Summary
Detta protokoll beskriver experimentella metoder för att utvärdera differentiering av plasmacytoid dendritiska celler i Peyer s patch från vanliga dendritiska celler föregångare, med hjälp av tekniker som involverar FACS-medierad cellisolering, hydrodynamisk genöverföring, och flödesanalys av immunundergrupper i Peyer s patch.
Abstract
Detta protokoll specificerar en metod för att analysera förmågan hos renade hematopoietiska föregångare för att alstra plasmacytoid dendritiska celler (PDC) i intestinal Peyers plaque (PP). Vanliga dendritcellsprekursorer progenitorer (CDPS, Lin - c-kit-lo CD115 + Flt3 +) renades från benmärgen hos C57BL6 möss med FACS och överföras till mottagande möss som saknar en betydande pDC befolkningen i PP, i detta fall, IFNAR - / - möss användes som överföringsmottagare. I vissa möss, var överuttryck av den dendritiska celltillväxtfaktör Flt3 ligand (Flt3L) verkställts före adoptiv överföring av CDPs, använda hydrodynamiska genöverföring (HGT) i Flt3L-kodning plasmid. Flt3L uttryck expanderar DC populationer med ursprung från förts (eller endogena) hematopoetiska stamceller. Vid 7-10 dagar efter stamfader överföring, var pDCs som uppstår från de adoptivt överförda stamceller skiljer sig från mottagande celler pågrundval av CD45 markör uttryck, med pDCs från överförda CDPs vara CD45.1 + och mottagare är CD45.2 +. Förmågan hos överförda CDPs att bidra till PDC befolkningen i PP och att svara på Flt3L utvärderades genom flödescytometri av PP enkelcellsuspensioner från mottagande möss. Denna metod kan användas för att testa om andra gångarpopulationer kan generera PP pDCs. Dessutom kan denna metod användas för att undersöka betydelsen av faktorer som förutspås påverka pDC utveckling i PP, genom att överföra stamceller undergrupper med lämplig knockdown, knockout eller överuttryck av den förmodade utvecklingsfaktor och / eller genom att manipulera cirkulerande cytokiner via HGT . Denna metod kan också möjliggöra analys av hur PP pDCs påverka frekvensen eller funktionen av andra immunundergrupper i PP. Unikt för denna metod är att använda IFNAR - / - möss, som visar allvarligt utarmat PP pDCs relativt vild typ djur, alltså allowing rekonstitution av PP pDCs i frånvaro av störeffekter från dödlig bestrålning.
Introduction
Här visar vi ett protokoll för att bedöma om gemensamma dendritiska celler stamceller (CDPs) kan ge upphov till plasmacytoid dendritiska celler (PDC) befolkningen i Peyer s patch (PP). Det övergripande målet med denna metod var att utvärdera utvecklings regleringen av pDCs i Peyers plaque (PP pDCs). Anledningen till att detta är viktigt är att PP pDCs skilja från pDCs funna i andra vävnader inklusive benmärg, blod och mjälte, och det är därför oklart om PP pDCs och andra PDC-populationer är utvecklingsmässigt och / eller funktionellt besläktade. Specifikt är pDCs allmänt känd för att vara den huvudsakliga typ I interferon (IFN) producenterna inom det hematopoetiska systemet, svara på Toll-like receptor 7 och 9 (TLR7 / 9) stimulering av snabb IFN sekre 1-3. Men PP pDCs har brist på produktion av typ I IFN svar på TLR-agonist stimulering 4,5. Dessutom PP pDCs skiljer sig också från pDCs som finns i benmärg och mjälte ikräver signaler från typ I interferon (IFN)-receptorn (IFNAR1) eller IFN signalmolekyl STAT1 för deras utveckling och / eller ackumulering 5. Dessa data tyder på möjligheten att olika regleringsmekanismer styr PP pDCs kontra pDCs i andra organ (t.ex. benmärg, mjälte) 5.
