Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.
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Artículo de método
Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Desde el descubrimiento de las células madre / estromales mesenquimales (MSC), la identidad nativa y la localización de las MSCs han sido oscurecida por su aislamiento retrospectiva en cultivo. Recientemente, utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), nosotros y otros investigadores identificaron prospectivamente y purificado tres subpoblaciones de células precursoras multipotentes asociados con la vasculatura del músculo esquelético humano. Estas tres poblaciones de células: células endoteliales miogénicos (MEC), pericitos (PC), y células adventicias (ACS), se localizan, respectivamente, a las tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: íntima, media y adventicia. Todas estas células madre derivadas de la sangre-vaso humano (hBVSC) poblaciones no sólo expresan marcadores MSC clásicos pero también poseen potencialidades del desarrollo mesodérmico similares a las MSC típicos. Anteriormente, MEC, PC y CCAA se han aislado a través de protocolos distintos y posteriormente caracterizado en estudios separados. El prot actual aislamientoOcol, a través de modificaciones en el proceso de aislamiento y ajustes en los marcadores de superficie celular selectiva, nos permite purificar simultáneamente las tres subpoblaciones hBVSC por FACS de una biopsia de músculo humano individual. Este nuevo método no sólo agilizará el aislamiento de varias subpoblaciones BVSC sino también facilitar futuras aplicaciones clínicas de hBVSCs con fines terapéuticos distintos.
Introducción
Músculo esquelético humano se ha considerado una fuente clínicamente atractiva de células madre / progenitoras. El músculo esquelético no sólo contiene comprometido progenitores miogénicas, mioblastos esqueléticos, sino también las células madre primitivas miogénicas, incluyendo células satélite y células madre derivadas de músculo (MDSC) 1. El uso de células humanas derivadas de músculo madre / progenitoras, autólogo o alogénico, en medicina regenerativa se ha investigado extensamente en modelos animales preclínicos y ensayos clínicos. Las aplicaciones de regeneración de músculo células madre / progenitoras van desde la regeneración del músculo distrófico....
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Protocolo
1. Muscle Procesamiento Biopsia
- Preservar biopsia de músculo esquelético humano en hielo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) durante el transporte.
- Después de la recepción de la biopsia muscular, retirar la muestra del contenedor de transporte y lavar dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con solución de antibiótico antifúngico 2% (A / A) en condiciones estériles.
- Retire el adiposo adjunta y el tejido conectivo con tijeras y pinzas estériles en DMEM suplementado con 2% A / A.
- Eliminar grandes vasos....
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Resultados
Parámetros de FACS se corrigieron primero basado en los datos obtenidos desde el control sin teñir, controles negativos, controles positivos y de un solo color. Después de la exclusión de células muertas, marcado con fluorescencia suspensión de células se somete a una serie de selecciones negativas y positivas marcador de superficie celular. Primero, las células CD45 + son una verja antes de CD56 + y CD56 - células se separan de la CD45 - fracción. El CD56 + fracció.......
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Discusión
Identificación y purificación de subpoblaciones hBVSC representan un avance importante en la comprensión de la ontogenia MSC. Cada vez hay más pruebas que indican el origen perivascular de MSC y la asociación entre las células precursoras específicas de tejido y los vasos sanguíneos 22-25. Además, la capacidad para aislar subpoblaciones homogéneas de hBVSCs SIDA aún más la comprensión de MSC heterogeneidad y la biología celular vascular 26.
En los últimos años, MEC, PC .......
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Divulgaciones
J.H. recibió una remuneración de Cook MyoSite, Inc. por servicios de consultoría y regalías recibidas por licencias de tecnología durante el período en que se realizó la investigación anterior. Todos los demás autores no tienen ningún conflicto de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Alison Logar por su excelente asistencia técnica con la citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Defensa (JH), la Cátedra J. Mankin Henry (JH), y el Ministerio de Educación y Ciencia de la República de Kazajstán (AS). CWC fue financiada en parte por la beca predoctoral Asociación Americana del Corazón (11PRE7490001). M.Corselli fue apoyado por el Instituto de California para la beca de formación de Medicina Regenerativa (TG2-01169).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa tipo 1 | Sigma | C5894 | Vial estéril |
| Colagenasa tipo 2 | Sigma | C1764 | Vial estéril |
| Colagenasa tipo 4 | Sigma | C1889 | Vial estéril |
| Anti-humano CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Mantener estéril |
| Anti-humano CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Mantener estéril |
| Anti-humano CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Mantener estéril |
| Anti-humano CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Mantener estéril |
| Anti-humano CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Mantener estéril |
| FACS Aria II Citómetro de Flujo | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 medio completo | Lonza | CC-3162 | Para el cultivo de PCs (solo P0) |
| DMEM glucosa alta (1X), líquido, con L-glutamina, sin piruvato de sodio | Invitrogen | 11965 | Para el cultivo de PCs |
| DMEM glucosa alta (1X), líquido, con L-glutamina, con piruvato de sodio | Invitrogen | 11995 | Para el cultivo de MECs y ACs |
| Suero fetal bovino | Invitrogen | 10437-028 | |
| Suero de caballo inactivado por calor | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiótico-antimicótico (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Tripsina-EDTA 0,5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco' s PBS sin calcio y magnesio | Invitrogen | 14190-250 | |
| Extracto de embrión de pollo | Preciso Químico | CE650T-10 | Filtrar antes de usar |
Referencias
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat C....
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
C lulas madre derivadas de vasos sangu neosClasificaci n celular activada por fluorescenciaDigesti n con colagenasaAn lisis por citometr a de flujoC lulas endoteliales miog nicasPericitosC lulas adventiciasMarcadores de superficie celularBiopsia de m sculo esquel ticoAislamiento de precursores multipotentesExpansi n de cultivos celulares
