producir estas moléculas es sencillo y puede facilitar la investigación en laboratorios de la gripe, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteínas rápidas y a un bajo costo. Aunque aquí nos centramos en las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe, este método también puede ser usado para producir otras proteínas de superficie virales y celulares.

Introducción

Como primera respuesta a la reciente aparición de la nueva cepa del virus de la influenza H7N9 en China, adquirimos plásmidos portadores de las secuencias genómicas de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) genes de los dos primeros aislamientos. El uso de estos plásmidos que pudimos construir rápidamente los vectores de expresión de baculovirus para la producción de HA y NA recombinante en células de insecto. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y ha demostrado ser fundamental para muchos de nuestros proyectos de investigación en curso ^1-8. Las células de insectos son capaces de doblar correctamente y después de la traducción modificar proteínas complejas. Estas modificaciones incluyen la glicosilación ligada a N, lo cual es importante para muchas glicoproteínas virales. Como tal, no es sorprendente que el sistema de baculovirus es bastante establecido para la expresión de antígenos de superficie del virus de la gripe. De hecho, muchas de las estructuras cristalinas de HA y NA han sido resueltos utilizando proteínas de las células de insectos expresado ^9-11. Otra ventaja de lasistema se encuentra en sus rendimientos fiables de alto valor proteico de hasta 30 mg de cultivo celular HA / L (en base a nuestra experiencia con más de 50 diferentes proteínas HA) - Una consecuencia de la expresión dirigida por virus la infección por el fuerte promotor de la polihedrina.

La eliminación de la transmembrana y endodominio de las proteínas HA y NA permite la expresión de versiones secretables, solubles de las proteínas y por lo tanto facilita en gran medida el proceso de purificación. Además, estos ectodominios se hexahistidina etiquetados y por lo tanto se pueden purificar utilizando cromatografía de afinidad utilizando Ni ^{2 +-resina.} Los dominios transmembrana de las proteínas HA y NA contribuyen a la formación de homotrímero y homotetrámero, respectivamente. Con el fin de preservar estas oligomerizaciones, se añade un dominio de trimerización C-terminal para el HA-, y un tetramerización dominio N-terminal a la AN construcciones (Figura 1). Hemos demostrado de manera concluyente que tal dominio de trimerización estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionales en el tallo en el dominio de HA ^1. El tetramerización correcta de la NA también podría contribuir a corregir el plegado y la función NA ^10. Secuencias y vectores de baculovirus de transferencia de albergar dominios de trimerización o tetramerización pueden solicitarse a los autores o de otros laboratorios en el ^{campo, 9,10,12.}

Otra cuestión importante para la expresión de proteínas secretadas en células de insecto es la elección de la línea celular de la derecha. Mientras Spodoptera frugiperda deriva células Sf9 soportan la replicación de baculovirus muy bien y se utilizan generalmente para el rescate y la propagación del virus, que tienen una capacidad de secretar grandes cantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni deriva BTI-TN-5B1-4 células (comúnmente conocidos como High Five) tener una capacidad mayor secreción y son la línea celular de elección para la expresión en este protocolo ^13,14. Además, es útil para reducir o incluso eliminar el suero bovino fetal (FBS) a partir de cultivos de expresión. Por lo tanto, utilizamos los medios de comunicación con reducida (3%) Contenido de FBS para el crecimiento de las reservas de trabajo de virus, y llevamos a cabo la expresión de proteínas en medio libre de suero.

Proteínas HA y NA recombinantes se utilizan para muchas técnicas inmunológicas. Tal vez la más común se encuentra en ensayos de ELISA para medir la seroconversión tras la vacunación en humanos o animales ^4,6,7,15. HAs y NAS también se utilizan en ensayos de ELISPOT como ambas moléculas estimuladoras y reactivos de detección de células secretoras de anticuerpos ^16. Su uso como cebos moleculares permite ordenar específicamente para plasmablasts u otros tipos de células B, que luego se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales (terapéuticos) (mAbs). Recombinantes HA y NA moléculas son más utilizados en la caracterización de estos mAb ^8. Otros ejemplos incluyen el estudio de la estabilidad del pH o de la especificidad del receptor de ha expresado por diferentes cepas de virus, o cuantitativamente evaluar enzimática específica NAla actividad o la resistencia a los inhibidores. Además, recombinante, purificada de HA se puede utilizar para normalizar el contenido de HA de las vacunas de virus de la gripe inactivados.