Den logiska grunden som ledde till utvecklingen av den här metoden var baserad på de senaste framstegen inom förstå dendritiska celler (DC) biologi. De flesta, om inte alla, DC delmängder härrör från hematopoetiska stamceller som uttrycker den FMS-liknande tyrosinkinas 3-receptor (Flt3) 6-10, dock är DC utveckling inte begränsad till den klassiska myeloida och lymfoida vägar. Exempelvis FLT3 + vanliga myeloida stamceller (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) ger upphov till CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which ytterligare differentiera till pDCs och konventionella DC (CDCs) 9,10. Däremot Flt3 + gemensamma lymfoida stamceller (CLPS, lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) i första hand utvecklas till pDCs 11. Därför tidigare studier indikerar pDCs uppstår från minst 2 distinkta hematopoetiska progenitorceller populationer under regleringen av Flt3L, även om den typiska analysen har begränsats till benmärgen, mjälten och / eller blod PDC undergrupper. Således föregångare befolkningen (er) som genererar PP pDCs krävs utredning. Att förstå ursprunget till PP pDCs kommer att belysa om de har gemensamma utvecklingsvägar med andra PDC populationer, eller använda olika mekanismer under sin generation i PP.
En unik fördel med den metod som beskrivs här är att använda möss som visar en allvarlig brist i PP pDCs som mottagare för adoptiv överföring av hematopoetiska stamceller. Möss med gentic deletion i genen som kodar för IFNAR1 (IFNAR - / - möss) eller STAT1 (Stat1 - / -) avslöjade en slående tömning i PP pDCs 5. Därför är dessa stammar ger en miljö där PP pDCs minskar, vilket gör att adoptiv överföring studier som ska utföras i frånvaro av potenta cell ablation regimer som dödlig strålning. Ytterligare en styrka med metoden som presenteras här är användningen av hydrodynamiska genöverföring (HGT) för att stimulera förhöjda cirkulerande mängder Flt3L. Detta ger en kostnadseffektiv metod för att framkalla Flt3L in vivo, jämfört med injektion av rekombinant protein. Ett flertal studier, bland annat i vårt labb, har anställt HGT att inducera cytokin belopp i en mängd olika experimentella betingelser 5,12,13.
Arbetsfördelningen och exakta immunfunktioner för DC är av stort intresse för immunologi. Särskilt pDCs är viktiga förmedlare av oral tolerans och systemisk anti-virus-svar, men de verkar även bidra till utvecklingen och persistens av autoimmunitet och cancer 14-17. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för utvecklings mekanismer som reglerar PP pDCs att vara mer till fullo. Dessutom kan denna strategi att studier för att bedöma PP PDC-funktionen, och kan utvidgas till att förstå reglering och funktion av andra immun populationer inom PPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionell godkännande måste erhållas i förväg för alla experimentella manipulationer som beskrivs häri involverar möss. Dessa inkluderar användning av C57BL6 möss för isolering av benmärgsstamceller, IFNAR - / - möss som mottagare för adoptiv överföring av hematopoietiska progenitorer och användning av HGT för cytokin uttryckning in vivo. Lämpliga bostäder och djuromsorg ska också lämnas av prövaren eller institution. Vidare kan institutionella godkännande krävas för de plasmider som används i hydrodynamisk genöverföring (dvs. rekombinant DNA-godkännande). Studierna som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid UT MD Anderson Cancer Center.
1. Hydrodynamisk Gene Transfer (HGT)
Detta steg bör utföras 2 dagar före adoptiv överföring av CDPs att inducera cirkulerande Flt3L för DC expansionen in vivo 5. Prepare minst fem mottagare möss / grupp.
- För att uppnå effektiv HGT, blodkärlen i mottagaren IFNAR - / - bör möss (CD45.2 +) vara dilaterade genom exponering av möss för en värmelampa under 5 till 10 min.
- Placera musen i en restrainer anordning och desinficera svansen med 70% etanol.
- Injicera 5 ^ g av plasmid som kodar Flt3L i 2 ml steril PBS i svansvenen med användning av en 27 G nål. För kontroll kohorten, injicera 5 pg av tom vektor (pORF) via svansvenen såsom anges.
