Name: Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Aprende un ensayo fenotípico de microscopía confocal automatizada para cuantificar Mycobacterium tuberculosis intracelular en cribado de alto rendimiento. Este método permite identificar moduladores de la replicación bacteriana y evaluar compuestos terapéuticos potenciales.

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El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Comunidad Europea (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), la Agence Nationale de Recherche, el Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) y la Region Nord Pas de Calais. Agradecemos la asistencia técnica de Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni y Frank Lafont de la plataforma BICeL.

1. Detección de siRNA en todo el genoma de alto rendimiento
La investigación realizada en un tipo humano de los pneumocytes del tipo II modelo A549 la línea de células sobre la infección con mtb H37Rv que expresa la proteína fluorescente verde (GFP). Este procedimiento se describe en la Figura 1A.
<ol><li>Resuspend la biblioteca de siRNA seca que se almacena en placas madre (placas de 96 pozos) con 1x tampón de siRNA para alcanzar una concentración de 4 μM, luego transfiera 10 μl de la mezcla en una placa hija de 384 pozos (placa hija 1).</li>
	<li>Añadir 10 μl de 1x tampón de siRNA en la placa hija 1 para diluir el siRNA por 2 veces. Después de la resuspensión de siRNA, las placas se sellan con sello de aluminio pelable y se pueden almacenar a -20 ° C al menos 6 meses y hasta 2-3 años, pero el tiempo de almacenamiento puede variar dependiendo de las recomendaciones del fabricante de la biblioteca de siRNA.</li>
	<li>Diluir los siRNAs en la placa hija 1 en la placa hija 2 para alcanzar una concentración de 500 nM. Después de la resuspensión de siRNA, las placas se sellan con sello de aluminio pelable y se pueden almacenar a -20 ° C al menos 6 meses y hasta 2-3 años, pero el tiempo de almacenamiento puede variar dependiendo de las recomendaciones del fabricante de la biblioteca de siRNA.</li>
	<li>Antes de su uso, descongelar la placa hija 2 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tome 2,5 μl de siRNA de la placa hija 2 y colóquelos en una placa de ensayo de 384 pozos.</li>
	<li>En la misma placa de ensayo de 384 pozos en el paso 1.5, agregue 2.5 μl de siRNA de control negativo y positivo a sus respectivos pozos.</li>
	<li>Diluya el reactivo de transfección en 1x D-PBS para producir suficiente solución para proporcionar un reactivo de transfección de 0,1 μl en cada pozo y preincuba la solución de transfección diluida a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Añadir 7,5 μl de la mezcla de reactivo de transfección/solución de PBS a cada pozo de la placa de ensayo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 40 μl de células A549 (1.500 células/pozo) suspendidas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS). Mantener las células durante un período de incubación de 3 días a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2. Estas células se dividen cada 24 horas, por lo que unas 12.000 células están en los pozos tres días después de la transfección.</li>
	<li>Lave un cultivo de Mtb H37Rv que exprese GFP de dos semanas de edad con D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)por centrifugación a 4,000 x g durante 5 min y deseche los lavados. Repita este paso 3x. (Para las condiciones de cultivoGFP-Mtb H37Rv, consulte el Protocolo 3).</li>
	<li>Suspender el pellet bacteriano en 10 ml de RPMI 1640 medio suplementados con 10% de FBS y decantar durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos se sedimenten.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante bacteriano y medir OD600 (OD600 debe estar entre 0.6-0.8) y GFP-fluorescencia (valor de RFU) utilizando un lector de microplacas para determinar la concentración bacteriana. Calcule el título de la suspensión utilizando una línea de regresión de referencia que muestre el valor de RFU = f (valor de CFU) que se había generado antes del experimento en otro cultivo que se había preparado en las mismas condiciones. Preparar suspensión bacteriana que contenga 2,4 x 106 bacterias/ml, que corresponde a una multiplicidad de infección (MOI) de 5.</li>
	<li>Retire el medio en la placa de ensayo de 384 pozos y agregue 25 μl de suspensión bacteriana recién preparada.</li>
	<li>Incubar la placa de ensayo de 384 pozos a 37 °C durante 5 horas en una atmósfera que contenga un 5% de CO2.</li>
	<li>Retire el medio y lave suavemente las células con el medio RPMI complementado con 10% FBS 3x.</li>
	<li>Para matar las bacterias extracelulares restantes, trate las células con 50 μl de medio RPMI-FBS fresco que contenga 50 μg/ml de amikacina a 37 °C durante 1 hora en una atmósfera que contenga 5% de CO2.</li>
