Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

En tejidos de mamíferos compuestos por múltiples tipos de células diferentes, el advenimiento de la instrumentación de microdisección de captura láser (LMD) ha brindado la posibilidad de seleccionar un tipo de célula específica para su análisis a nivel de ARN o proteína. En la actualidad, la amplificación y las técnicas de secuenciación de próxima generación permiten el uso de una reserva de ARN total de unos pocos miles de células para obtener un inventario relativamente completo del transcriptoma, incluida la evaluación de los niveles relativos de ARN y la identificación de varias formas empalmadas. Hasta la fecha, los análisis proteómicos de unos pocos miles de células llegarán a través de especies más abundantes. Por ejemplo, hemos identificado <1,000 de las proteínas más abundantes de 3,000-4,000 cuerpos celulares de neuronas motoras (no mostradas), y Zhu y sus compañeros de trabajo han reportado recientemente la identificación de 2,665 proteínas de ~ 15,000 células tumorales¹. Sin embargo, con nuevos desarrollos de la espectrometría de masas, es probable que tales análisis se extiendan a una profundidad mucho mayor.

Aquí, presentamos un protocolo específico utilizado para LMD de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratones, seguido de la preparación de ARN. Este protocolo se utilizó en el contexto de la comparación de ARN de neuronas motoras de ratones mutantes transgénicos presintomáticos de superóxido dismutasa (SOD)1 de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) con ARN preparados a partir de una cepa transgénica de tipo salvaje SOD1 por validación de ARN-seq y qRT-PCR^2. En particular, las neuronas motoras, en el cuerno anterior de la materia gris en la médula espinal, comprenden <10% de la población celular total, rodeadas por un mar de astrocitos, y como tal, su perfil transcripcional no puede ser fácilmente desconvolucionado de los estudios de toda la cuerda. Un acercamiento de la captura del laser es así ideal para analizar la expresión del ARN en estas células, con la fisiología preservada excising y congelando rápidamente la cuerda que sigue la breve perfusión salina intracardiaca. Los somata de la neurona de motor son grandes y son así fácilmente perceptibles, aquí usando un tinte que tenga afinidad fuerte para las neuronas^3. Además, con tal tamaño, estas células proporcionan una cantidad relativamente grande de ARN por célula capturada. El procedimiento utilizado, como se detalla a continuación, podría ajustarse fácilmente para obtener otros tipos de células neuronales, así como potencialmente otros tipos de células, identificados específicamente por técnicas de tinción de tintes o por tinción de anticuerpos.

Los procedimientos descritos aquí para la anestesia, la eutanasia, y la perfusión cardiaca de ratones fueron realizados bajo protocolo aprobado por el comité institucional del cuidado y del uso animal de la universidad de Yale.

1. Preparación de instrumentos y soluciones libres de ARNasa

1. La ARNasa es un contaminante común de todas las superficies de laboratorio, incluyendo las tapas de banco, las micropipetas y el investigador.
   1. Cambie los guantes con frecuencia o regularmente limpie con una solución descontaminante de RNAse.
   2. Las herramientas de disección de acero inoxidable y la cristalería se pueden hacer libres de ARNasa calentando a >200 ° C durante 1 hora o más. Nota: La esterilización por vapor no destruye la ARNasa. Alternativamente, limpie con una solución descontaminante de RNase, luego con etanol al 70% libre de ARNasa y seque al aire.
   3. Limpie los bancos, otras superficies de laboratorio y micropipettors con la solución descontaminante de la ARNasa, entonces con el etanol 70% RNase-libre. Designe un banco de laboratorio específico o un área de trabajo para la recuperación y el análisis del ARN. Nota: Retire los eyectores de punta antes de limpiar los ejes de los pipeteadores y déjelos apagados, si es posible.
   4. Use tubos, tubos de microcentrífugas, pipetas y puntas de micropipetas que estén certificados por su fabricante como libres de ARNasa. Se recomienda el uso de puntas de unión muy bajas y microtubos. Si es posible, use cajas o bolsas recién abiertas de estos componentes y manténgalas separadas del suministro general de laboratorio.
   5. Obtenga soluciones libres de ARNasa [PBS (PBS) sin calcio y magnesio de Dulbecco, etanol, etanol al 70% sin ARNasa] de fuentes comerciales. Use botellas recién abiertas para cada experimento.
2. La fuente del tinte Azure B es fundamental para la recuperación exitosa del ARN intacto. Pruebe cada lote de tinte antes de comprometer muestras preciosas para la tinción y la recolección. Recoger unos pocos miles de neuronas de un animal no experimental, preparar el ARN, y determinar la integridad del ARN como se describe a continuación para encontrar uno que produce consistentemente números de RIN por encima de 8.5.
   1. Disuelva el colorante Azure B (1%, peso/vol) en etanol al 70% libre de ARNasa, típicamente 0,3 g en etanol de 30 ml en un tubo centrífuga de 50 ml. Mezcle bien en un balancín en RT durante la noche o hasta que todas las partículas se hayan disuelto. Un tubo de esta solución se puede utilizar para teñir múltiples portaobjetos sin afectar la intensidad de la tinción.
   2. Como precaución, utilice un tubo diferente de mancha para cada réplica biológica.
3. Use los cryomolds y O.C.T. para incrustar secciones del cordón sin tratamiento adicional.
4. Mantenga el criostato a -20 a -24 °C. Después de sececcionar, coloque las guías en un congelador de -80 °C hasta que se haya preparado un número suficiente. Comience la preparación del ARN tan pronto como sea posible después de que se hayan hecho las diapositivas. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga los bloques OCT no seccionados o parcialmente seccionados, en lugar de los portaobjetos, a 80 °C.
5. Haga el almacenador intermediario del tiocianato de guanidina para la preparación del ARN de las neuronas de motor disecadas usando las soluciones proporcionadas por el fabricante del kit de preparación del ARN según sus instrucciones.