- Övervaka möss för 15 till 30 minuter för att säkerställa att det inte finns några skadliga effekterna av injektion i svansvenen. Återgå möss till bostäder anläggning för 2 dagar.
2. Isolering av hematopoietiska föregångare från benmärg från mus
Detta steg bör utföras 2 dagar efter HGT. Använd congenic CD45.1 + möss som källa för benmärgsstamfäder för adoptiv överföring in i mottagaren IFNAR - /- djur (CD45.2 +). I detta protokoll är kongena stammar som krävs för att skilja givare och mottagare som härrör DC, liksom att undvika immunmedierad utarmning på grund av MHC obalans. Cirka 10-20 möss kommer att krävas för att ge tillräckligt många hematopoetiska progenitorceller (10 5 celler / mottagare mus) för överföringsförsök.
- Euthanize 10 congenic CD45.1 + möss med CO 2 kvävning och halsdislokation.
- Placera varje slaktkropp på en dissektion bricka och sterilisera buken och benen med 70% etanol.
- Gör ett snitt i mitten av buken och skära genom huden från buken till varje ben, skära huden ner längden på benet.
- Ta försiktigt bort huden från varje ben, och klippa och ta bort benen från kroppen vid höftleden med hjälp av vass sax.
- Ta försiktigt bort musklerna från lårben och skenben på varje ben med hjälp av en vass kniv.
- Ta bortbåda ändarna av lårbenet och skenbenet med en vass skalpell och placera benen i en odlingsskål med komplett RPMI (RMPI med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1 mM natriumpyruvat och 50 mikroM β-merkaptoetanol) .
- Bered en spruta innehållande 1 ml fullständigt RPMI, som är anslutna till en 27 G-nål.
- För in 27 G nål i ena änden av lårbenet eller skenbenet. Spola benmärg från lårbenet eller skenbenet genom försiktigt injicera hela RPMI i benet. Se till att benmärgsceller tas bort från benet, vilket kan åstadkommas genom att visuellt upptäcka utvisas media som grumlig.
- Upprepa spolning varje lårben och skenben 3x för att grundligt avlägsna benmärgsceller.
- Framställ en enda cellsuspension genom att försiktigt pipettera cellerna upp och ner 3-5x i odlingsskålen.
- Ta bort skräp genom att passera de benmärgsceller genom en 40 | aM cellfilter, placera de utsöndrade cellerna in i en ny culture maträtt. Avbryta någon cellklumpar som visas på silen genom försiktigt tryck med änden av en steril sprutkolven.
- Lyse de röda blodkropparna (RBC) som är närvarande i den totala benmärgscellsuspension med kommersiell RBC-lyseringsbuffert i enlighet med tillverkarens instruktioner. Använd 2 ml lyserings buffer/4-6 x 10 7 celler (i allmänhet celler från en mus) och en inkubationstid av 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta benmärgsceller genom pellete celler genom centrifugering under 4 min vid 500 xg, försiktigt aspirera odlingsmediet, återsuspendering i 10 ml FACS-buffert (1x PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), pellete cellerna genom centrifugering och försiktigt suga tvätt buffert.
- Upprepa tvättningen såsom beskrivs i steg 2,13, för en summa av två tvättar.
3. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera CDPs
Detta steg kräver tillgång till en MidiMACS cellseparator och MACS LD kolumner för en inledande negativ urvalsförfarande,liksom en FACS maskin med åtminstone tre lasrar att rena multicolor progenitor delmängd efter färgning med fluorescerande konjugerade antikroppar.
- Efter den andra tvättningen i steg 2,14, räkna de benmärgsceller. Pelletera cellerna genom centrifugering såsom beskrivits i steg 2,13 och resuspendera i FACS-buffert för att uppnå en slutlig koncentration av 4 x 10 7 celler per 30 | il FACS-buffert.
- För framställning av celler för FACS, är linjenegativa celler först berikas av en negativ selektionsteknik som avlägsnar härstamningspositiva celler från benmärgen blandningen med användning av magnetiska pärlor kolonnkromatografi. För den negativa urvalsförfarandet, tillsätt 1 mikrogram av vardera av följande kommersiella råtta anti-mus-antikroppar (ABS) som känner igen hematopoetiska härstamning markörer: CD3, CD19, CD11c, CD11b, och Ter-119 Abs. De Abs bör läggas i en volym på 2 pl / Ab till 30 l cellsuspension i FACS buffert.
