Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

Resumen

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Resumen

La vía de la ubiquitina-proteasoma para la degradación de proteínas se ha convertido en uno de los mecanismos más importantes para la regulación de una amplia gama de funciones celulares en prácticamente todos los organismos eucariotas. Específicamente, en las plantas, el sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regula la degradación de proteínas y contribuye significativamente al desarrollo de una amplia gama de procesos, incluyendo la respuesta inmune, desarrollo y muerte celular programada. Por otra parte, cada vez más evidencia sugiere que numerosos patógenos de las plantas, tales como Agrobacterium, explotan la acogida de UPS para la infección eficiente, haciendo hincapié en la importancia de la UPS en las interacciones planta-patógeno.

La especificidad de sustrato de la UPS se consigue mediante la ubiquitina ligasa E3 que actúa en concierto con la E1 y E2 ligasas para reconocer y marcar moléculas de proteínas específicas destinadas a la degradación por unir a ellos cadenas de moléculas de ubiquitina. Una clase de las ligasas E3 es el SCF (Skp1 / Cproteína ullin / F-box) compleja, que reconoce específicamente los sustratos de UPS y los dirige a través de su componente de ubiquitinación de proteínas F-box. Para investigar un posible papel de la UPS en un proceso biológico de interés, es importante para idear un ensayo simple y fiable para la degradación de proteínas mediada por UPS. Aquí, se describe uno de tales ensayo utilizando un sistema libre de células de la planta. Este ensayo se puede adaptar para el estudio de las funciones de la degradación de proteínas regulado en diversos procesos celulares, con un enfoque especial en los F-box interacciones proteína-sustrato.

Introducción

La vía del proteasoma ubiquitin/26S está emergiendo como un mecanismo generalizado para el control de diversas reacciones biológicas, incluyendo la regulación transcripcional, la progresión del ciclo celular y la transducción de la señal, el receptor de baja regulación o endocitosis, entre otros procesos de ^1-4. En esta vía, la proteína diana se marca por ubiquitina residuos que se unen primero a través de un enlace tioléster de enzima ubiquitina-activación de E1 y luego trasladadas a un residuo de aminoácido cisteína de la enzima ubiquitina-conjugación E2; finalmente, E2 interactúa con ubiquitina ligasa E3 , lo que resulta en polyubiquitination d....

Protocolo

1. La expresión de proteínas

1. Elección del sistema de expresión
   Seleccione el sistema, es decir, los vectores y el método de entrega de vectores, el más adecuado para la expresión de la proteína de interés en el modelo de organismo / celda específica. Tenga en cuenta que nuestro ensayo requiere la expresión de las proteínas de la prueba en cantidades fácilmente detectables, lo que se consigue mejor mediante la transformación transitoria de un gran número de células. En las plantas, por ejemplo, esto se realiza mejor usando plásmidos binarios como vectores de expresión y de Agrobacterium como sistema de entrega.
2. Cons....

Resultados

La Figura 1, adaptado de Zaltsman et al. ^17, ilustra experimentos representativos para la detección de la degradación proteasomal en un sistema libre de células. En concreto, se demuestra la desestabilización de una planta relacionada con la defensa de proteínas VIP1 por la proteína F-box VBF través de la vía SCF ^VBF en N. benthamiana. VBF Arabidopsis y HA-etiquetados VIP1 (HA-VIP1) proteínas se coexpresan transitoriamente, y la proteína de conte.......

Discusión

Este ensayo se basa en la expresión de las proteínas de la prueba en tejidos de la planta, por lo tanto, el potencial proceso de degradación proteasomal, obviamente, se produce ya dentro de los tejidos vivos. Nosotros ensayamos la desestabilización de proteínas, sin embargo, sólo en los extractos, con el tiempo de la muestra cero que sirve como el punto de referencia inicial. Por lo tanto, se define como un ensayo libre de células.

Un aspecto importante para el éxito de este ensayo es la ele.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0001
Cóctel de inhibidores de proteinasa	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Sistema proteico	Bio-Rad	165-8000
Western blot semiseco SD sistema de electrotransferencia	Bio-Rad	170-3940
Conejo purificado por afinidad Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Cabra anti-conejo IgG Peroxidasa Conjugado	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT membrana de transferencia de nitrocelulosa	Pall Corporation	27377-000
Immobilon sustrato HRP quimioluminiscente occidental	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacistina	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055