	<li>Retire la amikacina que contiene el medio y agregue 50 μl de medio RPMI fresco complementado con 10% de FBS. Incubar la placa de ensayo de 384 pozos a 37 °C durante 5 días en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.</li>
	<li>Antes de la adquisición de la imagen, añadir 10 μl de 30 μg/ml de DAPI recién preparados en PBS (concentración final de 5 μg/ml) e incubar durante 10 min a 37 °C.</li>
	<li>Cargue la placa en un microscopio confocal automatizado. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Establezca los parámetros de exposición. Registre la fluorescencia DAPI utilizando láser de excitación de 405 nm con filtro de emisión de 450 nm y fluorescencia GFP utilizando láser de excitación de 488 nm con filtro de emisión de 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Seleccione los pozos y los campos en cada pozo que se va a adquirir, que luego se conoce como parámetros de diseño y subdiseño. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Genere el archivo de experimento utilizando los parámetros de los pasos 1.20 y 1.21 y ejecute la adquisición automática. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Transferir imágenes al servidor remoto. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Evalúe las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes. Detectar núcleos celulares del canal DAPI utilizando el algoritmo de detección de núcleos y el área bacteriana del canal GFP utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles (Figura 4A).</li>
</ol>Nota: Este protocolo está optimizado para estudiar el efecto del silenciamiento génico sobre el crecimiento intracelular de Mtb. Mtb es una bacteria de crecimiento lento que se divide cada 20 horas en condiciones óptimas. Después de 5 días después de la infección, la cantidad de Mtb extracelular sigue siendo baja en ausencia de lisis celular y no afectó la calidad del análisis. Este protocolo debe optimizarse en términos de duración del tratamiento con antibióticos y tiempo de incubación para adaptarse a las pantallas de siRNA utilizando bacterias de crecimiento rápido como Mycobacteria smegmatis y Escherichia coli que se liberan ampliamente y pueden infectar nuevas células.
2. Cribado de compuestos de alto rendimiento
La investigación realizada en las células huésped infectadas mtb H37Rv. Este procedimiento se describe en la Figura 1B.
<ol><li>Descongelar las placas madre de 384 pozos que contienen la biblioteca compuesta solubilizada en DMSO al 100%. Transferir 0,5 μl de los compuestos en placas hijas de 384 pozos que contienen 10 μl de medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10%.</li>
	<li>Lave un cultivo de Mtb H37Rv que exprese GFP de dos semanas de edad con D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)por centrifugación a 4,000 x g durante 5 min y deseche los lavados. Repita este paso 3x (para las condiciones de cultivoGFP-Mtb H37Rv, consulte el Protocolo 3).</li>
	<li>Suspender el pellet bacteriano en 10 ml de RPMI 1640 medio suplementados con 10% de FBS y decantar durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos se sedimenten.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante bacteriano y medir OD600 (OD600 debe estar entre 0.6-0.8) y GFP-fluorescencia (valor de RFU) utilizando un lector de microplacas. Calcule el título de la suspensión utilizando una línea de regresión de referencia que muestre el valor de RFU = f (valor de CFU) que se había generado antes del experimento. La concentración típica es de 1 x 108 bacterias/ml.</li>
	<li>Cosechar 6 días de edad de macrófagos humanos primarios a 4 x 105 células/ml en rpmi 1640 medio complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 50 ng/ml M-CSF humano recombinante (Para la purificación de células de monocitos de sangre periférica humana y la diferenciación de macrófagos ver Protocolo 4).</li>
	<li>Incubar las células primarias diluidas con bacilos a diferentes MOI, variando de 1-5, en suspensión con temblor leve a 90 rpm durante 2 horas a 37 °C.</li>
	<li>Lave las células infectadas por centrifugación a 350 x g para eliminar las bacterias extracelulares. Después de cada paso de centrifugación, resuspend el pellet en rpmi 1640 medio complementado con 10% FBS. Repita este paso 2x.</li>
	<li>Suspender las células infectadas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y amikacina a 50 μg/ml e incubar la suspensión con temblores leves durante 1 hora a 37 °C.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular que contiene amikacina por centrifugación a 350 x g y lave las células infectadas con un medio RPMI 1640 completo complementado con 10% de FBS y 50 ng/ml de M-CSF humano recombinante. Repita una vez.</li>
	<li>Añadir 40 μl de la suspensión de macrófagos infectados en la misma placa de ensayo en el paso 2.1, que ya contiene 10 μl de las diluciones compuestas. La concentración final de DMSO en cada pozo ha alcanzado ahora el 1%.</li>