- Inkubera cellsuspensionen vid 4 ° C under 30min. Efter inkubationen tvättas cellerna två gånger med 10 ml FACS-buffert såsom beskrivits i steg 2,13.
- Resuspendera celler för att uppnå en slutlig koncentration av 4 x 10 7 cells/40 il FACS-buffert. Tillsätt 20 l av get-anti-råtta IgG magnetiska mikrokulor per vardera 40 pl cellsuspension. Blanda försiktigt och inkubera vid 4 ° C under 30 min. Tvätta cellerna med 10 ml FACS buffert som beskrivs i steg 2.13.
- Resuspendera upp till 10 8 benmärgsceller i 500 l av FACS buffert.
- Ladda en MACS LD kolonn på en MidiMACS cellseparator per tillverkarens anvisningar och försköljning kolonnen med 2 ml FACS buffert.
- Applicera benmärgscellsuspension till kolonnen, laddar upp till 5 x 10 8-celler i 2,5 ml FACS-buffert. Säkerställa en samling rör (15 ml koniskt rör) placeras i kolumnen. Tvätta kolonnen 3 gånger med 2 ml FACS-buffert / disk, och samla in de celler som passerar genom kolonnen, vilket kommer att berikas förlinjenegativa celler. Räkna celler i materialet eluerade (wash-through) från kolonnen.
- För att utföra positiv selektion av hematopoetiska progenitorceller undergrupper med FACS, fläck celler med följande fluorescerande konjugerade Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, plus en blandning av härstamning markör Abs mot CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 och Ter119 (alla märkta med PerCP Cy5.5). Använd 0,5-1 | il av varje Ab i en total volym av 100 | il. Inkubera cellsuspension vid 4 ° C under 20-30 min.
- Tvätta celler såsom indikeras i steg 2,13 och återsuspendera i FACS-buffert vid en koncentration av 2-3 x 10 7 celler / ml. Filtrera celler genom en 35 | aM cell sil kapsylröret för att avlägsna cellklumpar. Det sista steget är avgörande för att undvika igensättning av FACS maskin.
- Placera cellsuspension i en FACS rör på FACS scenen och sortera CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) pågrundval av den angivna markörprofilen. Samla renade celler i ett 15 ml rör som innehåller 5 ml komplett RPMI.
- Notera den absoluta antalet sorterade celler vid slutet av FACS-loppet. Pelletera cellerna genom centrifugering såsom indikeras i steg 2,13 och återsuspendera i steril PBS för adoptiv överföring experiment.
4. Adoptiv överföring av CDPs
Detta steg görs vanligtvis i djuranläggningen där mottagarmössen är inhysta. Beroende på placeringen av FACS-maskin, kan det handla om transport av de renade stamfadercellpopulationer i djuranläggningen före adoptiv överföring. Stamceller upphävanden bör hållas sterila och transporteras på is.
- Förbered cellsuspensioner för injektion genom utspädning 10 5 renade CDPs i en total volym av 100 | il steril PBS. Placera cellsuspensionen i en spruta fäst till en 27 G-nål.
- Exponera mottagaren IFNAR - / - +) till en värmelampa för 5-10 min för att uppnå effektiv injektion via svansvenen.
- Placera musen i en restrainer anordning och desinficera svansen med 70% etanol.
- Injicera 10 5 FACS-renade CDPs i 100 pl PBS i svansvenen med användning av en 27 G nål.
- Övervaka möss för 15 till 30 minuter för att säkerställa att det inte finns några skadliga effekterna av injektion i svansvenen. Återgå möss till bostäder anläggning.
5. Isolering av PP och Mätning av pDC Belopp
- Vid 7-10 dagar efter adoptiv överföring, avliva de mottagande möss. Öppna försiktigt musen genom dissektion och utsätta tarmen.
