Summary
כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.
Abstract
למרות הזמינות של טיפול וחיסון, שחפת (שחפת) נשאר אחד הזיהומים החיידקיים הקטלניים הנפוצים ביותר בעולם. מאז כמה עשורים, ההתפרצות הפתאומית של זנים עמידים לתרופות מרובות ונרחבות היא איום רציני על השליטה בשחפת. לכן, חיוני לזהות מטרות ומסלולים חדשים קריטיים עבור הסוכן הסיבתי של השחפת, שחפת Mycobacterium (Mtb) ולחפש כימיקלים חדשניים שיכולים להפוך לתרופות שחפת. גישה אחת היא להקים שיטות המתאימות למסכים הגנטיים והכימיים של ספריות בקנה מידה גדול המאפשרות חיפוש מחט בערימת שחת. למטרה זו, פיתחנו בדיקה פנוטיפית המסתמכת על זיהוי של Mtb שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית. בדיקה זו במבחנה מאפשרת כימות מבוסס תמונה של תהליך הקולוניזציה של Mtb לתוך המארח היה אופטימיזציה עבור פורמט microplate 384-well, אשר מתאים למסכים של siRNA-, תרכובת כימית- או Mtb מוטציה ספריות. התמונות מעובדות לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי, המספק הסקת מסקנות על הפתוגנזה של Mtb בתוך תאים מארחים.
Introduction
בין הפתוגנים זיהומיות המתעוררים המתעוררים מחדש שדווחו בשנים האחרונות, שחפת Mycobacterium (Mtb) מחזיק מקום בולט להיות אחראי על 1.4 מיליון מקרי מוות ו 8.7 מיליון זיהומים חדשים בשנת 2011 (דו"ח שחפת גלובלית 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). למרות הזמינות של טיפולים multidrug, מספר האנשים הנגועים עדיין במגמת עלייה ועמיד multidrug (MDR) כמו גם עמידים לתרופות נרחב (XDR) Mtb מתפשטים במהירות בכל רחבי העולם1. יתר על כן, כאשר לוקחים בחשבון את נוכחותם של אנטיגנים Mtb, ברור כי שליש מהאוכלוסייה העולמית נחשב נגוע סמוי על ידי Mtb. סטטיסטית, במקרה אחד מתוך עשרה, יש אבולוציה לקראת הצורה הפעילה של המחלה עם הסימפטומים הקליניים הבאים2. לכן, אמצעים חדשים להילחם Mtb נדרשים בדחיפות. בהקשר זה, פיתחנו מבחנה פנוטיפית ויזואלית במבחנה המסתמכת על ניטור פלישת Mtb וכפל לתאים מארחים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית אוטומטית3. ההתאמה של הבדיקה בלוחות מיקרוטיטר 384-גם בשילוב עם רכישת תמונה אוטומטית וניתוח, אפשר תוכן גבוה / תפוקה גבוהה הקרנה (HC / HTS) של ספריות בקנה מידה בינוני של תרכובות, siRNAs ומוטנטים חיידקיים. ההקרנה של ספריית RNAi רחבת הגנום בבדיקה פנוטיפית זו אפשרה ובכך לזהות את הגורמים המארחים העיקריים המעורבים בסחר Mtb ושכפול תאיים, אלא גם את ההבהרה של מסלולים מארחים המנוצלים על ידי bacillus פקעת. הסתגלות נוספת של בדיקה פנוטיפית מסוימת זו הייתה לזיהוי גורמים חיידקיים החיוניים להתמדה תוך-פאגוזומלית של Mtb. לדוגמה, מעצר התבגרות phagosome נחשב לאחד המנגנונים העיקריים המאפשרים את הישרדותו ושכפולו של Mtb במקרופג'. ניטור של לוקליזציה תת תאית של מוטציות נוקאאוט Mtb בתאים פלואורסצנטי שכותרתו חומצית מותר לזיהוי של גנים חיידקיים המעורבים בתהליך ההישרדות4. לבסוף, הדמיה בתכולת גבוהה של Mtb מציעה גם שיטה מצוינת לכמת יעילות התרופה לעיכוב תופעות שונות כמו צמיחת חיידקים תאיים3. בסך הכל, סוג זה של תפוקה גבוהה phenotypic assay מאפשר האצת גילוי סמים נגד שחפת ואת הנתונים שנאספו על ידי גישות שונות אלה לתרום להבנה טובה יותר של מניפולציה המארח המופעל על ידי Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה
הקרנה שבוצעה במודל אנושי מסוג II pneumocytes A549 קו התא על זיהום עם Mtb H37Rv המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). הליך זה מתואר באיור 1א.