	<li>Incubar las placas de ensayo durante 5 días a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.</li>
	<li>Manche las células vivas con el tinte fluorescente lejano-rojo célula-permeante.</li>
	<li>Cargue la placa en un microscopio confocal automatizado. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Establezca los parámetros de exposición. Registre la fluorescencia de color rojo lejano utilizando láser de excitación de 640 nm con filtro de emisión de 690 nm y fluorescencia GFP utilizando láser de excitación de 488 nm con filtro de emisión de 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Seleccione los pozos y los campos en cada pozo que se va a adquirir, que luego se conoce como parámetros de diseño y subdiseño. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Genere el archivo de experimento utilizando los parámetros de los pasos 2.14 y 2.15 y ejecute la adquisición automática. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Transferir imágenes al servidor remoto. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a></li>
	<li>Evalúe las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes. Detecte el área celular del canal rojo lejano utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles y el área bacteriana del canal GFP utilizando el algoritmo de propiedades de intensidad de píxeles (Figura 4B).</li>
</ol>Nota: Este protocolo se puede adaptar para la detección de la biblioteca de mutantes Mtb mediante la sustitución de compuestos por mutantes que expresan una proteína fluorescente (un pozo / un mutante) (Figura 1C, véase también Brodin et al. 4). Los mutantes fluorescentes se siembran por primera vez en pozos (20 μl de suspensión bacteriana por pozo). Las bacterias se recuperan entonces por 30 μl de suspensión celular. Después de la centrifugación a 350 x g durante 1 min, la placa se incuba a 37 °C en una atmósfera que contiene un 5% deCO2. El tiempo de incubación y el MOI dependen del ensayo. Como ejemplo, para la visualización de eventos celulares tempranos como la acidificación del fagosoma, las células pueden infectarse durante 2 horas con MOI que van desde 1-20. Los lisosomas se tiñen con tinte Lysotracker a 2 μM durante 1,5 horas a 37 °C en una atmósfera que contiene 5% de CO2 y luego se fijan con formol al 10% o al 4% de paraformadehído (PFA). Las imágenes confocales se adquieren y finalmente se analizan utilizando scripts de análisis de imágenes con algoritmos apropiados para la detección de lisosomas y la localización subcelular4.
3. Proteína fluorescente verde que expresa mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Condiciones de cultivo
Para el almacenamiento a largo plazo, GFP-H37Rv se congelaron en D-PBS (alrededor de 1 x 108 micobacterias por vial).
<ol><li>Resuspend un vial de GFP-H37Rv congelado en un matraz Erlenmeyer que contenga 50 ml de medio caldo 7H9 complementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC al 10%, glicerol al 0,5%, tween-80 al 0,05% e higromicina B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incubar 8 días a 37 °C.</li>
	<li>Mida OD600 de la cultura GFP-H37Rv.</li>
	<li>Diluir el cultivo de GFP-H37Rv para obtener OD600= 0,1 en medio caldo fresco 7H9 suplementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC al 10%, Glicerol al 0,5%, Tween-80 al 0,05% e Higromicina B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incubar el GFP-H37Rv a 37 °C durante 8 días más antes de usarlo para el ensayo.</li>
</ol>4. Purificación de células de monocitos de sangre periférica humana de sangre entera o preparación de capa de Buffy
<ol><li>Diluir la bolsa de sangre 2x en 1x D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)que contiene 1% de FBS.</li>
	<li>Aislar los monocitos por Centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll a 400 x g durante 20 min.</li>
	<li>Recoger los monocitos aislados.</li>
	<li>Lavar los monocitos 3x con 1x D-PBS (libre de MgCl2 y CaCl2)que contiene 1% de FBS por centrifugación a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Concentrar las células hasta 1 x 107 células/ml.</li>
	<li>Purificar monocitos usando perlas magnéticas CD14 de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Materiales).</li>
	<li>Después de la purificación de los monocitos CD14, sembraron las células a 1,5 x10 6 células/ml en RPMI 1640 complementadas con 10% de FBS y 40 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (hM-CSF) e incubadas durante 4 días a 37 °C en una atmósfera que contiene 5% de CO2.</li>
	<li>Después de 4 días sustituir el medio por RPMI 1640 fresco complementado con 10% de FBS y 40 ng/ml de hM-CSF e incubado durante 2 días a 37 °C en una atmósfera que contiene un 5% deCO2.</li>
	<li>Después de 6 días, las células se pueden utilizar para el ensayo.</li>
</ol>