Es importante destacar que rHA (y hasta cierto punto NA) vacunas candidatas están actualmente en evaluación en modelos animales y ensayos clínicos en humanos con una vacuna candidata está autorizada por la FDA en 2013 ^2,17-19. La ventaja de estas nuevas vacunas es que, debido a la naturaleza recombinante de estas proteínas, el proceso de trabajo intensivo de generación de virus de genomas reordenados de alto crecimiento podría ser evitado. Quizás aún más importante es el hecho de que su rendimiento HA es alta y reproducible de cepa a cepa. También, ya que estas vacunas se producen en un sistema libre de huevo, que no contienen contaminantes proteicos que son problemáticos para individuos con alergia al huevo.

Aquí hemos elegido para expresar las proteínas HA y NA de dos aislamientos del nuevo virus de influenza H7N9 Chino, A / Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 ^20,21. Estos son ejemplos oportunos, pero el protocolo descrito se pueden utilizar para la expresión de cualquier gripe A y B proteínas HA o NA y se pueden adaptar para expresar cualquier otras proteínas virales o celulares secretadas. Proteínas transmembrana trimérica o tetraméricas pueden ser clonados en los casetes de expresión utilizados para la HA y NA, respectivamente. Sin embargo, las proteínas celulares secretadas más solubles, como los interferones, por ejemplo, no es necesario un dominio adicional para la estabilización y se pueden expresar únicamente con una etiqueta de hexahistidina C-terminal.

Protocolo

1. Generación de baculovirus recombinante

1. Clonación en transferencia de plásmidos de baculovirus
   1. Clon H7 HA y NA N9 ectodominio (o cualquier otro gen HA o NA) en plásmidos de transferencia pFastBac modificados (véase la introducción). Vectores para HA que contiene un dominio de trimerización C-terminal y una etiqueta de hexahistidina, así como para NA que contiene un dominio de tetramerización N-terminal y la etiqueta de hexahistidina, se han descrito ^1,10,11,22 (Figura 1) y pueden ser solicitada desde los autores.
      Nota explicativa: ectodominios HA expresadas sin un dominio de trimerización se pliegan de forma incorrecta, lo que lleva a la pérdida de epítopos neutralizantes conformacionales, especialmente en el dominio de tallo. Del mismo modo, la función enzimática de NA se basa en tetramerización adecuada.
   2. Generación de bácmidos
      Transformar de transferencia de baculovirus-plásmidos que contienen los genes HA y NA en bacterias DH10Bac de acuerdo con una de expresión de baculovirussistema según las instrucciones del fabricante. Aislar y purificar bácmidos utilizando un kit Midiprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2).
2. Rescate de baculovirus recombinante y la verificación de la expresión de proteínas
   Nota explicativa: Los siguientes pasos se deben realizar de forma aséptica en una campana de flujo laminar. Realice este procedimiento independiente para HA y NA (o cualquier otro gen de interés). Las células de insecto son generalmente cultivadas a 28 ° C sin CO _2. Células Sf9 para este protocolo se cultivan en medios completos de células de insecto TNM-FH suplementado con 10% de FBS, 1% de Pen-Strep ^* y solución Pluronic F68 0,1%, si no se indica lo contrario, y se pasaron 1:04 dos veces a la semana. Células High Five se cultivan en suero libre de los medios de comunicación SFX y se pasaron 1:15 dos veces a la semana.
   ^* La adición de antibióticos debe ser considerada opcional en todo el protocolo y ajustarse de acuerdo con las prácticas utilizadas en cada laboratorio.
   1. Placa células de insecto Sf9 en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10 ⁵ células / cm ² y deje reposar durante 20 minutos en una incubadora de 28 ° C (sin CO _2).
   2. Mezcle 2 g (concentración 0,5-2 mg / l) de bácmido recombinante con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, 1% Pen-Strep). Mezclar 6 l de agente de transfección con 100 l de medio TNM-FH (sin suero, Pen-Strep). Combinar los dos volúmenes, mezclar suavemente y dejar reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente (mezcla de transfección). Incluya una maqueta de transfección como control (Figura 3).
   3. Aspirar el sobrenadante de las células Sf9 chapados (células serán ahora se adhieren a la placa) y reemplazar con 2 ml de medio TNM-FH libre de suero que contenía Pen-Strep (1%). Añadir el volumen total de la mezcla de transfección (del paso 1.2.2) y el rock de la placa de 6 pocillos cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO ₂ durante 6 horas (Figura 3).
   4. Reemplace wi mediosmedios th frescas completo TNM-FH (que contienen 10% de FBS, 1% de Pen-Strep y 0,1% de Pluronic F68). Incubar en una incubadora de 28 ° C sin CO ₂ durante 6 días. Compruebe células de vez en cuando bajo un microscopio. Las células infectadas suelen aparecer más grande, más redondo, se han ampliado los núcleos, y comienzan a desprenderse (Figura 4).
   5. Cosecha de células y la confirmación de la expresión de la proteína
      1. Células Cosecha 6 días después de la transfección por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante contiene el baculovirus recombinante - esto se utiliza para generar reservas de trabajo de inmediato, o se puede almacenar a 4 ° C por año.
      2. Para comprobar la expresión de proteínas recoger pellets y resuspender en 500 l de PBS. Mezclar 50 l de la suspensión con 50 l de tampón SDS-PAGE de carga (que contiene un agente reductor). Ejecutar SDS-PAGE y realizar un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-hexahistidina para confirmar la expresión de genes. Incluya las células de la maquetatransfección como controles negativos (Figura 3).
   6. Preparación de las reservas de trabajo
      1. La placa 5 x 10 ⁵ células Sf9 / cm ² en un matraz T175 cm ² y deje reposar por 20 min les permiten adherirse al plato. Reemplace completa medios TNM-FH con medios TNM-FH que contiene 3% de SFB (y 1% Pen-Strep, 0,1% de Pluronic F68).
      2. Infectar las células con 100 l del sobrenadante de rescate. Incubar en una incubadora de 28 ° C y sin CO ₂ durante 6 días y comprobar de vez en cuando si las células se infectan (como se describe en el paso 1.2.5.).
      3. Giran a 2000 x g a temperatura ambiente durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Esta es ahora tu P2 de valores. Esta acción se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C. Repita el procedimiento de infección usando 100 l de la población P2 para infectar células. La acción resultante se denomina P3 o de stock de trabajo, que se puede almacenar a 4 º C o se usa directamente para la expresión de la proteína. El P3 valores por lo general contiene 10 ^{7 -10 9 unidades formadoras de placa / ml.}