2. Preparación de secciones de la médula espinal de ratones (Figura 1A)

1. Limpie todas las herramientas de disección, portaobjetos de vidrio, cuchillas de afeitar y plataforma de disección horneando o limpiando con una solución descontaminante de RNasa, seguida de etanol al 70% libre de ARNasa. Dejar secar durante 2 min. Mantenga todo libre de polvo cubriéndolo con toallitas de laboratorio.
2. Los procedimientos de manipulación de animales, incluida la anestesia, la perfusión cardíaca y la eutanasia, deben llevarse a cabo de acuerdo con los requisitos del comité institucional local de cuidado y uso de animales (IACUC), con el objetivo de llevar rápidamente al animal al punto de disección de la médula espinal.
   1. Anestesiar el ratón mediante la inyección intraperitoneal (ip) de una dosis letal de ketamina (450 mg/kg).
   2. Una vez que se alcanza un nivel profundo de anestesia y se confirma por la falta de una respuesta de dedo del pie-pellizco, coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en una plataforma de disección (una tabla de poliestireno, por ejemplo), abra la cavidad torácica para exponer el corazón e inserte la aguja de mariposa de 27 G de un conjunto de infusión en el ventrículo izquierdo (que está a la derecha del investigador). Mella la aurícula derecha con un pórceps agudo, y perfundir con PBS a una velocidad de 5-7 ml/min durante aproximadamente 2 min usando una bomba peristáltica. El líquido que fluye de la aurícula debe estar en gran parte libre de sangre en este punto.
   3. Retire la aguja de perfusión, decapitar el ratón y darle la vuelta en el tablero de disección. Abra la piel para exponer la columna vertebral, use pequeñas tijeras y desobósceros para extraer las vértebras y levante la médula espinal mientras corta las raíces nerviosas con un pórceps afilado. La velocidad y la práctica son esenciales para moverse desde el inicio de la perfusión hasta la extracción del cordón; esto no debe tomar más de 7 min.
   4. Enjuague el cordón durante 10 segundos en agua sin ARNasa para lavar cualquier sangre residual. Coloque la médula espinal en un portaobjetos de vidrio libre de ARNasa con un fórceps curvo muy suavemente pero rápidamente. Divida la médula espinal transversalmente usando una cuchilla de afeitar limpia en 9-10 piezas.
   5. Coloque las piezas en un cryomold lleno de O.C.T. usando los mismos pórceps, y alinee verticalmente usando una aguja limpia. Coloque el molde en una bandeja poco profunda que contenga 2-metilbutano preenfriado con nitrógeno líquido, y luego coloque la bandeja en un baño de nitrógeno líquido para congelar rápidamente las piezas de la médula espinal para evitar la degradación del ARN.
   6. Guarde el bloque integrado en OCT a -80 °C durante un hasta 6 meses antes de sección. El proceso desde la recuperación del cordón a través de la congelación debe realizarse dentro de los 5 min para mantener la integridad del ARN.
3. Criosección del bloque incrustado en O.C.T. a -20 °C con un criostato para producir rebanadas de 20 μm, cada una conteniendo 9-10 secciones transversales de la médula espinal, en portaobjetos de membrana PEN de 2 μm sin ARNasa mantenidos inicialmente a temperatura ambiente para garantizar que las secciones se adhieran al portaobjetos. Vuelva a congelar inmediatamente la sección en una superficie de -20 °C dentro del criostato. Mantenga las guías a -80 °C hasta que se utilicen.

3. Tinción de las secciones de la médula espinal (Figura 1A)

1. En un estante limpio, coloque seis tubos cónicos de 50 ml. Llénelos todos con 25-30 ml de etanol al 70% libre de ARNasa, de modo que la profundidad sea suficiente para cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando el portaobjetos esté sumergido. Haga 30-35 ml de solución 1% de Azure B como se describió anteriormente y manténgala en el mismo bastidor para minimizar el tiempo entre el cambio de soluciones durante el lavado o la tinción. Mantenga tres o cuatro toallitas de laboratorio frente al estante para drenar la solución adicional rápidamente.
2. Saque los portaobjetos del congelador de -80 °C sobre hielo seco. Descongelar un portaobjetos colocándolo en una palma enguantado. Elimine la mayor parte de la humedad y la condensación en el portaobjetos limpiándolo con una toallita de laboratorio, teniendo cuidado de no tocar las secciones. Coloque el portaobjetos en gel de sílice fresca desecante en una placa de Petri durante 30-40 segundos para secar completamente. Si la humedad del laboratorio es alta, se puede utilizar un tratamiento breve en un dessicador al vacío para secar el portaobjetos más rápidamente.
3. Lavado y tinción.
   1. Sumerja el portaobjetos seco en el primer tubo de etanol al 70% libre de ARNasa. Remoje la diapositiva durante 30 segundos, luego lave la diapositiva para quitar la OCT sumergiéndola hacia arriba y hacia abajo durante 45-60 seg. Saque el portaobjetos de la solución y drene el exceso de líquido en las toallitas de laboratorio. Repita el mismo proceso sumergiendo el portaobjetos en el segundo tubo de etanol al 70%. Si la OCT alrededor de las secciones de la médula espinal no ha desaparecido por completo, repita el lavado en el tercer tubo.
   2. Después de drenar el exceso de líquido, sumerja el portaobjetos en una solución De Azure B al 70% en etanol libre de ARNasa al 70% durante 30-45 segundos. Drene el exceso de Azure B en una toallita de laboratorio; en este punto, toda la diapositiva será azul.
   3. Sumerja el portaobjetos en el siguiente tubo de etanol al 70%, y sumerja hacia arriba y hacia abajo rápidamente 3-4x para eliminar el exceso de tinte y hacer visible la tinción específica de la neurona motora. Si las secciones se ven muy oscuramente teñidas, repita el paso de detención en un tubo fresco de etanol al 70%. Si la tinción parece demasiado ligera, devuelva la diapositiva a la solución de Azure B durante otros 30 segundos y repita la detención. Limpie el exceso de etanol y seque al aire el portaobjetos durante ~ 40 segundos hasta que todo el líquido se haya ido. La materia gris será azul claro, mientras que las neuronas motoras se tiñerán de azul profundo, que es fácilmente visible. Comience la disección inmediatamente.

4. Microdisección de captura láser (LMD) (Figura 1B)

1. Encienda el microscopio y descargue el soporte del tubo para colocar la tapa de un tubo de microfugio de 0,6 ml para la recolección de muestras. Coloque un tampón de lisis de guanidina tiocianato de 30 μl en la tapa de un tubo de microfugio de 0,6 ml. Cubra la superficie de la tapa con líquido extendiendo la solución con una punta de pipeta. De esta manera, todas las neuronas recolectadas se disolverán en solución solubilizante a medida que se diseccionan. Alinee la tapa con el agujero y el objetivo con el software del microscopio. Mantenga la tapa en la posición cubierta hasta que comience la captura láser.
2. Coloque el portaobjetos secado al aire en el escenario del microscopio LMD boca abajo, de modo que la membrana del portaobjetos PEN se encarcete hacia abajo. La membrana con secciones debe enfrentarse al agujero, debajo del cual se encuentra el tubo de recolección.
3. Encienda el láser 10 minutos antes de comenzar la preparación de la diapositiva. Concéntrese en una sección de la médula espinal con el objetivo 5X. Pasar al objetivo 20X para la disección.
   1. Marque una región "ficticia" con el lápiz de luz y permita que el láser la corte sin recogerla. Esto relaja la membrana pen y hace posible marcar y cortar múltiples regiones sucesivamente.
   2. Reenfoque e identifique las neuronas motoras en la región del cuerno ventral. Estas neuronas son reconocibles por su ubicación, su morfología piramidal, su gran tamaño y su color azul oscuro con Azure B (Figura 2).
   3. Usando el lápiz de luz, seleccione la herramienta de dibujo y marque a lo largo del borde de las neuronas motoras, haciendo un contorno completo. Trate de hacer el contorno lo más cerca posible de la neurona motora para evitar la contaminación de las células que no sean la neurona motora. (Pruebe algunas secciones de antemano para ver qué tan ancha es la línea de corte del láser y ajuste la holgura según sea necesario). Marcar varias células antes de cortar; el software recordará las posiciones.
   4. Traiga la tapa debajo de la posición de corte haciendo clic en la posición de la tapa. Haga clic en el botón de inicio para iniciar la disección de la neurona motora con el láser. Recoger todas las neuronas motoras de todas las secciones en una diapositiva en la tapa de un tubo de microfugio.
   5. Una vez completada la recolección, saque el tubo de microfuge del soporte descargando la bandeja y desalojando suavemente el tubo. Disuelva completamente las neuronas motoras en el tampón pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Mueva la solución al cuerpo del tubo centrifugándose a 14.000 x g durante 2 min a 4 °C. Congele la muestra inmediatamente en hielo seco y guárdela a -80 °C. Este proceso, desde la tinción de diapositivas hasta la recolección de neuronas motoras, debe realizarse dentro de los 30 minutos de un portaobjetos para minimizar la degradación del ARN.

5. Preparación de ARN de las neuronas motoras

Descongelar todas las neuronas recolectadas de un animal y agruparlas para extraer ARN. Las muestras pueden verse de color azul pálido dependiendo del número de neuronas motoras (teñidas con Azure B) en ellas. Extraiga el ARN utilizando un kit adecuado de acuerdo con el protocolo previsto para el tejido LMD, eluting en el mínimo volumen posible. Tome 1 μl para comprobar la cantidad y la integridad de la muestra. Congele rápidamente el ARN restante en hielo seco y almacénelos a -80 °C.

6. Determinación de la calidad y cantidad de ARN

Determinar la calidad del ARN con la muestra de 1 μl en un chip de microfluídica de electroforesis capilar según el protocolo del fabricante. Las preparaciones totales del ARN con un número de la integridad del ARN (RIN) sobre 8,5 se pueden utilizar para el ARN-seq y el qRT-PCR. La salida de datos también suele incluir la concentración aproximada de la muestra.

El protocolo descrito anteriormente y en la Figura 1 debe producir 50 ng o más de ARN total con un RIN de >8.5 de 3,000-4,000 cuerpos celulares de la neurona motora de la médula espinal disecados de las rebanadas de 9-10 20 μm en aproximadamente 20 diapositivas PEN. Debido a que este número de diapositivas representa menos del 10% de un bloque incrustado en O.C.T. de la médula espinal de un ratón, es posible volver al bloque, que se ha almacenado a -80 ° C, y cortar más rebanadas para pasar por otra ronda de preparación de ARN. Si se necesitan mayores cantidades de ARN para un análisis, es mejor hacer solo el número de diapositivas(por ejemplo, 20) a la vez que se pueden procesar a través de la disección y la preparación de ARN en unos pocos días, luego hacer más diapositivas para una segunda ronda y combinar los productos. Asegúrese de revisar primero el RIN de cada preparación para evitar combinar una buena con una mala. Los métodos de ARN-seq son cada vez más sensibles y las nuevas tecnologías de PCR prometen una sensibilidad más alta que las actuales. Por lo tanto, se requerirá menos ARN de menos cuerpos celulares neuronales, lo que permitirá una mayor profundidad de secuenciación y una validación más completa de los aciertos interesantes. Por otro lado, la plena adhesión a las recomendaciones del MIQE para el análisis y validación de qRT-PCR4 puede requerir cantidades mayores para permitir las reacciones de control necesarias para los RNAs de baja abundancia.