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Se describen aquí los métodos necesarios para un ensayo fenotípico utilizando una cepa de Mtb H37Rv que expresa GFP para infectar las células huésped etiquetadas fluorescentemente, lo que lo hace apropiado para pantallas de alto contenido / alto rendimiento. Este protocolo podría aplicarse a una amplia gama de compuestos, sondas fluorescentes y mutantes mtb. Para cada protocolo descrito anteriormente, se podrían realizar pasos de fijación e inmunoetiquetado antes de la adquisición de imágenes. Utilizamo...

Entre los patógenos infecciosos emergentes y reemergentes reportados durante los últimos años, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)ocupa un lugar destacado siendo responsable de 1,4 millones de muertes y 8,7 millones de nuevas infecciones en 2011 (Informe Mundial de Tuberculosis 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). A pesar de la disponibilidad de terapias multidrogas, el número de personas infectadas sigue en aumento y el Mtb multirresistente (MDR) y ampliamente farmacorresistente (XDR) se está extendiendo rápidamente por todo el mundo1. Por otra parte, si se tiene en cuenta la presencia de antígenos mtb, es evidente que un tercio de la población mundial se considera que está infectada latentemente por mtb. Estadísticamente, en un caso de cada diez, hay evolución hacia la forma activa de la enfermedad con síntomas clínicos posteriores2. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevos medios para luchar contra el Mtb. En este contexto, desarrollamos un ensayo fenotípico visual in vitro basado en el seguimiento de la invasión de Mtb y la multiplicación en las células huésped mediante microscopía de fluorescencia confocal automatizada3. La adaptación del ensayo en placas de microtíter de 384 pozos en combinación con la adquisición y el análisis automatizados de imágenes, permitió la detección de alto contenido / alto rendimiento (HC / HTS) de bibliotecas de escala media de compuestos, siRNAs y mutantes bacterianos. La investigación de una biblioteca amplia del genoma RNAi en este análisis fenotípico permitió así la identificación de los anfitrión-factores dominantes implicados en tráfico de Mtb y la réplica intracelular pero también la aclaración de los anfitrión-caminos explotados por el bacilo del tubérculo. Otra adaptación de este análisis fenotípico particular estaba para la identificación de los factores bacterianos esenciales a la persistencia intraphagosomal del Mtb. Por ejemplo, la detención de la maduración del fagosoma se considera como uno de los principales mecanismos que facilita la supervivencia y replicación de Mtb en los macrófagos. El monitoreo de la localización subcelular de mutantes knock-out mtb en compartimentos fluorescentemente etiquetados como ácidos permitió la identificación de genes bacterianos involucrados en el proceso de supervivencia4. Finalmente, la imagen de alto contenido de Mtb también ofrece un excelente método para cuantificar la eficiencia de los fármacos para inhibir diversos fenómenos como el crecimiento bacteriano intracelular3. En conjunto, este tipo de ensayo fenotípico de alto rendimiento permite acelerar el descubrimiento de fármacos contra la TB y los datos recogidos por estos diferentes enfoques contribuyen a una mejor comprensión de la manipulación del huésped ejercida por Mtb.

<table><tbody><tr><td>y micro; placa transparente negra, 384 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781091</td><td>127,8/86/15 MM con tapa, CellCarrier tratado TC</td></tr><tr><td>Placa de 384 pocillos</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>negro, fondo transparente, con tapa, blanco con</td></tr> fondo en V tratado TC<tr><td>, placa de 384 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cinta de sellado, transpirable, estéril</td><td>Corning</td><td>3345</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco&#039; s Tampón de salina de fosfato</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-091</td><td>Dulbecco&#039; s Tampón de salina de fosfato</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>2610040-79</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll Paque PLUS</td><td>Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>Ficoll para la purificación periférica de células de monocitos</td></tr><tr><td>sanguíneos CD14 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi</td><td>130-050-201</td><td>Purificación de monocitos CD14+</td></tr><tr><td>M-CSF humano, premium gr. (1000 &mu; g)</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-493</td><td>Columnas de factor estimulante de colonias de macrófagos</td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Columnas para el aislamiento de monocitos CD14+</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Euromedex</td><td>2002-A Cultivo de</td><td>micobacterias</td></tr><tr><td>Glicerol de alta pureza&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>50405-EX Cultivo de</td><td>micobacterias</td></tr><tr><td>&nbsp; Middlebrook OADC enriquecimiento</td><td>Becton-Dickinson</td><td>211886</td><td>Cultivo de micobacterias</td></tr><tr><td>7H9</td><td>Becton-Dickinson</td><td>W1701P Cultivo</td> de <td>micobacterias</td></tr><tr><td>Versene 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15040033</td><td>solución de disociación de células no enzimáticas</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Colorante de núcleos</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Tinte de núcleos</td></tr><tr><td>Syto60</td><td>Life Technologies</td><td>S11342</td><td>Colorante de núcleos/citoplasma</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014</td><td>Solución de fijación celular</td></tr><tr><td>siRNA dirigido a Dectina-1</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-63276</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*siGenome* Pool de siRNA no dirigido&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Isoniazida (INH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3377-50G</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Amikacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1774</td><td>antibiótico Microscopio</td></tr><tr><td>confocal automatizado OPERA</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Columbus 2.3.1 Base de datos de servidor</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Transferencia, almacenamiento y análisis de datos</td></tr><tr><td>Acapella 2.6 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Análisis basado en imágenes</td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism5</td> Análisis <td>estadístico</td><td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Análisis estadístico</td></tr></tbody></table>

