Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.
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Artículo de método
Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los procesos inflamatorios resultantes de la secreción de interleucina (IL) -1 citocinas de la familia de las células inmunes conducen a la inflamación local o sistémica, remodelación y reparación de tejidos, y el control virológico 1, 2. La interleucina-1β es un elemento esencial de la respuesta inmune innata y contribuye a eliminar los patógenos invasores al tiempo que evita el establecimiento de la infección persistente 1-5.
Inflamosomas son la plataforma de señalización clave para la activación de la interleucina 1 de la enzima convertidora (ICE o caspasa-1). El inflamasoma NLRP3 requiere al menos dos señales en los países en desarrollo para hacer que la secreción de IL-1β 6. Pro-IL-1β expresión de la proteína se limita en las células en reposo; por lo tanto, se requiere una señal de cebado para la transcripción de IL-1β y expresión de la proteína. Una segunda señal detectada por los resultados NLRP3 en la formación de la inflamasoma NLRP3 multi-proteína. La capacidad de las células dendríticas para responsabilidadd para las señales requeridas para la secreción de IL-1β se puede probar usando una purina sintética, R848, que es detectado por TLR8 en monocitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) a las células principales, seguido por la activación de la inflamasoma NLRP3 con la toxina bacteriana y ionóforo de potasio, nigericina.
Monocitos DCs derivadas son fácilmente producidos en la cultura y proporcionan significativamente más células que purificados mieloide países en desarrollo humano. El método presentado aquí se diferencia de otros ensayos inflamasoma en que se utiliza en humanos in vitro, en lugar de ratón derivada, permitiendo así que los países en desarrollo para el estudio de la inflamasoma en la enfermedad humana y la infección.
Introducción
Se requiere Activación del sistema inmune innato para dirigir la respuesta inmune adaptativa durante la infección, la enfermedad y la vacunación 7. Las células dendríticas son el antígeno más potente que presenta células del sistema inmune innato; están especializados para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos, y la activación de citolítica CD8 + T-células 8-10 ingenuo CD4 + y. Para habilitar la detección de patógenos rápida del sistema inmune innato utiliza numerosos receptores de reconocimiento de patrón de la línea germinal codificada (PRR) que reconocen patógenos motivos conservados derivados....
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Protocolo
Declaración de Ética: se obtienen y se almacenan para la investigación con el consentimiento de los donantes de muestras de investigación. Todas las muestras deben ser codificadas o anónimos antes de su uso. Este protocolo sigue las directrices de nuestra Junta de Revisión Institucional.
1. La diferenciación de los monocitos de sangre periférica humana en células dendríticas derivadas de monocitos.
Nota: capas leucocitarias humanas sirven como la fuente de las células de sangre periférica humana (PBMC) y se obtuvieron del Centro de Sangre de Nueva York (Nueva York, Nueva York). Los donantes de sangre son volunta....
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Resultados
Estas técnicas miden TLR8 cebado con R848. Tinción intracelular de citoquinas para pro-IL-1β permite microscopía y FAC lecturas de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas técnicas se pueden cuantificar con relación a un no imprimado, o de descanso, el control celular, así como un control de isotipo (Figuras 1 y 2). Porcentaje de células pro-IL-1β + tinción se multiplica por la mediana geométrica de esta población para proporcionar la intensidad de fluorescencia media (MFI). El IMF e.......
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Discusión
Las citocinas inflamatorias son integrales en la dirección de la respuesta inmune innata y adaptativa para combatir la infección viral. Secretada de IL-1β se ha demostrado que aumenta durante la infección por influenza 3, 43, 44. Los mecanismos precisos por los que estas citoquinas se procesan en respuesta al reconocimiento viral en células dendríticas humanas no se entienden completamente. Kits de aislamiento DC mieloides son costosos y requerir mucho tiempo. Kits de aislamiento y clasificación FAC puede inv.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., y Meagan O'Brien, MD por su apoyo y comentarios. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y completado con fondos del NIH subvenciones Ruth L. Kirschstein Premios Nacionales del Servicio de Investigación para individuales becas predoctorales (F31) para promover la diversidad en la Investigación en Salud, (AI089030) y SR1 (AI081848 ).
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Materiales
Nunc EasYFlask 225 cm2, Tapón filtrante, 70 ml volumen de trabajo, 30/Cs
de gradiente Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mLThermo
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| IL-4 | R& D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | Adquirimos este artículo a través de nuestra farmacia local con receta |
| RPMI 1640 con L-glutamina | Cellgro | 10-040-CV | |
| Células mononucleares de sangre periférica | New York Blood Center | Las PBMC se aislaron de la sangre de donantes sanos Placas de cultivo de | |
| tejidos de 12 pocillos | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R& D | IC201F | |
| FITC control | isotipo Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R& D | mab201 | |
| PVDF Membrana Immobilon-FL | Millipore | de IPFL00010 | |
| 4-12% gel de policrilamida | Bio | Rad 161-1159 | |
| Tampón de muestra Laemmli | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solución estéril/filtrada | |
| PFA | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710 | 16% solución |
| Kit de matriz de perlas de citocinas inflamatorias humanas | BD 551811 | ||
| Nigericina | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | Almacén in situ | ||
| Científico | 159933 | ||
| 20 μ M Unidades de filtro desechables estériles | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Cabra α-ratón IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Burro α-conejo IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra escalera de proteínas multicolor de amplio rango | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Metanol - 4 | L Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Vaso de poliestireno de 8 cámaras portaobjetos de vidrio tratado para cultivo de tejidos | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
Referencias
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al.
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Reimpresiones y permisos
