Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Resumen

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Resumen

La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo y deben ser importados en el orgánulo. Import puede ocurrir mientras que la proteína se sintetiza cerca de las mitocondrias. El apoyo a esta posibilidad se deriva de estudios recientes, en los que se muestran muchos mRNAs que codifican proteínas mitocondriales estar localizado en las proximidades mitocondrias. Junto a las manifestaciones anteriores de asociación ribosomas 'con la membrana externa, estos resultados sugieren un proceso de traducción localizada. Dicha traducción adaptada puede mejorar la eficiencia importan, suministran sitios únicos de regulación y reducir al mínimo los casos de expresión ectópica. Diversos métodos han sido utilizados para caracterizar los factores y elementos que median la traducción localizada. Estándar entre ellos es de fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Este protocolo tiene la ventaja de aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Estos pueden ser caracterizados por diversas molecular y bimétodos ochemical. Además, transcriptómica y proteómica métodos se pueden aplicar al material resultante, por ende facilitaría ideas de todo el genoma. La utilización de la levadura como organismo modelo para tales estudios tiene las ventajas de velocidad, los costos y simplicidad. Además, las herramientas genéticas avanzadas y supresión cepas disponibles facilita la verificación de los factores de candidatos.

Introducción

Las células eucariotas están organizados en compartimentos distintos que tienen funciones específicas. Para cumplir su función, cada compartimiento contiene un conjunto único de las proteínas que son esenciales para su actividad. Un posible mecanismo a través del cual estas proteínas se acercan a su compartimento es por ^1,2 localizada traducción. En este proceso, la proteína se sintetiza en su destino por los ribosomas y mRNAs que se encuentran allí. Entre las ventajas probables de traducción adaptada aumentan la eficiencia de la focalización de proteínas, disminución de la necesidad de chaperones de la proteína, y permitiendo a los mecanismos de regulació....

Protocolo

1. Las mitocondrias Purificación

Pesar el pellet de células. Aproximadamente 0,6 g se obtienen a partir de células 100 ml.

1. Crecer 100-150 ml de células de levadura a OD ₆₀₀ = 1-1,5 a 30 ° C en un medio de crecimiento no fermentable, como medio de crecimiento a base de galactosa, con el fin de enriquecer para las mitocondrias.
2. Centrifugar las células a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
3. Lavar el precipitado con agua destilada dos veces y centrifugar de nuevo. Eliminar el sobrenadante.
4. Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón por TD....

Resultados

Este protocolo permite la separación de una fracción que contiene mitocondrias-a partir de componentes citosólicos. La mejor manera de probar su éxito es para llevar a cabo análisis de Northern y análisis de Western (Figura 1) a las muestras de las diferentes etapas de aislamiento. Tres parámetros para la calidad de aislamiento se derivan de estos análisis. En primer lugar, si el ARN o proteínas en las muestras están intactos - éstos serán detectados como bandas distintas en los análisis. Eventos de deg.......

Discusión

Los avances tecnológicos en las imágenes habían dado las herramientas de alta resolución para estudiar la localización del mRNA. Hoy en día, se puede medir el movimiento de incluso una sola molécula de ARNm en la escala de tiempo mseg ^23-26. Sin embargo, los enfoques bioquímicos tradicionales, como el descrito anteriormente, también son informativos y son preferibles en algunos casos. Aislamiento bioquímica permite la purificación de un gran repertorio de los ARNm y proteínas, y por tanto es preferible que lo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extracto
BactoPeptona
Galactosa			No lo haga en autoclave Galactosa
Medio			Para el enriquecimiento mitocondrial, debe utilizar cualquier fuente de carbono no fermentable, como Medio de crecimiento a base de galactosa esterilizado 1% Extracto de levadura, 2% Bactopeptona, 2% Galactosa
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 mM Tris-HCl, pH 7,6
Ditiotreitol (DTT)
Tampón			de 10 mM 0,1 m TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Hacer fresco cada vez
1,2 M de sorbitol
mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0,2 μ m filtro
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filtre este búfer (0.2 μ m) y mantener a temperatura ambiente para su uso futuro
Zymolyase 20T			20.000 U/g
Medio de recuperación			de crecimiento a base de galactosa suplementado con 1 M Sorbitol
0,1 mg/ml Cicloheximida (CHX)
0,6 M Manitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0,5 mg/ml Heparina
1 mM Fenilmetanosulfonilo de fluoruro (PMSF)
Tampón			0,6 M Manitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Agregar fresco: 0,5 mg/ml de heparina, 0,1 mg/ml CHX y 1 mM (PMSF). Filtre este tampón y utilícelo helado
8 M de guanidinio-HCl
100% y 70% de etanol (EtOH)
3 M Acetato de sodio, pH 5,2
10 M solución
250 mM Tris HCl pH 6,8
SDS
Glicerol
β-Mercaptoetanol
			bromofenol
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glicerol, 20% β-mercaptoetanol y 0.02% azul de bromofenol
Homogeneizador de onzas de 15 ml de capacidad equipado con un mortero

de levadura de crecimiento TDT 4 Medio de manitol madre de LiClAzul de ajustado