un ensayo fenotípico microscópico para la cuantificación de micobacterias intracelulares adaptadas para la detección de alto rendimiento / alto contenido

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

A pesar de la disponibilidad de terapia y vacuna, la tuberculosis (TB) sigue siendo una de las infecciones bacterianas más mortales y extendidas del mundo. Desde hace varias décadas, la explosión repentina de cepas multirresistentes y ampliamente resistentes a los medicamentos es una grave amenaza para el control de la tuberculosis. Por lo tanto, es esencial identificar nuevas dianas y vías críticas para el agente causal de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)y buscar nuevos productos químicos que podrían convertirse en fármacos contra la tuberculosis. Un enfoque es establecer métodos adecuados para las pantallas genéticas y químicas de bibliotecas a gran escala que permitan la búsqueda de una aguja en un pajar. Con este fin, desarrollamos un ensayo fenotípico que se basa en la detección de Mtb marcado fluorescentemente dentro de las células huésped etiquetadas fluorescentemente utilizando microscopía confocal automatizada. Este ensayo in vitro permite una cuantificación basada en imágenes del proceso de colonización de Mtb en el huésped y se optimizó para el formato de microplaca de 384 pozos, que es adecuado para pantallas de bibliotecas de mutantes de siRNA, compuestos químicos o Mtb. Las imágenes se procesan entonces para el análisis multiparamétrico, que proporciona la lectura hacia fuera que infiere en la patogenesia del Mtb dentro de las células huesped.

Detección de siRNA en todo el genoma de alto rendimiento
Mtb es capaz de colonizar las células inmunes in vitro, así como varias otras células epiteliales pulmonares. Por ejemplo, Mtbes capaz de infectar y dañar las células epiteliales A549 que se utilizan comúnmente como modelo para los neumocitos humanos tipo II5-7. La dectina-1 fue reportada como un receptor de células huésped implicado en la captación de Mtb, la respuesta proinflamatoria y el efe...

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

El objetivo general de este procedimiento es medir el efecto de moduladores del fenotipo, como la silenciación de genes del huésped o el impacto de moléculas pequeñas, sobre la replicación intracelular de Mycobacterium tuberculosis. Esto se logra primero dispensando moléculas pequeñas en placas de 384 pocillos o transfectando células con ARNi y formando complejos. El siguiente paso consiste en infectar las células con Mycobacterium tuberculosis que expresa la proteína verde fluorescente (GFP-MTB), añadir las células a los pocillos que contienen la molécula pequeña e incubar la microplaca durante cinco días.Para el enfoque de ARNi, agregue células en pozos que contengan complejos de transfección de ARNi. Incube la microplaca durante tres días y luego infecte las células con Mycobacterium tuberculosis que expresa G-F-P-M-T-B. Después de teñir las células, el paso final consiste en leer las placas utilizando un microscopio confocal automatizado.Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia automatizada seguida de análisis basado en imágenes para medir los cambios en el crecimiento intracelular de G-F-P-M-T-V. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como

a-microscopic-phenotypic-assay-for-quantification-intracellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Se describe un método alternativo para la enumeración de las...

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Un ensayo parásito-rescate y la transformación con células THP1...

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Un nuevo método de evolución dirigida específicamente al ámbito de la ingeniería termoestabilidad fue desarrollado y validado tanto para las enzimas bacteriolíticas. Después de sólo una ronda de mutagénesis al azar, una enzima bacteriolítica evolucionado, PlyC 29C3, muestra mayor que el doble de la actividad residual en comparación con la proteína de tipo salvaje después de incubación a temperatura elevada.

Un método de screening para la evolución dirigida de enzimas termoestables bacteriolítica

Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Aprende un ensayo fenotípico de microscopía confocal automatizada para cuantificar Mycobacterium tuberculosis intracelular en cribado de alto rendimiento. Este método permite identificar moduladores de la replicación bacteriana y evaluar compuestos terapéuticos potenciales.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido (Video) | JoVE Journal

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

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