Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

El objetivo general de este procedimiento es medir el efecto de los moduladores del fenotipo, como el silenciamiento génico del huésped o el impacto de moléculas pequeñas en la replicación intracelular de Mycobacterium tuberculosis. Esto se logra dispensando primero moléculas pequeñas y placas de 384 pocillos o seccionando células con irna y transfectándolas en complejos. El siguiente paso es infectar las células con proteína verde fluorescente que expresa mycobacterium tuberculosis o G-F-P-M-T-B, agregar células a la pequeña molécula que contiene pocillos e incubar la microplaca durante cinco días.

Para el enfoque de ARNi, agregue células a los pocillos que contienen el complejo transfect de ARNi. Incubar la microplaca durante tres días y luego infectar las células con G-F-P-M-T-B que expresan micobacteria tuberculosis. Después de teñir las células, el paso final es leer las placas con un microscopio confocal automatizado.

En última instancia, se utiliza la microscopía de fluorescencia automatizada seguida de un análisis basado en imágenes para medir los cambios en el crecimiento intracelular G-F-P-M-T-V. La principal ventaja de esta técnica de método existente, como la formación de colonias uni cine, es que ahorra un largo período de incubación y permite un mayor rendimiento. Para demostrar este procedimiento estarán Christophe Keval o SONG y tres becarios postdoctorales de mi equipo de investigación.

Los protocolos para el cribado de bibliotecas de ARN SI y el cribado de bibliotecas de compuestos utilizan cultivos de GFP de dos semanas de antigüedad que expresan MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV. Para preparar la suspensión bacteriana G-F-P-M-T-B, primero centrifugar el cultivo a 4.000 Gs durante cinco minutos, desechar los sobrenadantes Resus, suspender el cultivo en DPBS y volver a centrifugar de esta manera. Lave el cultivo tres veces con DPBS.

Después del tercer lavado, deseche el supernat y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 10 mililitros de 10%FBS que contiene medio RPMI 1640. Deje la suspensión durante una hora a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos se sedimenten. Recoja el supernado bacteriano y mida el OD a 600 nanómetros y la fluorescencia GFP.

Utilizando un lector de microplacas para determinar la concentración bacteriana, el diámetro exterior a 600 nanómetros debe estar entre 0,6 y 0,8. Calcule el título de la suspensión utilizando una línea de regresión de referencia, mostrando el valor de RFU en función del valor de CFU generado antes de los experimentos en otro cultivo que se preparó en las mismas condiciones. Una concentración típica es de una por 10 a ocho bacterias por mililitro.

Comience este procedimiento suspendiendo Resus la biblioteca de ARN SI seca que está almacenada en 96. Placas madre de pocillo con un tampón X-S-I-R-N-A a una concentración de dos micromolares. Transfiera 10 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa hija de 384 pocillos: transfiera 2,5 microlitros de ARN SI de cada pocillo de la placa hija a una placa de ensayo de 384 pocillos a la misma placa de ensayo.

Añadir 2,5 microlitros de cada uno de los IRNA de control negativo y positivo a sus respectivos pocillos. Si la placa secundaria no se va a utilizar, séllela inmediatamente con un sello de aluminio despegable. La placa sellada puede almacenarse a 20 grados centígrados bajo cero durante al menos seis meses y posiblemente hasta dos o tres años, dependiendo del IRNA.

Recomendaciones del fabricante de la biblioteca. Prepare los reactivos de transfección diluyéndolos en un X-D-P-B-S para producir una solución suficiente para proporcionar 0,1 microlitros para cada uno. Incubar previamente la solución de transfección diluida a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Añadir 7,5 microlitros de la solución de transfección diluida a cada pocillo de la placa de ensayo de 384 pocillos e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en cada pocillo de la placa de ensayo a 40 microlitros de dos neumocitos de tipo humano, células A 5 4 9 suspendidas en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal. Mantenga las células durante un período de incubación de tres días a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Estas células se dividen cada 24 horas, por lo que hay unas 12.000 células en cada pocillo tres días después de la transfección.

Tres días después de si. La transfección de ARN de 5 49 células prepara una suspensión bacteriana MTBH 37 RV GFP. Como se demostró anteriormente.