- Resuspend ספריית siRNA מיובש המאוחסן לוחות אמא (96-באר צלחות) עם 1x siRNA חוצץ להגיע לריכוז של 4 מיקרומטר, ולאחר מכן להעביר 10 μl של התערובת לתוך צלחת בת 384-well (צלחת הבת 1).
- הוסף 10 μl של חיץ 1x siRNA בצלחת הבת 1 כדי לדלל siRNA על ידי 2-פי 2. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
- לדלל siRNAs בצלחת הבת 1 לתוך צלחת הבת 2 כדי להגיע לריכוז של 500 ננומטר. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
- לפני השימוש, להפשיר את צלחת הבת 2 בטמפרטורת החדר.
- קח 2.5 μl של siRNA מצלחת הבת 2 ומניחים לתוך צלחת 384-wellsay.
- באותה צלחת 384-wellsay בשלב 1.5, להוסיף 2.5 μl שליטה שלילית וחיובית siRNA לבארות שלהם בהתאמה.
- לדלל את reagent transfection ב 1x D-PBS כדי להניב פתרון מספיק כדי לספק 0.1 μl transfection reagent בכל באר מראש את פתרון transfection מדולל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- הוסף 7.5 μl של תערובת פתרון reagent / PBS transfection לכל באר בצלחת ההסתערות והדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 40 μl של תאים A549 (1,500 תאים / טוב) מושעה RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS). לשמור על תאים לתקופה של 3 יום דגירה ב 37 °C (69 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2. תאים אלה מתחלקים כל 24 שעות, ולכן כ -12,000 תאים נמצאים בבארות שלושה ימים לאחר ההחלקה.
- לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x. (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
- להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
- לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי על תרבות אחרת שהוכנה באותם תנאים. הכן השעיה חיידקית המכילה 2.4 x 106 חיידקים / מ"ל, אשר מתאים ריבוי של זיהום (MOI) של 5.
- הסר את המדיום בצלחת 384-wellsay ולהוסיף 25 μl של השעיה חיידקית שהוכנה טרי.
- דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות באווירה המכילה 5% CO2.
- הסר את המדיום בעדינות לשטוף את התאים עם בינוני RPMI בתוספת 10% FBS 3x.
- כדי להרוג את החיידקים החוץ תאיים הנותרים, לטפל בתאים עם 50 μl של מדיום RPMI-FBS טרי המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר של אמיקצין ב 37 °C (70 °F) במשך 1 שעות באטמוספרה המכילה 5% CO2.
- הסר את amikacin המכיל בינוני ולהוסיף 50 μl של בינוני RPMI טרי בתוספת 10% FBS. דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 °C (60 °F) במשך 5 ימים באווירה המכילה 5% CO2.
- לפני רכישת התמונה, להוסיף 10 μl של מוכן טרי 30 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI ב PBS (ריכוז סופי 5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואת הדגירה במשך 10 דקות ב 37 °C (70 °F).
- טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - הגדר את פרמטרי החשיפה. הקלט פלואורסצנטיות DAPI באמצעות לייזר עירור 405 ננומטר עם מסנן פליטה 450 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 1.20 ו- 1.21 והפעל את הרכישה האוטומטית.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - העבר תמונות לשרת מרוחק.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה גרעיני תאים מערוץ DAPI באמצעות אלגוריתם לזיהוי גרעינים והאזור החיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4A).
הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד כדי לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על צמיחת Mtb תאיים. Mtb הוא חיידק בצמיחה איטית אשר מתחלק כל 20 שעות בתנאים אופטימליים. לאחר 5 ימים לאחר ההדבקה כמות Mtb חוץ תאי עדיין נמוך בהיעדר תמוגה התא ולא השפיע על איכות הניתוח. פרוטוקול זה חייב להיות אופטימיזציה במונחים של אורך הטיפול האנטיביוטי וזמן הדגירה כדי להיות מותאם מסכי siRNA באמצעות חיידקים בצמיחה מהירה כמו Mycobacteria smegmatis ו Escherichia coli כי הם שוחררו בהרחבה יכול להדביק תאים חדשים.
2. הקרנה תרכובת בתפוקה גבוהה
ההקרנה בוצעה על Mtb H37Rv תאים מארחים נגועים. הליך זה מתואר באיור 1B.
- להפשיר את צלחות אמא 384-באר המכיל את הספרייה המורכבת solubilized ב DMSO 100%. העבר 0.5 μl של תרכובות צלחות בת 384-well המכיל 10 μl של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS.
- לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
- להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
- לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי. ריכוז אופייני הוא 1 x 108 חיידקים / מיליליטר.
- קציר 6 יום מקרופאגים אנושיים ראשוניים ישנים ב 4 x10 5 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 50 ng /ml רקומביננטי אנושי M-CSF (עבור תאי מונוציט דם היקפיים אנושיים טיהור ובידול מקרופאגים ראה פרוטוקול 4).
- דגירה את התאים הראשיים מדולל עם bacilli ב MOI שונים, החל 1-5, בהשעיה עם רעידות קלות ב 90 סל"ד במשך 2 שעות ב 37 °C (69 °F).
- לשטוף את התאים הנגועים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g כדי להסיר את החיידקים חוץ תאיים. לאחר כל שלב צנטריפוגה, resuspend גלולה ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS. חזור על שלב זה 2x.
- להשעות את התאים הנגועים ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו amikacin ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר ולהדגיר את ההשעיה עם טלטול קל במשך 1 שעה ב 37 °C (67 °F).
- הסר את מדיום תרבית התא המכיל amikacin על ידי צנטריפוגה ב 350 x g ולשטוף את התאים הנגועים עם מלא RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 50 ננוגרם / מיליליטר M-CSF אנושי רקומביננטי. חזור פעם אחת.
- הוסף 40 μl של השעיית מקרופאגים נגועים באותה צלחת מבחנים בשלב 2.1, אשר כבר מכיל 10 μl של דילולים מורכבים. הריכוז הסופי של DMSO בכל באר הגיע כעת 1%.
- דגירה צלחות assay במשך 5 ימים ב 37 °C (60 °F) באווירה המכילה 5% CO2.
- הכתים את התאים החיים בצבע פלואורסצנטי אדום-רחוק חדיר לתאים.
- טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - הגדר את פרמטרי החשיפה. רשום פלואורסצנטיות אדומה רחוקה באמצעות לייזר עירור 640 ננומטר עם מסנן פליטה 690 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 2.14 ו- 2.15 והפעל את הרכישה האוטומטית.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - העבר תמונות לשרת מרוחק.
לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. - הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה אזור תאים מערוץ אדום רחוק באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסל ואזור חיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4B).
הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מותאם להקרנת ספריית מוטנטים Mtb על ידי החלפת תרכובות על ידי מוטנטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (מוטציה אחת טובה / אחת) (איור 1C, ראה גם ברודין ואח '. 4). מוטציות פלואורסצנטיות הן הזרע הראשון בארות (20 μl של השעיה חיידקית לכל באר). חיידקים הם התאוששו לאחר מכן על ידי 30 μl של השעיית תאים. לאחר צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 1 דקות, הצלחת היא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO2. זמן הדגירה ו- MOI תלויים במהלך ההסמכה. לדוגמה, עבור הדמיה של אירועים תאיים מוקדמים כגון חומציות phagosome, התאים יכולים להיות נגועים במשך 2 שעות עם MOI החל 1-20. Lysosomes מוכתמים באמצעות צבע Lysotracker ב 2 μM עבור 1.5 שעות ב 37 °C (69 °F) באווירה המכילה 5% CO2 ולאחר מכן קבוע עם 10% פורמלין או 4% paraformaldehyde (PFA). תמונות קונפוקל נרכשות ולבסוף מנותחות באמצעות סקריפטים לניתוח תמונה הכוללים אלגוריתמים מתאימים לזיהוי ליזוזומים ולוקליזציה תת-תאית4.
3. חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא שחפת מיקובקטריום H37Rv (GFP-H37Rv) תנאי תרבות
עבור אחסון לטווח ארוך, GFP-H37Rv הוקפאו D-PBS (סביב 1 x 108 mycobacteria לכל בקבוקון).
- Resuspend בקבוקון אחד קפוא של GFP-H37Rv בבקבוקון ארלנמייר המכיל 50 מ"ל של 7H9 מרק בינוני בתוספת העשרה OADC מידלברוק 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05%, והיגרומיצין B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
- דגירה 8 ימים ב 37 °C (69 °F).
- מדוד OD600 של תרבות GFP-H37Rv.
- לדלל את התרבות GFP-H37Rv כדי להשיג OD600 = 0.1 טרי 7H9 מרק בינוני בתוספת מידלברוק OADC העשרה 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05% ו Hygromycin B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
- דגירה GFP-H37Rv ב 37 °C (77 °F) במשך 8 ימים נוספים לפני השימוש עבור ההסתעפות.
4. טיהור תאי מונוציט בדם היקפי אנושי מדם שלם או הכנת מעיל באפי
- לדלל את כיס הדם 2x ב 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS.
- בודדו את המונוציטים לפי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות Ficoll ב- 400 x g למשך 20 דקות.
- אסוף את המונוציטים המבודדים.
- לשטוף את המונוציטים 3x עם 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לרכז את התאים עד 1 x 107 תאים / מיליליטר.
- לטהר מונוציטים באמצעות חרוזי CD14 מגנטיים על פי פרוטוקול היצרן (ראה חומרים).
- לאחר טיהור CD14-monocytes, זרע את התאים ב 1.5 x 106 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 משלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של האדם מקרופאגים מושבה מגרה פקטור (hM-CSF) ודגר במשך 4 ימים ב 37 °C (60 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
- לאחר 4 ימים להחליף את המדיום עם טרי RPMI 1640 השלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של hM-CSF ו דגירה במשך 2 ימים ב 37 °C (67 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
- לאחר 6 ימים, התאים יכולים לשמש לבדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה
Mtb הוא מסוגל ליישב תאים חיסוניים במבחנה, כמו גם כמה תאים אפיתל ריאות אחרים. לדוגמה, Mtbהוא מסוגל להדביק ולפגוע בתאי אפיתל A549 המשמשים בדרך כלל כמודל עבור pneumocytes סוג אנושיII 5-7. Dectin-1 דווח כקולטן תא מארח מעורב ספיגת Mtb, תגובת proinflammatory והשפעה אנטיבקטריאלית על צמיחה מיקובקטריאלית תאית בתאי A5498. מצב siRNA המתואר בפרוטוקול 1 הוביל ל-85% מיעילות ההשתקה (נתונים לא הוצגו). השתקת ביטוי Dectin-1 עם siRNA הובילה לירידה של כמות mycobacteria תאיים בתאי A549. ואכן, לאחר 3 ימים של השתקה ו 5 ימים של זיהום, אחוז התאים הנגועים מצטמצם פעמיים בתאי Dectin-1 מושתק A549 לעומת תאים transfected עם siRNA לטרוף nontargeting (איורים 2A ו 2B). יישמנו נורמליזציה מבוססת מדגם של siRNA ממוקד Dectin-1 לעומת לטרוף להגדיר Z-ציון. כפי שמוצג באיור 2C, השגנו ממוצע ציון Z בסביבות -15 עבור siRNA ממוקד Dectin-1. Dectin-1 יכול לשמש כשליטה חיובית עבור מסך siRNA כדי לגלות גורם מארח חדש אחר המעורב קולוניזציה Mtb ב pneumocytes שיכול להיות אותו פנוטיפ כמו זה עם siRNA Dectin. השימוש siRNA המשפיע על פנוטיפ כפקד על כל microplate במהלך המסך מאפשר נורמליזציה של כל צלחת, וזה שימושי כאשר אחד רוצה לבצע ניתוח מסך הגנום כולו. הפרמטר הסטטיסטי Z' היה 0.1 באמצעות נורמליזציה מבוססת בקרה על לטרוף ו siRNA ממוקד Dectin1, שהוא ערך מקובל עבור אימות של נתוני סינון siRNA.
