Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Resumen

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Resumen

Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores. _content "> Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5.

El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.

Introducción

Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante.

Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) po....

Protocolo

El siguiente protocolo describe el procedimiento estándar para aislar el ARN de CSF y de perfil microRNAs utilizando placas PCR listos. Tenga en cuenta que la extracción en fase orgánica es opcional, y que un ARN transportador se añade a la muestra durante la extracción asegurar la recuperación máxima de ARN. En consecuencia, no hay necesidad de cuantificar el ARN.

En general, un promedio de 6-8 placas se puede ejecutar en un día si el ADNc se sintetiza el día antes (aproximadamente 2 horas). Análisis de los datos se realiza cuando todas las muestras se han perfilado y se cargan en el software. Dependiendo del número de muestras / grupos ....

Resultados

Los resultados de este estudio han sido publicados anteriormente ^1. Figura 1 muestra los resultados del análisis de microRNAs de referencia candidatos usando la aplicación geNorm. En consecuencia, dos microARN, miR-622 y miR-1266, fueron identificados como genes de referencia y se utilizaron para normalizar los valores de miRNA.

Para el estudio del LCR teníamos tres grupos de muestras: VIH (n = 10), HIVE (n = 4), y VIH + sin Encefalitis (VIH +, <.......

Discusión

Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA ^2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos ^3-9.

Hay varias herramientas disponibl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabla 3. Lista de equipos.
Finnpipeta Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Puntas de pipeta	Thermo Scientific	9400613
Termociclador C1000	Biorad
0,2 ml Perfil bajo, Tubos de PCR transparentes	Biorad	TLS0801
Tiras de tapas planas	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Centrífuga refrigerada 5804R	Eppendorf
Rotor de cubeta oscilante, 4 posiciones	Eppendorf	A-4-44
Mini centrífuga de sobremesa	Fisher	05-090-100
Vórtice de sobremesa	Fisher
1,5 ml Tubos de microcentrífuga, esterilizados	Fisher	02-681-5
Depósito de reactivos de matriz, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Mini centrífuga de sobremesa Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Mesa 4. Lista de reactivos.
Kit universal de síntesis de ADNc, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Mezcla maestra verde, RT universal, 25 ml	Exiqon	203400
Agua destilada ultrapura Dnase, Libre de rnasa	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Paneles humanos de PCR listos para usar (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana Kit de aislamiento de miRNA, 40 aislamientos	Ambion	AM1556
MS2 portador de ARN	Roche Applied Science	10165948001 <
p>2-mercaptoetanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
etanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nucleasa libre de agua	Qiagen	1039480 <
p>RNAse Zap	Ambion	AM9780