Объединив родным и сшивания иммунопреципитацию хроматина с высоким разрешением масс-спектрометрии, ChroP подход позволяет препарировать композитный протеомный архитектуру модификаций гистонов, вариантов и не-histonic белков синергизма в функционально различных доменов хроматина.
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов сделаны из ДНК и белков, который управляет различными процессами ДНК-зависимой. Структура хроматина и функции в конкретных регионах регулируется местного обогащения гистонов пост-трансляционных модификаций (hPTMs) и вариантов, хроматин-связывающих белков, в том числе факторов транскрипции, и метилирования ДНК. Протеомный характеристика хроматина композиции в различных функциональных областях был до сих пор препятствует отсутствие эффективных протоколов, чтобы обогатить таких доменов на соответствующем чистоты и количества для последующего углубленного анализа методом масс-спектрометрии (МС). Мы описываем здесь недавно разработанный стратегию хроматина протеомики, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics), в результате чего препарат иммунопреципитация хроматина используется для изоляции различных регионов хроматина, чьи черты лица, с точки зрения hPTMs, варианты и со-связанные не-histonic белки, являются анализируют методом МС. Проиллюстрируем онре создание ChroP для обогащения и анализа транскрипционно молчащих гетерохроматиновых районов, отмеченной присутствии три-метилирования лизина 9 гистона H3. Результаты, достигнутые продемонстрировать потенциал ChroP в тщательно характеризующий гетерохроматина протеома и доказать это в качестве мощного аналитического стратегии понимания того, как различные белковые детерминанты хроматина взаимодействовать и объединения усилий для установления структурных и функциональных конфигураций Локус-специфичные.
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов, который участвует в качестве основного шаблона для всех процессов ДНК-опосредованной. Нуклеосом является основным повторяется единицей хроматина и состоит из белкового октамерных ядра, содержащего две молекулы каждого канонического гистона H2A, H2B, H3 и H4, вокруг которого 147 п.о. из ДНК, обернутой 1,2. Все основные гистоны структуру шаровой области и гибкой N-терминальном "хвосте", которая выступает за нуклеосоме. Одним из основных механизмов для регулирования структуры хроматина и динамику основана на ковалентных пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы), которые в основном происходят на N-концах гистонов 3,4. Модификации гистонов может функционировать либо путем изменения структуры более высокого порядка хроматина, изменяя контактов между гистонов ДНК или между нуклеосом, и таким образом контролировать доступность ДНК-связывающих белков (цис механизмов), или действуя как dockinг сайты для регуляторных белков, либо в виде отдельных единиц, или встроенный в мультимерных комплексов. Такие регулирующие белки могут оказывать свою функцию по-разному: путем модуляции экспрессии гена непосредственно (то есть TAF белки), или путем изменения позиционированием нуклеосом (т.е. хроматина комплексов) или путем модификации гистонов другие остатки (т.е. белки с метил-трансферазы или ацетил- трансферазы) (транс механизмы) 5. Наблюдение, что отличие PTM модели кластера в конкретной хроматина локусов привела к разработке гипотезы, что различные модификации в отдельных площадках, могут скоординированных генерировать молекулярную код посредническую функциональное состояние подстилающей ДНК. "Гистонов код гипотеза" получила большой консенсуса в эти годы, но ее экспериментальная проверка была сдерживается техническими ограничениями 6,7.
Протеомика Масс-спектрометрия (МС) на основе сталамощный инструмент для сопоставления гистонов моделей модификации и охарактеризовать хроматина-связывающие белки 8. MS обнаруживает изменение в качестве конкретного Δmass между экспериментальной и теоретической массы пептида. На уровне отдельных гистонов, MS предоставляет непредвзятый и всесторонний метод для сопоставления PTMs, что позволяет обнаруживать новые модификации и выявление взаимодействий между ними 9-14.
В последние годы ряд стратегий были разработаны препарировать протеомный состав хроматина, в том числе характеристики нетронутыми митотических хромосом 15, идентификации растворимых hPTM-связывающих белков 16-18 и выделения и анализа конкретных регионах хроматина (т.е. теломеры) 19,20. Тем не менее, исследование локус-специфических синергии между гистонов PTMs, вариантов и ассоциированных с хроматином белков еще не завершен. Здесь мы описываем новый подход, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics) 21, которые мы разработали для эффективного характеризуют функционально различных доменов хроматина. Этот подход адаптируется иммунопреципитацию хроматина (чип), хорошо налаженные протокол, используемый в эпигенетической исследования, для эффективного МС на основе протеомики анализа обогащенного образца. Мы разработали две различные протоколы, в зависимости от типа хроматина, используемого в качестве входных данных и вопроса, адресованного МС; в частности: 1) чип нефиксированной родной хроматина переваренной MNase используется для очистки моно-нуклеосом и препарировать совместно, связывающие hPTMs (N-ChroP); 2) чип сшитого хроматина фрагментированы с помощью ультразвука используется в сочетании с SILAC основе interactomics стратегии, чтобы охарактеризовать все совместно обогащая хроматин-связывающих белков (X-ChroP). Проиллюстрируем здесь сочетание N-и X-ChroP для обогащения и изучения гетерохроматина, используя H3K9me3 в качестве приманки для шагов иммунопреципитации. Использование ChroP может быть продленучиться либо отдельные области на хроматина, или изменения в хроматина состава в пределах одного региона при переходе к другой функционального состояния, тем самым проложив путь к различным приложениям в эпигенетика.
Мы недавно описал ChroP, количественную стратегию масштабного характеристики белковых компонентов хроматина. ChroP сочетает в себе два взаимодополняющих подходов, используемых в эпигенетической области, Чип и магистра, прибыль от их сильных и преодоления их соответствующие ограничения. ?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было впервые опубликована в Mol Cell протеомики. Soldi М. и Bonaldi Т. Протеомный Исследование хроматина функциональных областей показывает Novel синергизм среди Отдельное гетерохроматина Компоненты MCP. 2013; 12: 64-80. © Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Мы благодарим Роберта Noberini (Итальянский технологический институт и НОО, Италия) за критическое прочтение рукописи. Работа ТБ поддерживается грантами Armenise Гарвард-Foundation Программы Джованни Career Development, итальянской ассоциации по исследованию рака и Министерства здравоохранения Италии. MS Работа выполнена при поддержке стипендии FIRC.
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |