Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Summary

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Abstract

Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores. _content "> Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5.

El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.

Introduction

Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante.

Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) por un tiempo real sensibles PCR. También describe el uso de software para análisis de datos, incluyendo el análisis estadístico y representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente fácil y sencillo y, en función del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR en tiempo real disponibles, también relativamente rápidos. La parte experimental requiere precisión en el manejoARN y el pipeteo en placas de 384 pocillos, mientras que la sección de análisis de datos utilizando de GenEx requiere algunos conocimientos básicos en informática y estadística.

Protocol

El siguiente protocolo describe el procedimiento estándar para aislar el ARN de CSF y de perfil microRNAs utilizando placas PCR listos. Tenga en cuenta que la extracción en fase orgánica es opcional, y que un ARN transportador se añade a la muestra durante la extracción asegurar la recuperación máxima de ARN. En consecuencia, no hay necesidad de cuantificar el ARN.

En general, un promedio de 6-8 placas se puede ejecutar en un día si el ADNc se sintetiza el día antes (aproximadamente 2 horas). Análisis de los datos se realiza cuando todas las muestras se han perfilado y se cargan en el software. Dependiendo del número de muestras / grupos o su combinación para la comparación, el análisis de datos puede requerir de una a varias horas.

1. La extracción de RNA

La extracción de ARN se realizó a partir de muestras de LCR, se almacenaron congeladas a -80 ° C en alícuotas hasta su análisis. Para este procedimiento se utilizó el kit de aislamiento mirVana París, siguiendo instrumento del fabricantecciones para el aislamiento de ARN total. Tenga en cuenta que, a pesar de enriquecimiento para las pequeñas especies de ARN es posible con este equipo, este paso no se hace y el procedimiento de extracción de ARN se terminó después de la etapa de aislamiento total de ARN. Además, aunque el kit de aislamiento de mirVana París (al igual que otros kits de aislamiento de ARN disponible comercialmente) no requiere la extracción de orgánicos, un protocolo para este procedimiento se puede encontrar a continuación.
El protocolo para la extracción de ARN consta de dos pasos:
1.1. Extracción Orgánica (no es necesario si se utiliza el kit de extracción de RNA mirVana Paris)
1.2.2. Aislamiento de ARN total

1.1. Extracción orgánica

1.1.1. Preparar reactivos

1. Añadir 375 l de 2-mercaptoetanol a 2x solución desnaturalizante, y almacenarlo a 4 ° C.

1.1.2. Prepare el CSF

1. Descongele cada alícuota de CSF en hielo antes de la extracción de RNA. Añadir 1 g de ARN portador MS2 a 0,5 ml de LCR descongelado y suavementemezclar. Tenga en cuenta que si la extracción orgánica se omite, se añadirá el portador MS2 a la muestra de aislamiento de ARN antes descrito en 1.2.2.1 a continuación.
2. Mezclar 0,5 ml de 2x solución desnaturalizante a temperatura ambiente a la LCR.
3. Añadir 1 ml de ácido-fenol: cloroformo a la CSF más la solución desnaturalizante 2x: asegúrese de retirado la fase inferior que contiene ácido-fenol: cloroformo, no el tampón acuoso que se encuentra en la parte superior de la mezcla. Además, tenga en cuenta que el ácido fenol: cloroformo contiene fenol, que es un veneno y un irritante, use guantes y otros equipos de protección personal cuando se trabaja con este reactivo.
4. Vortex durante 30-60 segundos para mezclar. Por conveniencia, los 2 ml de muestra / solución desnaturalizante / ácido-fenol: cloroformo mezcla se dividen en dos tubos Eppendorf de 1,5 ml.
5. Centrifugar durante 5 min a velocidad máxima (10.000 x g) a temperatura ambiente.
6. Retire con cuidado la fase acuosa (superior) sin perturbar la fase inferior o la interfase y transferirlo a untubo fresco. Tenga en cuenta el volumen recuperado.

1.2. Aislamiento de ARN

Se recomienda contar con un banco dedicado, juego de pipetas y bastidores para el manejo de muestras de ARN. La zona de trabajo y herramientas se descontaminan utilizando aerosol RNasa Zap y toallitas antes de cada experimento.

1.2.1. Preparar reactivos:

1. Añadir 21 ml de etanol al 100% a los genes miARN Solución de lavado 1 y 40 ml de etanol 100% a la solución de lavado 2/3. Tenga en cuenta que miRNA Wash Solution 1 contiene tiocianato de guanidina que es una sustancia potencialmente peligrosa.

