El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina
Summary
Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.
Abstract
La cromatina es un complejo de nucleoproteína altamente dinámico hecho de ADN y las proteínas que controla diversos procesos dependientes de ADN. Estructura de la cromatina y la función a regiones específicas está regulada por el enriquecimiento local de la histona modificaciones después de la traducción (hPTMs) y variantes, proteínas de unión a la cromatina, incluyendo factores de transcripción, y la metilación del ADN. La caracterización proteómico de la composición de la cromatina en las regiones funcionales distintos ha sido hasta ahora obstaculizada por la falta de protocolos eficientes para enriquecer tales dominios en la pureza y cantidad apropiada para el posterior análisis en profundidad por espectrometría de masas (MS). Se describe aquí una estrategia proteómica de la cromatina de nuevo diseño, llamado ChroP (roteomics CHRO Matin P), el cual se utiliza una inmunoprecipitación de la cromatina preparativa para aislar las regiones de cromatina distintos cuyas características, en términos de hPTMs, variantes y co-asociados proteínas no histonic, son analizó por MS. Nos ilustran quere la creación de ChroP para el enriquecimiento y el análisis de las regiones heterochromatic transcripcionalmente silentes, marcada por la presencia de tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de ChroP en la caracterización de fondo el proteoma heterocromatina y probarlo como una estrategia de análisis de gran alcance para la comprensión de cómo los determinantes de proteínas distintas de la cromatina interactúan y sinergia para establecer configuraciones estructurales y funcionales específicos de locus.
Introduction
La cromatina es un complejo altamente dinámico nucleoproteína que está implicado como molde principal para todos los procesos de ADN mediada. El nucleosoma es la unidad básica repetida de la cromatina y se compone de un núcleo octamérico proteínico que contiene dos moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 y H4, alrededor de la cual 147 pb de ADN se envuelven 1,2. Todas las histonas se estructuran como un dominio globular y una "cola" N-terminal flexible que sobresale fuera del nucleosoma. Uno de los principales mecanismos de regulación de la estructura de la cromatina y la dinámica se basa en covalentes modificaciones post-traduccionales (PTMs), que se producen principalmente en los extremos N de las histonas 3,4. Modificaciones de las histonas pueden funcionar ya sea mediante la alteración de la estructura de cromatina de orden superior, cambiando los contactos entre las histonas-ADN o entre nucleosomas, y controlando así la accesibilidad de las proteínas de unión al ADN (mecanismos cis), o actuando como DockInsitios g de proteínas reguladoras, ya sea como unidades individuales, o incrustado en complejos multiméricos. Tales proteínas reguladoras pueden ejercer su función de diferentes maneras: mediante la modulación de la expresión génica directamente (es decir, proteínas TAF), o mediante la alteración de la posicionamiento de nucleosomas (es decir, la remodelación de la cromatina complejos) o mediante la modificación de otros residuos de histonas (es decir, proteínas con metil-transferasa o acetil- actividad transferasa) (mecanismos trans) 5. La observación de que distintos PTM clúster patrones en los loci de la cromatina específica condujo a la elaboración de la hipótesis de que diferentes modificaciones en los sitios distintos pueden sinergizar para generar un código molecular mediar el estado funcional del ADN subyacente. El "código de histonas hipótesis" ha ganado amplio consenso en los próximos años, pero su verificación experimental se ha frenado por limitaciones técnicas 6,7.
Proteómica La espectrometría de masas (MS) con sede en se ha convertido en unpoderosa herramienta para mapear los patrones de modificación de histonas y caracterizar proteínas de unión a la cromatina-8. MS detecta una modificación como Δmass específica entre la masa experimental y teórica de un péptido. A nivel de las histonas individuales, MS proporciona un método imparcial y exhaustiva para mapear PTM, lo que permite la detección de nuevas modificaciones y reveladoras interactúa entre ellos 9-14.
En los últimos años, un número de estrategias han sido desarrolladas para diseccionar la composición proteómico de la cromatina, incluyendo la caracterización de los cromosomas mitóticos intactos 15, la identificación de proteínas de unión a Hptm-solubles 16-18 y el aislamiento y análisis de las regiones específicas de cromatina (es decir telómeros) 19,20. Sin embargo, la investigación de las sinergias locus específicos entre PTM histonas, variantes, y las proteínas asociadas a la cromatina es aún incompleta. Aquí se describe un nuevo enfoque, llamado ChroP (Roteomics matin P CHRO) 21, que hemos desarrollado para caracterizar eficientemente cromatina dominios funcionalmente distintos. Este enfoque se adapta inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), un protocolo bien establecido utilizado en la investigación epigenética, para el análisis proteómico basado en MS eficiente de la muestra enriquecida. Hemos desarrollado dos protocolos diferentes, dependiendo del tipo de la cromatina utilizado como entrada y la cuestión abordada por MS; en particular: 1) chip de la cromatina nativa no fijado digerido con MNase se emplea para purificar mono-nucleosomas y para diseccionar los hPTMs co-asociando (N-ChroP); 2) chip de la cromatina reticulada fragmentado por sonicación se utiliza en combinación con un interactómica estrategia basada en SILAC para caracterizar todo cromatina co-enriquecer proteínas (X-ChroP) de unión. Se ilustra aquí la combinación de N-y X-ChroP para enriquecer y estudiando heterocromatina, utilizando H3K9me3 como cebo para los pasos de inmunoprecipitación. El uso de ChroP se puede extenderpara estudiar cualquiera de las regiones distintas en la cromatina, o cambios en la composición de la cromatina dentro de la misma región durante la transición a un estado funcional diferente, allanando así el camino para diversas aplicaciones en la epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recientemente hemos descrito ChroP, una estrategia cuantitativa para la caracterización a gran escala de los componentes de la proteína de la cromatina. ChroP combina dos enfoques complementarios utilizados en el campo epigenética, CHIP y MS, aprovechando sus fortalezas y superar sus respectivas limitaciones. Chip acoplado a la secuenciación profunda (ChIP-Seq), permite el mapeo de todo el genoma de las modificaciones de histonas en la resolución de unos 35 nucleosomas. Aunque ventajosa por su sensibilid…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue publicada originalmente en Mol Proteómica Celular. Soldi M. y Bonaldi T. La investigación proteómico de la cromatina dominios funcionales Revela Nuevos establecer sinergias entre Distinct Heterocromatina Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Damos las gracias a Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnología y la OEI, Italia) para la lectura crítica del manuscrito. Trabajo TB es apoyado por becas de la Armenise-Harvard Programa Giovanni Fundación de Desarrollo de Carrera, la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer y el Ministerio de Sanidad italiano. MS trabajo fue apoyado por una beca FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
Referencias
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