הקרנה מורכבת בתוכן גבוה
יעילות מורכבת על צמיחת חיידקים תאיים מוערך על ידי הקמת עקומת תגובת מינון (DRC) ומנורמל לתרכובת חיובית התייחסות ובקרות ממס תרכובת שלילית. נציג DRC של שני תרכובות ייחוס, איזוניאזיד (INH) וריפאמפיצין (RIF), הפעילים נגד צמיחת Mtb מוצגים באיור 3. עקומות אלה מתקבלות במקרופאגים ראשוניים אנושיים נגועים בזן Mtb H37Rv מבטא GFP, עם קריאה לאחר 5 ימים לאחר ההדבקה. DMSO ו- INH בריכוז סופי של 1% ו- 0.1 מיקרוגרם/מיליליטר בהתאמה משמשים בדרך כלל כפקדים שליליים וחיוביים, ומספקים רמות בסיסיות של יעילות (0 ו- 100%) (איור3A). בעקבות תהליך ניתוח התמונה המפורט באיור 4B, נתונים רב-פרממטריים מופקים מתמונות פלואורסצנטיות קונפוקלית של מקרופאגים נגועים-אנושיים שנלקחו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי. תרכובות פעילות המשפיעות על השכפול תאיים של Mtb בתאים מארחים הובילו לירידה בעומס המיקובקטריאלי, התואם את אזור אות ה- GFP בתאים בתמונות (איור 3B). היחס בין אזור חיידקי תאי לאזור התא הכולל, המחושב באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה, מותווה בתפקוד של ריכוז מורכב, המייצר את ה- DRC (איור 3B). עקומות אלה מאפשרות לקבוע הן את הריכוז הנדרש כדי להפחית את עומס החיידקים ב-50% (IC50)והן את הריכוז המינימלי הנדרש כדי לעכב 99% מהשכפול החיידקי (MIC99)(איור 3C). Z' מבוסס על DMSO הבקרה 1% ואת הבקרה INH 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר היה 0.49. Z', ממש קרוב ל 0.5, מקובל לאמת את ההסתערות הזאת.
איור 1. גישות להקרנת תוכן גבוה חזותי. ייצוג סכמטי של מערכת מודל זיהום Mtb המשמשת למסכי siRNA (A), תרכובות כימיות (B) ומוטנטים Mtb (C). (A) מסך ספריית siRNA: התאים היו מודבקים עם siRNA במשך 3 ימים בלוחות 384-באר בשיטת transfection הפוכה. תאים נגועים siRNA נדבקו GFP-Mtb ו דגירה במשך 5 ימים ב 37 °C (69 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2. התאים הוכתמו אז ותמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי. (B)מסך ספריית תרכובות: התרכובות חולקו בלוחות של 384 בארות. השעיית תאים ו- GFP-Mtb היו דגירה יחד במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. תאים נגועים נזרעו בצלחות והדגירו במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2. התאים הוכתמו אז ותמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי. (C)ספריית מוטנטים פלואורסצנט-Mtb: מוטציות Mtb פלואורסצנטיות נזרעו בצלחות 384 באר והשעיית התא המארח הופצה. זמן הדגירה השתנה בהתאם לתסבוגת. התאים או הוורידים התאיים הוכתמו לפני רכישת תמונה אוטומטית. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2. Dectin-1 השתקת השפעות על קולוניזציה Mtb בתאי A549. (A)תמונות קונפוקל מייצגות (עדשת אוויר 10X) של תאי A549 שהודבקו עם siRNA (לטרוף) או עם siRNA ספציפי עבור Dectin-1 נגוע GFP-Mtb H37Rv (MOI5) במשך 5 ימים. סרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרומטר (A) GFP-Mtb H37Rv היו דמיינו בירוק ואת התאים באדום. מספר התאים (A. זיהוי תאים) ועומס GFP תאיים-Mtb H37Rv ( אזור חיידקיא ') נקבעו באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה. (B) ייצוג גרפי של אחוז תאי A549 הנגועים ב- 5 שכפולים (w1 עד w5) של מערבל siRNA (עיגולים כחולים) ודסטין-1 siRNA (עיגולים אדומים). (ג)ייצוג גרפי של ממוצע ציון Z של מערבל siRNA ודסטין-1 siRNA. (*** ערך p < 0.0001). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. עקומת תגובת מינון של תרכובות התייחסות פעילה נגד Mtb במקרופאגים אנושיים. (A ו- B) תמונות קונפוקל נציג (עדשת מים 20X) של מקרופאגים אנושיים (אדום, תא שכותרתו בצבע פלואורסצנטי אדום) נגוע GFP-Mtb H37Rv (ירוק) עם MOI1 במשך 5 ימים. סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. (A) תמונות של תאים נגועים דגירה עם DMSO 1% משמש שליטה שלילית ב assay. (B) תמונות של תאים נגועים דגירה עם ריכוז גובר של שתי תרכובות התייחסות isonazid (INH) ו ריפאמפיצין (RIF). (C)עקומות תגובת מינון (DRC) של INH ו- RIF. ניתוח מבוסס תמונה איפשר קביעת DRC עבור כל תרכובת שנבדקה. DRC מייצג את היחס בין אזור חיידקי GFP תאיים לבין אזור התא הכולל (ציר Y), בתפקוד הריכוז המורכב (סולם יומן רישום, ציר x). בכל גרף, DRC של תרכובת היה מנורמל לזה של DMSO שליטה שלילית 1% (0% עיכוב) ואת השליטה החיובית INH בריכוז של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר (100% עיכוב). עבור כל תרכובת, הריכוז הנדרש כדי לעכב 50% של קולוניזציה חיידקית (IC50)ואת ריכוז מעכבות מינימלי (MIC99) חושבו מן DRC. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4. ניתוח מבוסס תמונה סטנדרטי כדי לקבוע מיקובקטריה תאית פלואורסצנטית. תמונות מלוחות של 384 באר נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי. במקרה זה, 4 תמונות שונות של אותה באר (שדות) נרשמו. כל שדה נותח לאחר מכן באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה Acapella 2.6 (פרקין אלמר). (A)כל שדה הכיל שני ערוצים (שני צבעים), אחד עבור החיידקים (ירוק) ואחד עבור גרעיני התא (ערוץ כחול), שהיו מקוטעים באמצעות האלגוריתם הבא: i) זיהוי גרעינים באמצעות הליך Acapella מובנה, ii) גילוי ציטופלסמה, המבוסס על אוכלוסיית הגרעינים, באמצעות הליך Acapella מובנה, iii) זיהוי חיידקים על ידי שמירה על פיקסלים בלבד אשר אינטנסיביות גבוהה יותר מאשר סף מוגדר באופן ידני, iv ) מיזוג תאים מיקום עם מיקום חיידקיםכדי לזהות תאים נגועים. התוצאות הסופיות, המובעות כממוצע של ארבעת השדות, הן האזור החיידקי הכולל, מספר התאים הכולל, אחוז התאים הנגועים ואזור החיידקים לתא (ממוצע של כל התאים הנגועים). (B)כל שדה הכיל שני ערוצים, אחד עבור החיידקים (ערוץ ירוק) ואחד עבור גרעיני התא ציטופלסמה (ערוץ אדום רחוק), שהיו מקוטעים באמצעות האלגוריתם הבא: i) סינון הערוץ המקורי באמצעות מסנן אנטי חציוני, ii) שמירה על פיקסלים בלבד בעוצמה הגבוהה מסף המוגדר ידנית (לכל ערוץ יש סף משלו), iii) ספירת מספר הפיקסלים הנותר עבור כל ערוץ, iv) מיזוג ערוצים וספירת מספר הפיקסלים המשותפים הן על ידי חיידקים והן על ידי גרעינים כדי לכמת חיידקים תאיים. התוצאות הסופיות, המובעות כממוצע של ארבעת השדות, הן האזור החיידקי הכולל, האזור התאי הכולל, השטח הכולל של חיידקים תאיים והיחס בין אזור חיידקי תאי לאזור הכולל של התאים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים כאן את השיטות הנדרשות לבדיקה פנוטיפית באמצעות זן Mtb H37Rv