2. Expresión y Purificación de Proteínas

Nota explicativa: células Sf9 apoyar el crecimiento de baculovirus muy bien. Sin embargo, su capacidad para secretar grandes cantidades de proteína recombinante es limitada. Por ello utilizamos otra línea de células de insecto, células High Five, para la expresión de proteínas recombinantes secretadas. Estas células no apoyar la replicación de baculovirus a títulos muy altos ¹³ pero tienen alta capacidad secretora.

1. Al crecer las células High Five
   Se cultivan las células High Five en SFX medio de cultivo de células de insecto en T175 cm ² frascos. Pasaje cada otro día 01:03. Por una cultura 200 ml expresión tendrá que crecer matraces confluentes 5.
2. La cosecha y la infección de células High Five
   1. Separe las células High Five de 5 T175 cm ² frascos tocando los frascos con la mano. Recoger el suspe celularnsion y transferir a tubos de 50 ml de centrifugación.
   2. Gira a 1.200 xg durante 7 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por decantación y unir los gránulos mediante resuspensión en 15 ml de stock P3.
   3. Deje reposar durante 15 minutos en la campana de flujo (Figura 5).
   4. Transferir 200 ml de medio de cultivo Hyclone SFX en un estéril 1,000 ml frasco agitador limpio (sin buffles, sellado con papel de aluminio antes de esterilizar, no debería haber sido utilizado para cultivos de bacterias antes).
   5. Transferir la suspensión P3/cell en el matraz agitador. Selle con papel de aluminio estéril y frasco de transferencia en una coctelera. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas.
3. La cosecha de la proteína recombinante de High Five sobrenadantes de expresión de células
   1. 72-96 h después de la infección de transferencia de los sobrenadantes del cultivo en 500 ml cubos de centrifugación. Gira a 5.500 xg durante 20 min a 4 ° C. Mientras tanto enjuague los matraces de agitación 3 veces con agua bidestilada_(DdH2O).
   2. Transferencia de 3 ml de suspensión de Ni-resina en un tubo de 50 ml con 45 ml de PBS (uno necesita por 200 ml de cultivo). Agitar bien y centrifugar a 3000 xg a temperatura ambiente durante 10 min. Decantar el PBS y mantener el pellet. Mezclar el sobrenadante de células de insecto con el sedimento de Ni-resina y transferir en los matraces de agitación ya enjuagados. Se incuba a 4 º C durante 2-4 horas, mientras se agita (Figura 6).
   3. Columna de polipropileno ml Monte 10 en una pinza en un soporte de apoyo. Retire las dos tapas y coloque un vaso debajo de la columna para recoger el flujo a través (de residuos). Tome el matraz de agitador de la coctelera y empezar a transferir la mezcla de sobrenadante / suspensión sobre la columna; retendrá la resina Ni-y sólo el sobrenadante fluirá a través. Pasar todo el volumen sobre la columna (Figura 7).
   4. Lavar los 4x de resina con 15 ml de tampón de lavado (50 mM de Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Deje que todo el drenaje de tampón de lavadode la columna y cerrarlo con la tapa (lado inferior).
   5. Añadir 2 ml de tampón de elución (50 mM Na ₂ HCO _3, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8) y dejar reposar durante 5 minutos. Abra la columna y recoger el eluido. Repita esto 3 veces más (un total de 8 ml de tampón de elución). El eluato que contiene altas concentraciones de proteína típicamente muestra de espuma cuando se agitan (Figura 7). Mantenga eluido en hielo húmedo siempre que sea posible.
4. El cambio de tampón y la concentración
   1. Prespin 15 ml unidades de centrifugación de ultrafiltración (30 kDa de corte para HA / NA, pero puede variar dependiendo del tamaño de la proteína purificada) con PBS (pH 7.4 a 7.6) a 3.000 xga 4 º C durante 20 min. Deseche el flujo a través y eluido carga sobre la columna de centrifugación. Llenar con 5 ml de, helada PBS estéril y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C.
   2. Flujo de descarga a través de nuevo, vuelva a llenar con 15 ml de PBS helado y centrifugado durante 60 minutos a 3000 xga 4 º C. Repita este procedimientoDuré una vez más.
   3. Tome la columna de centrifugación de la centrífuga y se recoge el tampón intercambiado concentrado (típicamente 200 l). Esto está muy concentrado de proteína recombinante. Enjuague la columna de centrifugación con 400 l de hielo frío PBS estéril y añadir este al concentrado. Mantener el concentrado en hielo en todo momento.