La Figura 2 muestra una serie típica de imágenes de una porción de una sección del cuerno ventral de la médula espinal después de la tinción y disección de Azure B. En el panel A, los cuerpos celulares grandes y oscuramente teñidos son neuronas motoras, confirmadas por la tinción de anticuerpos anti-Chat2,y se diferencian fácilmente de las células vecinas más pequeñas. El panel B muestra la misma región con cuerpos celulares individuales delineados con la pluma de luz y numerados por el software del microscopio. Los contornos siguen de cerca los márgenes de los cuerpos celulares, con una pequeña asignación para el ancho de corte del láser. Este espaciamiento tiene que ser determinado para cada ajuste de potencia láser para minimizar la inclusión de material extraño evitando al mismo tiempo la pérdida de citosol de la neurona motora. Los paneles C y D muestran la sección después de que el láser ha cortado y los cuerpos celulares individuales han caído en la tapa de la colección. Observe que el margen de corte no sigue exactamente el contorno de la pluma de luz en el panel C, pero en gran medida permanece fuera de él. Esta irregularidad es evidente en el panel D, al igual que el área oscureceda alrededor de cada corte, que refleja el daño térmico al tejido causado por el láser. Debido a esto, si dos cuerpos celulares están muy cerca el uno del otro, es mejor delinearlos para un solo corte, en lugar de tratar de cortarlos por separado y perder algo de ARN por daño térmico en su región de contacto cercano.

La Figura 3 muestra los resultados típicos de un análisis electroforético de la integridad del ARN de una muestra de ARN preparada a partir de ~4.000 cuerpos celulares de neuronas motoras de ratón recogidos por LMD. El panel superior es el electroferograma producido por 1 μl del ARN total; el recuadro de la derecha es una imagen del gel. En ambos, tenga en cuenta los picos de ARN ribosómico prominentes. El panel inferior es el electroferograma del carril que contiene los estándares de tamaño de ARN. El software de análisis calculó un RIN de 9,8 para esta muestra, con una concentración de 4,9 ng/μl. Un total de 13 μl de esta solución estuvo disponible después del análisis, proporcionando 64 ng de ARN para la validación de qRT-PCR aguas abajo de las cantidades de transcripción. Para un análisis típico de qRT-PCR de transcripciones moderadamente abundantes, 0,15-0,20 ng de ARN total es suficiente para producir una cuantificación precisa2,por lo que la cantidad de ARN disponible a partir de esta preparación es suficiente para validar un número de transcripciones con múltiples conjuntos de cebadores, como se recomienda4. Por supuesto, se pueden utilizar cantidades más grandes de ARN de entrada para permitir la validación de transcripciones raras. Esta cantidad también es más que suficiente para permitir la preparación de bibliotecas y la próxima generación de ARN-seq.

Figura 1. Descripción de la producción de la rebanada de la médula espinal y del microdissection de la captura del laser de los cuerpos celulares de la neurona de motor de la médula espinal. A)Pasos importantes en la producción y tinción de rodajas. B)Vista caricaturesca de la sección de la médula espinal y la disección láser. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 

Figura 2. Antes-y-después de imágenes de una disección del laser del azur B manchó cuerpos de la célula de la neurona de motor. A)Una porción del cuerno ventral de una sección manchada. Tenga en cuenta las cuatro células grandes, teñidas de oscuro. También hay algunas células ligeramente teñidas y algo más pequeñas, que no son neuronas motoras (confirmadas por la tinción de anticuerpos anti-Chat; no se muestran, pero ver Bandyopadhyay2) y que no serán seleccionadas para la disección. Las muchas manchas pequeñas y oscuras son probablemente procesos neuronales (dendritas y axones), pero esto no se ha confirmado. B)Los cuatro cuerpos celulares delineados con la pluma de luz. Tenga en cuenta que los contornos siguen de cerca los márgenes de las celdas, con una distancia mínima entre ellos. Este espaciamiento debe establecerse empíricamente para cada microscopio y láser. El software numera las neuronas individuales, lo que simplifica el seguimiento de cuántas se han recopilado. C y D) Después de que el láser ha cortado y las piezas que contienen los cuerpos celulares han caído en la tapa de la colección. Tenga en cuenta que el agujero dejado atrás es algo más grande que el contorno y es irregular. Esto refleja el ancho del rayo láser y su eficiencia de corte ligeramente variable dependiendo de la composición local del tejido. También es evidente el borde del tejido oscurecido que rodea cada agujero debido al daño de calentamiento local causado por el láser. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Análisis electroforético de la integridad del ARN preparado a partir de muestras de LMD. A)Una alícuota de 1 μl del ARN preparado a partir de ~4.000 cuerpos celulares de neuronas motoras por el protocolo anterior se analizó por electroforesis microcapilar en un chip de microfluídica. Se muestra el electroferograma, con picos de ARN ribosómico prominentes. A la derecha hay una imagen del gel en sí. B)Se muestra el electroferograma de las normas de talla, con el carril de gel correspondiente a la derecha. El software del instrumento calculó un RIN de 9,8 para esta muestra y una concentración de 4,9 ng/μl. Haga clic aquí para ver una imagen más grande.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.