- Ta bort hela tarmen och placera den på PBS-indränkt pappershanddukar. Samla alla synliga PP längs väggen av tunntarmen med fin pincett och sax. C57BL6 och IFNAR - / - möss har typiskt 5-10 PP / mus, som skiljer sig från isolerade lymfoida folliklar hittatslängs tunntarmen 18. Observera att PP är ofta strukturellt distinkta även inom en enda mus, så noga att alla PP identifieras och dissekeras.
- Placera PP i en petriskål med PBS, och använder pincett för att ta bort avföring. Upprepa denna procedur två gånger för att rengöra PP.
- Sammandrag PP med 1 mg / ml kollagenas IV i 10 ml 1 x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i en 50 ml kolv med kraftig omröring under en timme vid 37 ° C.
- Placera digere PP i topputrymmet i ett 40 | im cellfilter och tvinga celler genom silen med en steril sprutkolven. Samla PP cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör.
- Pelle ansträngda PP-celler genom centrifugering vid 500 x g under 5 min och återsuspendera i 6 ml av 37% Percoll-lösning (37% Percoll i RPMI-medium). Placera försiktigt 6 ml av 70% Percoll-lösning (70% Percoll i RPMI-medium) under cellsuspension, för att bilda en Percoll steggradient.
- Centrifugera cellerna för 20 min at 800 x g med centrifugen brytas av. Mononukleära celler kommer att migrera till 37/70%-gränssnittet. Efter centrifugering, bör det mononukleära cellpopulationen uppsamlas genom försiktig pipettering i gränsregionen. Pellets uppsamlades cellerna genom centrifugering och tvätta två gånger i 50 ml av fullständigt RPMI / tvätt. En stor volym används för att säkerställa fullständig Percoll borttagning.
- Färga insamlade PP-celler med följande antikroppar för att detektera murina pDCs som härrör från de adoptivt överförda progenitorceller (CD45.1 +) eller mottagande möss (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) och PDCA-1 (FITC) Abs. Utför flödescytometri analys av PP-celler som anges i steg 3.9 och 3.10. Identifiera pDCs genom deras CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 +-fenotypen. Absoluta PDC nummer kan bestämmas genom följande ekvation:% pDCs x.tal PP mobilnummer = PP pDCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra resultat visar grindningsstrategin för isoleringen av CDPs från mus-benmärgsceller (Figur 1), som beskrivs i protokoll 2 och 3. CDPs utgör ungefär 0,1% av de totala benmärgsceller, och cirka 4-6 x 10 4 CDPs kan isoleras från en mus. Vid adoptiv transfer, CDPs differentierar till pDCs och CDCs 10.
Figur 1. Gating strategi för FACS rening av CDPs. Benmärgsceller samlades från C57BL6 möss. Härstamning-positiva celler utarmat med Abs mot härstamning markörer (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) använder MACS mikrokorn-medierad val. Den berikade linjenegativa benmärg population färgades med fluorescensmärkt Abs för CDP och härstamning markörer och renas genom FACS enligt bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att identifiera pDCs i PP, använder vi en första framåt-och sidospridning gating strategi, följt av slussning för CD11c + Siglec-H +-celler (fig. 2A och 2B) IFNAR -. / - Möss har en betydande minskning av pDCs i PP i förhållande till möss av vildtyp (Figur 2B) 5. Däremot CD11c + Siglec-H - CDCs finns på liknande belopp i båda genotyper (Figur 2B). Därför IFNAR - / - möss ger en möjlighet att undersöka PP pDC beredning utan effekter av dödlig strålning 5. Till exempel den adoptiv överföring av vildtyp CDPs in IFNAR - / - möss, såsom beskrivs i steg 4, stimulerar en ökning av PP pDCs (Figur 2B). Dessutom förbehandling med Flt3L HGT (steg 1) förbättras ytterligare pDC expansion i PP (Figur 2B), vilket innebär överförda CDPs och möjlighet endogena FLT3 + gångare svarar på Flt3L genom att inducera PP pDCs. Båda villkoren stimulerade också CD11c + Siglec-H - CDCs uppgår, i linje med utvecklings ursprung CDCs 6. pDCs i PP uttrycker traditionella PDC markörer inklusive PDCA-1, Siglec-H och B220, och saknar CD11b (figur 2B-D) 4,5. Vidare analys av PPS från IFNAR - / - möss som erhöll både Flt3L HGT och överförda CDPs visade att majoriteten (~ 70%) av pDCs härleddes från givaren (CD45.1 +) möss (Figur 2E). Tillsammans visar dessa data att adoptiv överföring av CDPs inducerar PP pDC befolkning som svar på Flt3L-förmedlade signaler in vivo.