3. Caracterización y Control de Calidad

1. Medición de la concentración de proteínas
   Tomar una alícuota del concentrado y medirlo usando su método de cuantificación de proteínas de elección. Establecer la concentración de proteínas a 1 mg / ml mediante la adición de PBS y congelar pequeñas alícuotas a -80 ° C. Ciclos de congelación y descongelación dañan la estructura de la proteína y pueden conducir a la agregación.
2. SDS-PAGE y tinción de Coomassie
   Correr 500 ng de su proteína en una SDS-PAGE y realizar una tinción de Coomassie. Para la tinción rápida y conveniente utilizar el reactivo de Coomassie en combinación con un protocolo de microondas. Proteínas HA suelen aparecer a los 64 añoskDa mientras que las proteínas NA deben ejecutar en un tamaño de alrededor de 56 kDa (Figuras 8A y B). Utilizando el protocolo descrito no debería ver cualquiera de los productos de degradación. Si se produce la degradación por lo general es una señal de contaminación de levadura / hongos durante la expresión. En este caso, repita el procedimiento y asegúrese de mantener todo estéril.
3. Western blot / ELISA
   Con el fin de verificar la identidad de proteínas se recomienda hacer para una transferencia de Western o ensayo ELISA con un anticuerpo específico. Idealmente, los ensayos de ELISA se realizan con un anticuerpo que se une a epítopos conformacionales (por ejemplo, anticuerpos anti-HA tallo ^1). Uso de un anticuerpo tal el correcto plegamiento de la proteína se puede confirmar (Figura 8C).
4. Medición de la actividad de NA
   Plegamiento correcto de la NA viral también se puede determinar midiendo la actividad de NA. Se recomienda realizar esta prueba utilizando el ensayo NA * STAR disponible comercialmente (sólo tienes que seguir las directrices para el usuario).

Resultados

Moléculas de HA de A/Shanghai/1/13 y A/Anhui/1/13 expresaron bien con rendimientos de aproximadamente 20 cultura mg / l. Moléculas de NA de ambas cepas mostraron niveles de expresión moderados que van desde 0,2 mg / l de cultivo para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Los cuatro preparaciones de proteína tenían muy poco o nada de las impurezas (Figuras 8A y B) con El ser de mayor pureza que AN que puede explicarse por el nivel de expresión. A/Shanghai/1/13 HA se analizaron ...

Discusión

Aunque la expresión de virus de la gripe HA y NA proteínas en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus es generalmente sencillo, hay varios puntos importantes a considerar. Es importante, como se ha señalado en la introducción, que los ectodominios de HA y NA se expresan en fusión con dominios de trimerización o tetramerización, respectivamente. Estos dominios garantizar el correcto plegado de las moléculas normalmente ayudado por el dominio de transmembrana, que no está presente si sólo el e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del material/equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios/Descripción
Bac-to-Bac Sistema de expresión de baculovirus	Invitrogen	10359-016	Siga las instrucciones del fabricante
TNM-FH medio para insectos Gemini	Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reactivo	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarosa	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Filtros Centrigual Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pluma	Strep Gibco	15140-122
Columnas de polipropileno (5 ml)	Qiagen	34964
Máxima eficiencia DH10Bac bacterias	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Filtro de plásmidos Midipure Kit	Invitrogen K210015
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399-100G	para tampones de elución y lavado
Celdas Sf9	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502