La suspensión debe contener 2,4 veces 10 a las seis bacterias por mililitro, lo que corresponde a una multiplicidad de infección de cinco. Retire el medio de la placa de ensayo de 384 pocillos y añada 25 microlitros de la suspensión bacteriana por pocillo. Incubar la placa de ensayo de 384 pocillos a 37 grados centígrados durante cinco horas en una atmósfera que contenga un 5% de dióxido de carbono.

Después de cinco horas. Retire el medio y lave suavemente las células tres veces con medio RPMI suplementado con 10% de FBS para matar las bacterias extracelulares restantes. Trate las células de cada pocillo con 50 microlitros.

Un medio R-P-M-I-F-B-S fresco que contiene 50 microgramos por mililitro de amikacina. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora en una atmósfera que contenga un 5% de dióxido de carbono. Por último, retire el medio que contiene amikacina y agregue 50 microlitros de medio RPMI fresco suplementado con 10% de FBS por. Pozo.

Incubar la placa de ensayo a 37 grados centígrados durante cinco días en una atmósfera que contenga un 5% de dióxido de carbono antes de realizar el cribado mediante microscopía confocal. Para comenzar este procedimiento, descongele una placa madre de 384 pocillos que contiene la biblioteca de compuestos solubilizados en 100% DMSO a temperatura ambiente, transfiera 0,5 microlitros de los compuestos de la placa madre a una placa hija de 384 pocillos que contenga 10 microlitros por pocillo de RPMI 1640. Medio suplementado con 10%FPS en la próxima cosecha macrófagos humanos primarios de seis días de edad a cuatro veces 10 a las cinco células por mililitro en RPMI 1640.

Medio suplementado con 10%FPS y 50 nanogramos por mililitro. La MCSF humana recombinante incuba las células primarias diluidas con basia a diferentes MOI que van de uno a cinco en suspensión con una leve agitación a 90 RPM durante dos horas a 37 grados Celsius. Lavar las células infectadas por centrifugación a 350 GS durante cinco minutos para eliminar las bacterias extracelulares.

Resus suspende los pellets en RPMI 1640. Medio suplementado con 10%FPS y centrífuga. Nuevamente, repita esto, lave dos veces después del lavado final.

Resus suspende las células infectadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10%FBS y 50 microgramos por mililitro. La amikacina incuba la suspensión con una leve agitación durante una hora a 37 grados centígrados, centrífuga a 350 GS durante cinco minutos. Retire el medio que contiene amikacina y lave las células infectadas con RPMI 1640 completo.

Medio suplementado con 10%FBS y 50 nanogramos por mililitro. MCSF humano recombinante. Repita este lavado una vez.

Agregue 40 microlitros por pocillo de la suspensión de macrófagos infectados a la misma placa de ensayo de 384 pocillos preparada anteriormente, que ya contiene 10 microlitros de las diluciones del compuesto. La concentración final de DMSO en cada pocillo es ahora del 1%Incubar las placas de ensayo durante cinco días a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga un 5% de dióxido de carbono antes de la cribado por microscopía confocal para la biblioteca de ARN SI. Cribado antes de la adquisición de la imagen, añadir a cada pocillo de la placa de ensayo 10 microlitros de 30 microgramos por mililitro DPI recién preparado en PBS e incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados.

Antes de la adquisición de la imagen, tiña las células vivas con un tinte fluorescente rojo lejano durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Cargue las placas de ensayo en un microscopio confocal automatizado. Establezca los parámetros de exposición, registre la fluorescencia DPI utilizando un láser de excitación a 405 nanómetros con un filtro de emisión a 450 nanómetros.

Registre la fluorescencia GFP utilizando un láser de excitación a 488 nanómetros con un filtro de emisión a 520 nanómetros. Seleccione los pozos y los campos de cada pozo que se van a adquirir, que se denominarán diseños y subdiseños. Los parámetros generan el archivo de experimentos utilizando los parámetros establecidos y ejecutan la adquisición automática.

En este caso, se registran cuatro imágenes diferentes del mismo pozo y campo para transferir imágenes a un servidor remoto. Posteriormente, las imágenes se evalúan utilizando el software de análisis de imágenes acapella 2.6 para el cribado de ARN SI. Cada campo contiene dos canales o colores.

Verde para las bacterias y azul para la célula. Los núcleos detectan los núcleos celulares del canal DAPI mediante un algoritmo de detección de núcleos y el área bacteriana del canal GFP mediante un algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles. Al fusionar los canales y contar el número de píxeles compartidos por las bacterias y las células, se cuantifican las bacterias intracelulares.

Los resultados finales expresados como un promedio de los cuatro campos son el área bacteriana total, el número total de células, el porcentaje de células infectadas y el área bacteriana por célula. Para el cribado de compuestos, cada campo contiene dos canales o colores, verde para las bacterias y rojo lejano para la célula. Los núcleos y el citoplasma detectan el área celular del canal rojo lejano y el área bacteriana del canal GFP utilizando un algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles.

Al fusionar los canales y contar el número de píxeles compartidos por las bacterias y los núcleos, se cuantifican las bacterias intracelulares. Los resultados finales expresados como un promedio de los cuatro campos son el área bacteriana total, el área celular total, el área total de bacterias intracelulares y la relación entre el área bacteriana intracelular y el área total de las células. Aquí se presentan los resultados representativos del cribado de ARN del SI de alto rendimiento en todo el genoma, el silenciamiento de la expresión de din one con el ARN del SI condujo a una disminución de la cantidad de micobacterias intracelulares en 5 49 células.

Como se muestra en estas imágenes confocales representativas de 5 49 células transfectadas con IRNA no objetivo o con ARN SI específico para din one e infectadas con GFP que expresan MTB durante cinco días. GFP MT BH 37 RV se visualizó en verde y las celdas en rojo. El número de células y la carga intracelular G-F-P-M-T-B-H 37 RV se determinaron mediante software de análisis basado en imágenes.

Este gráfico muestra el porcentaje de células infectadas de 5 a 49 en cinco réplicas de IRNA revueltos por círculos azules y din un IRNA representado por círculos rojos. Después de tres días de silenciamiento y cinco días de infección, el porcentaje de células infectadas se reduce a la mitad en un minuto silenciado a 5 49 células en comparación con las células transfectadas con IRNA de codificación no objetivo. Se aplicó una normalización basada en muestras de SI RNA targeted DIN one en comparación con la aleatorización para definir la puntuación Z.

Se obtuvo un promedio de puntuación Z en torno a menos 15 para SI y DIN uno dirigido. Los tres asteriscos representan un valor P inferior a 0,0001. Estos resultados indican que DIN one puede ser utilizado como un control positivo para el si, un cribado para descubrir otros nuevos factores del huésped implicados en la colonización de MTB y neumocitos que podrían tener el mismo fenotipo que el de dins IRNA en el cribado de compuestos de alto contenido.

La eficiencia de los compuestos sobre el crecimiento bacteriano intracelular se evaluó estableciendo una curva de dosis-respuesta o DRC y normalizando a los compuestos positivos y negativos de referencia. En este ejemplo, los macrófagos primarios humanos infectados por la cepa A GFP que expresa MTBH 37 RV se incubaron con 1% de DMSO como control negativo o con concentraciones crecientes de dos compuestos de referencia, isid, INH y rifampicina. RIF. Los macrófagos están marcados con un colorante de fluorescencia rojo y el color verde indica el análisis de MTB de las imágenes de fluorescencia confocal de los macrófagos humanos infectados reveló que los compuestos activos afectan la replicación intracelular de MTB en las células huésped, lo que conduce a una disminución de la carga micobacteriana, que corresponde al área de la señal GFP en las células.

Se calculó la relación entre el área bacteriana intracelular y el área celular total y luego se graficó en función de la concentración de compuestos para generar la DRC, aquí se muestran las DRC de isid y rifampicina en cada gráfico. El DRC del compuesto se normalizó a 1%DMSO, el control negativo y 0,1 microgramos por mililitro isid el control positivo. Estas curvas permiten determinar tanto la concentración requerida para inhibir el 50% de la colonización bacteriana como la concentración mínima requerida para inhibir el 99% de la replicación bacteriana en un semestre.

Esta técnica se puede realizar en 10 horas divididas de la siguiente manera, dos horas para la transfección celular o preparación de compuestos, seis horas para la infección celular y la dispensación en microplaca y dos horas para mantener una adquisición de imágenes. Esto durante un período de ocho días, no olvide que trabajar con mycobacterium tuberculosis puede ser extremadamente como artistas y que siempre se debe llevar precoz, como el uso de equipo de protección personal, incluida una mascarilla, mientras se realiza este procedimiento.