מבטא GFP כדי להדביק תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית, מה שהופך אותו מתאים למסכי תוכן גבוה / תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תרכובות, בדיקות פלואורסצנטיות ומוטנטים Mtb. עבור כל פרוטוקול שתואר לעיל, ניתן היה לבצע שלבי קיבעון ואימונולה לפני רכישת התמונה. אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי אוטומטי המצויד בעדשת מים 20X (NA 0.70) או 60X (NA 1.2) כדי לרכוש תמונות. המיקרוסקופ הקונפוקל מצויד בלייזרים עירור 405, 488, 561 ו- 640 ננומטר. הפלואורסצנטיות הנפלטת נלכדת באמצעות 3 מצלמות המשויכות לקבוצה של מסננים המכסים אורך גל זיהוי הנע בין 450-690 ננומטר. חשוב לציין כי התאמת הגדרות עירור ופליטת המיקרוסקופ תלויה בסוג צבעים או פלואורוכרומים המשמשים בכל ניסוי. עבור מבחני פנוטיפ, DAPI או Hoechst משמשים בדרך כלל ב 5 מיקרוגרם / מ"ל במשך 10 דקות כדי להכתים גרעינים. עם זאת, תאים יכולים גם להיות מוכתמים עם צבעים פלואורסצנטיים שונים ספציפיים לגילוי ציטופלסמה, קרום או ציטוסקלטון. לאחר רכישת תמונה, יש לנתח תמונות באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה. אלגוריתמים לפי פילוח תאים המבוססים על עוצמת כל פיקסל צריכים לשמש כדי לוודא בהתאמה את מספר התאים או את אזור החיידקים התוך תאיים (ראו איור 4). יש לשקול את הנתונים שנוצרו מול קריטריוני קבלה מבוססים סטטיסטית כדי לאמת את החוסן ואת הדיוק של ההסכמה.
מסכי תפוקה גבוהה בקנה מידה גדול הם ניסויים הצורכים זמן ומשאבים. לכן, יש חשיבות עליונה להעריך מראש את התאמתה של ההסתעפות. הנתונים שנאספו ממסכים פנוטיפיים היו חזותיים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כמו Excel ובדרך כלל מנורמל לכל צלחת. מדדי האיכות הנפוצים ביותר המשמשים הן למסכי siRNA והן למסכי מולקולות קטנות הם Z. Z מוגדר עם ממוצע וסטיית תקן של פקדים חיוביים ושליליים9. Z מכמת אם התגובה לבדיקה גדולה מספיק כדי לאמת את היישום שלה עבור מסך בקנה מידה מלא של דגימות. הטווח של Z הוא אינסוף שלילי ל 1, עם >0.5 כמו בדיקה טובה מאוד, >0 בדיקה מקובלת <0 בדיקה בלתי מתקבלת על הדעת. בהשוואה למסכי המולקולה הקטנה שעבורם עוצמת הפקדים מאפשרת אימות של ההסתערות עם Z > 0.5, השונות של מסכי siRNA משפיעה על Z אשר נוטים להיות נמוכים יותר (לעתים קרובות בין 0.0-0.5)10. ואכן, ההצלחה של מסכי siRNA תלויה באופטימיזציה של i) היעילות של מסירת siRNA לתאים, ii) הציטוטוקסיות הנגרמת על ידי transfection ו - iii) התנאי לבדיקה ליעילות של השתקת גנים. ה- siRNA יכול בקלות להיות מוחטף בקווי תאים שונים, כגון HeLa, בעקבות פרוטוקול transfection של היצרן, אבל transfection siRNA יעיל בקווי תאים מסוימים כולל מקרופאגים עדיין נשאר אתגר. עם זאת, ביטוי ויראלי וקטור בתיווך של RNAs סיכת ראש קצרה (shRNA) יכול לייצג חלופה טובה11. כדי להימלט מהקושי של פרשנות, הנתונים שנאספו ממסכי siRNA מנורמלים לעתים קרובות ביחס להתפלגות הסטנדרטית הרגילה כדי להגדיר את ציון Z (המכונה גם ערך Z) עבור כל נקודה10,12. לאחר מכן, דגימות פגע דורגו על פי ציון Z אשר בדרך כלל שייך פחות מ -2 או יותר מאשר +2. לבסוף, כניסות נבחרות במסך הראשי נבדקו שוב במסך משני, כולל שכפולים נוספים כדי לאשר את הפנוטיפ שנצפה במסך הראשי.