1.2.2. Aislamiento de ARN total

1. Añadir 1,25 volúmenes de temperatura ambiente 100% de etanol a la fase acuosa de la extracción orgánica y mezclar bien.
2. Coloque un cartucho de filtro en uno de los tubos de recogida.
3. Pipeta no más de 700 l de la mezcla de lisado / etanol en el cartucho del filtro.
4. Centrifugar durante 30 segundos a máximavelocidad. Aplique la mezcla superior a 700 l en aplicaciones sucesivas con el mismo filtro. Deseche el flujo continuo después de cada centrifugación y guardar el tubo de recogida para los pasos de lavado.
5. Aplicar 700 l miRNA Wash Solution 1 para el cartucho del filtro y centrifugar durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.
6. Aplicar 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Aplique una segunda 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Girar el conjunto durante 1 min a velocidad máxima para eliminar el líquido residual desde el filtro.
7. Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. Aplicar 100 y mu; L de precalentado (a 95 ° C) de nucleasa libre de agua para el centro del filtro, y cerrar la tapa. Centrifugar durante 30 segundos a la velocidad máxima para recuperar el ARN.
8. Recoger el eluido que contiene ARN y almacenarlo a -80 ° C para aplicaciones posteriores.
9. Cuantificar 1 l de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000c. Tenga en cuenta que la cuantificación del ARN se puede omitir si un portador de ARN se añade a la muestra durante la extracción de RNA. En ese caso 8 l de ARN se sometió a síntesis de ADNc como se detalla a continuación.

2. miRNA Perfil: Protocolo QRT-PCR

El protocolo para miARN perfiles consta de dos pasos:

1. Síntesis de ADNc de primera cadena
2. La amplificación por PCR en tiempo real

2.1. Síntesis de ADNc de primera cadena

2.1.1. Diluir ARN molde

1. Ajustar cada una de las muestras de ARN plantilla a una concentración de 5 ng / l utilizando nucleasa libre de agua. Si elARN no ha sido cuantificada (véase el paso 1.2.2.9), a continuación, 8 l de ARN se utilizan para la síntesis de ADNc

2.1.2. Preparar reactivos

1. Descongelar suavemente el tampón de reacción 5x y nucleasa libre de agua, y colocar inmediatamente en hielo.
2. Mezclar por agitación. Resuspender la espiga-en añadiendo 40 l de nucleasa libre de agua al tubo y mezclar mediante agitación ARN; dejarlo en hielo durante 15 a 20 min. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador, se mezcla con un movimiento rápido de los tubos y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos.

2.1.3. Configuración reacción de transcripción inversa

1. Preparar la cantidad requerida de solución de trabajo de RT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, o equivalente (en las proporciones indicadas en la Tabla 1, a excepción de la plantilla de ARN), mezclar mediante agitación (1-2 segundos a velocidad máxima), girar brevemente abajo ( utilizamos un mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg) y colocarlo en hielo. Tenga en cuenta que la espiga ARN UniSp6-En se añade a la muestra antes de la reacción de RT (ver Tabla 1).
2. Vierta la solución de trabajo RT en tubos para PCR libre de nucleasa.
3. Dispensar plantilla de ARN en cada tubo.
   Nota: recuerde que debe calcular 10% de exceso de volumen / cada reactivo para pipetear y / o volumen muerto robótica.

   Reactivo	Panel I Volumen (l)	Panel I + II Volumen (l)
   Tampón de reacción 5x	4.4	8.8
   Libre de nucleasa agua	9.9	19.8
   Mezcla de enzimas	2.2	4.4
   UniSp6 ARN Punto-en la plantilla	1.1	2.2
   ARN total plantilla (5 ng / l)	4.4	8.8
   Volumen Total	22	44

   
   Tabla 1. Invierta configuración reacción de transcripción.

2.1.4. Mezclar y centrifugar reactivos

1. Mezclar la reacción por suave (1-2 segundos) vórtex para asegurar que todos los reactivos se mezclan a fondo. Después de mezclar, centrifugar (mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg).

2.1.5. Incubar e inactivar el calor

1. Programar una máquina de PCR de la siguiente manera:
2. Incubar durante 60 min a 42 ° C
3. Calor-inactivar la transcriptasa inversa durante 5 min a 95 ° C
4. Enfríe inmediatamente a 4 ° C
5. Almacenar a 4 ° C o congelación
   Nota: el protocolo se puede interrumpir en esta etapa. El cDNA diluido se conserva a -20 ° C durante un máximo de 5 semanas (tiendas opcional a 4 ° C durante un máximo de 4 días).

2.2. La amplificación por PCR en tiempo real

2.2.1. Preparar los reactivos para la PCR en tiempo real

1. Coloque cDNA (del paso 2.1.5) en hielo.
2. Agua libre y Master PCR mix nucleasa Descongelar en hielo. Proteja los viales mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio. Inmediatamente antes de su uso, mezclar la mezcla maestra de PCR por agitación 1-2 seg en una mini centrífuga y centrifugar a 1500 xg durante 1 min.