innehåll "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
. Figur 2 Analys av PP pDC i IFNAR - / - möss upon Flt3L HGT och adoptiv överföring av CDPs IFNAR -. / - Möss injicerades intravenöst med 5 | j, g av plasmid som kodar Flt3L eller en tom vektor (pORF) genom HGT. Två dagar senare var 10 5 FACS-renade CDPs adoptivt överförs via svansvenen injektion. Sju dagar efter CDP överföring var PP uppsamlades och analyserades för PDC mängder (A, B). CD11c + Siglec-H + pDCs i möss som erhöll CDPs + Flt3L HGT analyserades vidare för PDCA-1, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 och CD45.2 (E) expression. Uttrycksmönstret för PDCA-1, B220 och CD11b var liknande i pDCs i alla tre grupperna (datavisas ej). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den adoptiv överföring teknik som beskrivs häri utvärderas bidraget av CDPs till PP pDC befolkningen i mottagarmöss som har brist på PP pDCs (t.ex. IFNAR - / - möss). I framtida experiment, är det viktigt att utvärdera potentialen av andra gångargrupper generera PP pDCs, särskilt huruvida PP pDCs härrör från FLT3 + CLPS. Denna fråga är viktig eftersom det är fortfarande oklart varför PP pDCs är unikt känsliga för IFNAR-STAT1 signaler för PP periodiserad 5, och om PP pDCs följer liknande utvecklings ledtrådar som pDCs i andra organ.
I teorin kan denna metod också genomföras i möss som saknar PDC-populationer i alla organ. Till exempel möss med brist i transkriptionsfaktor E2-2, PDC "master regulator" (dvs. TCF4 - / - möss), visar slående pDC utarmning 19. Emellertid TCF4 - / - mice är embryonala dödliga, och därmed TCF4 - / - benmärg chimär möss skulle behöva användas som mottagare för adoptiv överföringsexperiment. Det är dock fortfarande okänt om PP pDCs är känsliga för strålning och skulle effektivt utarmat i TCF4 - / - chimärer. Dessutom har dödlig strålning breda effekter på det hematopoetiska systemet och stödja stromal populationer som kan påverka PP pDC beredning. Således, användning av IFNAR - / - möss som mottagare för att bedöma förmågan hos adoptivt överförda stamceller undergrupper för att generera PP pDCs skulle vara att föredra till TCF4 - / -. chimärer Stat1 - / - möss visar också en slående minskning av PP pDCs och skulle kunna användas som mottagare för adoptiv överföring studier till studie PP PDC utvecklings ursprung 5. En nackdel med användningen av IFNAR - / - eller Stat1 - / - möss är deras immunbriststatus, which kan påverka PP pDC beredning eller funktion på okända vägar. Således skulle oberoende metoder för att bedöma PP PDC utvecklings ursprung öka förtroendet för tolkning av data.
Tekniskt sett är det att märka att den CDP populationen återfinns vid en mycket låg frekvens i total benmärg, sålunda uttömningen av härstamning markör-positiva celler genom magnetisk pärla medierad kolonnkromatografi före FACS är viktigt för effektiv rening av progenitorceller genom FACS. Denna utarmning steg berikar linjenegativa celler, vilket resulterar i minskad FACS tid (och kostnad) för stamfader rening. Den nedbrytande förfarandet beskrivet häri utnyttjar en blandning av härstamningsspecifika antikroppar som är kombinerade för varje experiment. Kommersiella cocktails härstamning antikroppar är också tillgängliga och kan användas för avlägsnande av härstamningspositiva celler, i stället för den blandning som vi beskriver. Fördelen med den beskrivna metoden är att den är flexibel i att vara anpassningsbar till difka utarmningssyfte, genom anpassning av de antikroppar som är närvarande i blandningen.