הפרוטוקול שלנו יכול בקלות להיות מיושם עבור מסכים בקנה מידה קטן עם ציוד. כדי להשיג זאת, יש צורך במזעור מבחנים בלוחות המיקרו-טיטר ובמניפולציה של ספריית המולקולות כדי לייעל את תהליך השימור, החלוקה והערבובשל 13. יתר על כן, מומלץ להשתמש בפלטפורמה רובוטית אוטומטית, כולל מכשירים, על מנת לשלוט במדויק ובאופן שכפול בתנאי ההסתעפות בלוחות המיקרו-טיטר. כמות עצומה של נתונים המיוצרים על ידי סינון תפוקה גבוהה (HTS) צריך להיות מנוהל גם על ידי מסד נתונים צינור מותאם לניתוח תמונה של התמונה confocal, אחסון נתונים והעברה. ההסתעפויות שהוצגו בדו"ח זה בוצעו במתקן Biosafety רמה 3 (BSL3). ההקפדה על הבטיחות ב-BSL3 מגבירה את הקושי של המסכים. ואכן, ציוד רב הנדרש למסכים חייב להיות זמין BSL3 ומבודד כדי להגן על העובד ועל הסביבה מפני זיהום. לכן, ההתקנה של הצינור המותאם BSL3 נדרש הרבה מקום. מסיבה זו, הפרוטוקול שלנו פותח כדי לקבל מקסימום של צעדים שבוצעו BSL3 כמו transfection siRNA והעברה מורכבת ללוחות. זיהום התא דרך שלבי רכישת תמונה בוצעו בתנאי BSL3. התמונות הועברו לאחר מכן בשרת ייעודי ונותחו מתוך BSL3.
ההסתעפות הפנוטיפית המתוארת כאן התבססה על שתי שיטות לניתוח תמונה (איור 4). השיטה הראשונה, המשמשת להקרנת siRNA, נועדה לתת את מספר התאים הנגועים. פרמטר זה נמצא כדי להשוות ביעילות את ההשפעה של השתקת גנים על Mtb שכפול תאיים. עם זאת, בעת סינון תרכובות, קריאה בסיסית יותר המבוססת על השטח הכולל של התאים הספיקה כדי לזהות בבירור תרכובות פעילות. מכיוון ששיטה שנייה זו מהירה וקלה יותר ליישום, היא העדיפה ניתוח של תמונות הנובעות מהקרנת תרכובות. כדי ללכת רחוק יותר, צבעים פלואורסצנטיים יותר ו / או בדיקות תיוג ניתן להוסיף סקריפטים ניתוח תמונה ניתן לייעל כדי ליצור נתונים רב-מטריים כגון קולוקליזציה, גרעינים ומורפולוגיה של התא, מוות תאי, צבירת חיידקים, כמו גם סחר תאיים של החיידקים. חשוב לציין כי עבור סחר תאיים או מבחני קולוקליזציה, חיוני לקבל ערימות Z על מנת להחיל הערכה מצטברת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
תמיכה כספית לעבודה זו סופקה על ידי הקהילה האירופית (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, מענק MM4TB n° 260872), סוכנות לאומית דה Recherche, פדר (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), ואת האזור נורד פאס דה קאלה. אנו מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני של גספר דלויסון, אליזבת ורקמייסטר, אנטונינו בונג'ובאני ופרנק לאפונט מפלטפורמת BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