2.2.2. Combine la mezcla SYBR verde master, agua y cDNA y agregar a las placas PCR

Se recomienda el siguiente procedimiento para evitar bajas concentraciones de cDNA se adhiera a la superficie del tubo:

1. Antes de retirar la junta de la placa, girar brevemente abajo de la placa (s) en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min.
2. En un tubo cónico de 15 ml, combinar 2x PCR Master Mix y agua. Panel I: 2.000 l 2x mezcla maestra y 1.980 l de agua; Panel I + II: 4.000 l 2x mezcla maestra y 3960 μ; L de agua.
3. Añadir 20 l cDNA (panel I) o 40 l cDNA (panel I + II) y mezclar.
4. Mezclar suavemente por agitación 1-2 segundos y girar en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min.
5. Coloque la PCR Master Mix / cDNA mezcla en un depósito pipeta multicanal. Puede que tenga que identificar a un depósito que tiene la longitud de la pipeta multicanal. Esto mantiene el nivel de volumen lo suficientemente alto como para permitir alícuotas iguales de volumen en todo el multicanal. Esto es crítico hacia los últimos alícuotas.
6. Dispensar 10 l Master mezcla PCR / cDNA mezcla a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta de 16 canales.
7. Sellar la placa con sellado óptico.
8. Girar la placa brevemente en una centrífuga refrigerada (1500 xg durante 1 min), para mezclar las soluciones y eliminar las burbujas de aire.
   
   Nota: el experimento se puede detener en este punto. Guarde las reacciones protegidos de la luz a 4 ° C durante un máximo de 24 horas.

2.2.3. Real-Time PCR

Realizar la amplificación por PCR en tiempo real y análisis de curva de fusión después de los parámetros que se detallan en la Tabla 2.

Paso del proceso	Configuración, Roche LC480
Polimerasa de activación / Desnaturalización	95 ° C, 10 min
Amplificación	45 ciclos de amplificación en 95 ° C, 10 seg 60 ° C, 1 min -Tasa de rampa 1,6 ° C / seg Lectura óptica
Análisis de la curva de fusión	Sí

Tabla 2. En tiempo real las condiciones del ciclo de PCR utilizando el Roche LightCycler 480.

2.3. Análisis en tiempo real de datos de PCR

En tiempo real el análisis de datos de PCR se realiza con la Exiqon de GenEx profesional 5.0, siguiente trecomendó instrucciones. El manual de GenEx paso a paso se puede descargar en http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
El análisis de datos se compone de tres pasos:

1. Importación de datos
2. Preprocesamiento de los datos
3. El análisis estadístico

2.3.1. Importación de datos

1. En la Roche LightCycler 480 seleccionar el método de análisis ^nd derivado 2 y calcular los valores Cq. Los datos se exportan en forma de tabla y se guardan como archivos de texto.
2. Para importar los datos, abierta de GenEx y haga clic en el botón Asistente de importación Exiqon y haga clic en "Inicio". Siga las instrucciones para seleccionar el formato, el instrumento y archivo de diseño de placa (s). Tenga en cuenta que los archivos de diseño de placa (excel) son descargados desde el sitio web Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
3. Import Paneles I y II, y haga clic en "Siguiente".
4. La tabla generada después de archivo de importación contiene columnas predefinidas. Nombres de muestras se pueden editar y columnas de clasificación se pueden agregar o quitar en este paso. Haga clic en "Siguiente" cuando haya terminado.
5. Guarde los datos y cargar a Editor de datos.