Vid framställningen av enkelcellsuspensioner från PPS, är det viktigt att ta bort så mycket av det intestinala vävnaden som omger PP som möjligt. Detta kan åstadkommas genom noggrann dissektion av PP. Tillräcklig uppslutning av PPs med kollagenas är ett viktigt steg för att frigöra leukocyter från tarmvävnaden. The Percoll density-gradient-centrifugering teknik som beskrivs är en föredragen metod för att berika leukocyter från spjälkade PP prover. Dessutom är det viktigt att notera att PDC markörprotein PDCA-1 kan regleras genom typ I-IFN och andra stimuli 20. Därför Siglec-H dras som en PDC-markör för studier med cytokin manipulation.
Användningen av HGT har en klar fördel när det gäller att vara mycket kostnadseffektiv. Medan Flt3L HGT användes i denna studie, att möjligheten för andra cytokiner eller lösliga faktorer regUlate PP pDCs kunde testas med användning HGT, i frånvaro eller närvaro av adoptiv cellöverföring av hematopoietiska progenitorceller. Dock resulterar HGT i varaktig produktion av cytokiner från de överförda plasmid kontra de mer övergående ökningar som observerats under rekombinant cytokin injektion, som är beroende av cytokin halveringstid 5,13. Den utökade förhöjning av cirkulerande cytokiner kanske därför inte speglar fysiologiska mängder uppnås under akut hematopoetiska eller infektionssvar. Denna varning bör hållas i åtanke under experimentella stadier och bedömning av planeringsdata.
I det framtida arbetet, selektiv manipulation av PP pDC befolkningen, som beskrivs häri, kan bidra till att ta itu med PP PDC-funktionen. PP pDCs betingas av medlare som finns i mucosal miljö och har brist på typ I IFN produktion på TLR aktivering 4,5. Analys av PP pDCs ombildade inom Stat1 - / - möss demonstrerade dessa cells har en jämförelsevis låg förmåga att inducera typ I IFN på TLR9 utlösande förhållande till PP pDCs uppstår naturligt (visas ej), vilket indikerar PP pDCs härrör från överförda CDPs behålla åtminstone den här fastigheten av naturliga PP pDCs. Den reducerade typ I IFN produktion av PP pDCs kontrast till den robusta typ I IFN utsöndring av andra PDC populationer och väcker en fråga om den funktionella rollen för PP pDCs. Dessutom PP pDCs likna pDCs som utvecklas i närvaro av typ I IFN, PDC befolkning som visar effektiv stimulering av IL-17-producerande CD4 + T-lymfocyter (Th17 celler) 5. Medan Th17 celler är allmänt anses vara en inflammatorisk framkallande befolkningen, de har både skyddande och patogena roller i tarmen 21. Separat har pDCs rapporterats förmedla systemisk tolerans mot oralt administrerade antigen 15. Roll PP pDCs i lokal och systemisk immunitet är av betydande intresse, som att förstå denna punkt kan avslöja new metoder för att manipulera tarm immuna och inflammatoriska svar i sjukdomsbehandling.
Sammanfattningsvis, den metod som presenteras här gör det möjligt att bedöma utvecklingspotentialen av hematopoetiska progenitorceller undergrupper för att generera PP pDCs. Detta förfarande ger möss med rekonstituerade PP pDCs. Således kan detta tillvägagångssätt användas inte bara för att utvärdera PP PDC hematopoietiska ursprung men också för förståelse av bidraget av PP pDCs till immunfunktioner i tarmmiljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Alex Gelbard och Willem Overwijk för råd om hydrodynamisk genöverföring. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (AI098099, SSV), MD Anderson Center for Cancer Epigenetik, MD Anderson Centrum för inflammation och cancer (SSV), och RE Bob Smith Education Fund (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