2.3.2. Preprocesamiento de los datos

1. Según lo recomendado por Exiqon y de GenEx, al comparar múltiples placas lo primero que debe hacer es calibrar los datos entre las placas por la elección de calibración entre plato en el menú pre-procesamiento.
2. Se recomienda ejecutar arrays miARN en carreras por triplicado. Si un miARN no está presente en al menos dos de cada tres réplicas que se establecerá como nonexpressed.
3. En el siguiente paso en el procesamiento previo, establecer un punto de corte. Definición de un valor de corte indica que los datos con un ciclo umbral (C _t) superior a este valor se descartan. En los presentes experimentos utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo, el valor de corte se fijó en 39. Therntes, se descartarán todas las muestras con una C _{t por encima} de 39 en las tres réplicas. Si un miARN tiene una _T C> 39 para una sonda (una réplica de tres), que la lectura será reemplazado con el promedio de la C _t para los otros dos sondas, siempre que sean tanto por debajo de 39.
4. Definir los genes de referencia. De GenEx Professional tiene la opción de utilizar geNorm y / o NormFinder para identificar genes de referencia. Seleccione una lista de miRNAs que tienen valores similares en todos Cq muestra y se ejecutan geNorm y / o NormFinder. De acuerdo con este análisis, en el ejemplo dado aquí, miR-622 y miR-1266 tuvieron los valores más uniformes a través de las muestras y fueron elegidos como los genes de referencia (Figura 1).
5. A continuación, los datos se normalizaron utilizando los genes de referencia y los valores obtenidos se corresponden con el _t? C
6. Si se realizaron reacciones de síntesis de ADNc por triplicado, en este momento los valores deben promediarse.
7. Validar la hoja para volvermover las columnas vacías y casi vacías. En la ventana de procesamiento previo, seleccione "Validar hoja" y que se aplican en la línea de las columnas vacías Remove. En la línea de abajo, elegir el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en Aplicar. Por ejemplo, seleccione 100% si desea comparar sólo miRNAs comunes a todas las muestras.
8. Manipular los datos que faltan.
   Seleccione "Datos que faltan" en el menú de preprocesamiento y eligió una de las opciones para manejar los datos faltantes. Este paso es necesario. Tenga en cuenta que de GenEx te dará error si intenta cargar archivos que contengan datos que faltan no controladas.
9. Determinar la cuantificación relativa entre los grupos de muestras (es decir. Experimento frente al control). Cuantificación relativa entre los grupos se calcula utilizando el método ΔΔ C _t. En de GenEx, haga clic en la pestaña de procesamiento previo y seleccione la cuantificación relativa. En la ventana de seleccionar el grupo de referencia y pulse Aplicar. Tenga en cuenta que para representaciones gráficas y / o para otros análisis estadísticos, exprEssion datos deben ser convertidos a una escala logarítmica. En el menú de procesamiento previo, seleccione Log2.

2.3.3. Análisis estadístico

Software de GenEx permite una amplia gama de análisis estadísticos, entre ellos T-test y ANOVA.

1. Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Es fundamental para seleccionar las muestras correctas o grupos de muestras para las que se realiza el análisis estadístico.
2. Seleccione "Estadísticas" y elegimos el icono correspondiente a la prueba deseada.
3. Haga clic en "Ejecutar" en la ventana del panel de control. Guardar los resultados como Excel o archivos mdf.

2.3.4. De perfiles de expresión

Los microARNs y muestras se pueden clasificar, agrupar, y visualizados a fuego mapas y dendrogramas, de la siguiente

1. Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Utilice esta ventana para seleccionar y crear grupos de muestras o miRNAs. Haga clic en "Aplicar" cuando haya terminado.
2. En la esquina izquierda selecto grupo superior y haga clic en el icono de mapa de calor
3. En la ventana Panel de control, haga clic en "Ejecutar". El mapa de calor se puede guardar en varios formatos como tiff o bmp, sino que también puede copiar y modificar, según sea necesario.

Results

Los resultados de este estudio han sido publicados anteriormente ^1. Figura 1 muestra los resultados del análisis de microRNAs de referencia candidatos usando la aplicación geNorm. En consecuencia, dos microARN, miR-622 y miR-1266, fueron identificados como genes de referencia y se utilizaron para normalizar los valores de miRNA.

Para el estudio del LCR teníamos tres grupos de muestras: VIH (n = 10), HIVE (n = 4), y VIH + sin Encefalitis (VIH +, <...

Discussion

Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA ^2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos ^3-9.

Hay varias herramientas disponibl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabla 3. Lista de equipos.
Finnpipeta Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Puntas de pipeta	Thermo Scientific	9400613
Termociclador C1000	Biorad
0,2 ml Perfil bajo, Tubos de PCR transparentes	Biorad	TLS0801
Tiras de tapas planas	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Centrífuga refrigerada 5804R	Eppendorf
Rotor de cubeta oscilante, 4 posiciones	Eppendorf	A-4-44
Mini centrífuga de sobremesa	Fisher	05-090-100
Vórtice de sobremesa	Fisher
1,5 ml Tubos de microcentrífuga, esterilizados	Fisher	02-681-5
Depósito de reactivos de matriz, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Mini centrífuga de sobremesa Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Mesa 4. Lista de reactivos.
Kit universal de síntesis de ADNc, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Mezcla maestra verde, RT universal, 25 ml	Exiqon	203400
Agua destilada ultrapura Dnase, Libre de rnasa	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Paneles humanos de PCR listos para usar (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana Kit de aislamiento de miRNA, 40 aislamientos	Ambion	AM1556
MS2 portador de ARN	Roche Applied Science	10165948001 <
p>2-mercaptoetanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
etanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nucleasa libre de agua	Qiagen	1039480 <
p>RNAse Zap	Ambion	AM9780