Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.
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Artículo de método
Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos
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Resumen
Resumen
Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación, o el diseño de 1,2. Aquí, un ensayo de unión péptido-MHC II se escala al formato de 384 pocillos. El protocolo reducido reduce los costes de reactivos en un 75% y es mayor rendimiento que se ha descrito anteriormente protocolos de 96 pocillos 1,3-5. Específicamente, el diseño experimental permite el análisis robusto y reproducible de hasta 15 péptidos contra un alelo de MHC II por 384 pocillos de placas de ELISA. El uso de un solo robot de manejo de líquidos, este método permite a un investigador para analizar aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. Otros trabajan en los campos de la desinmunización proteína o el diseño y desarrollo de vacunas que encuentre el protocolo para ser útil en la facilitación de su propio trabajo. En particular, las instrucciones paso a paso y el formato visualde Jove debe permitir que otros usuarios establecer rápida y fácilmente esta metodología en sus propios laboratorios.
Introducción
Las proteínas son la clase de más rápido crecimiento de agentes terapéuticos 6, y la rápida expansión de ductos bioterapéuticos se ha centrado cada vez más atención en los retos asociados con el desarrollo y el uso de fármacos de proteínas. Una consideración único surge del hecho de que, en un sistema inmunológico saludable y en funcionamiento, todas las proteínas extracelulares son muestreadas por las células presentadoras de antígeno (APCs). Una vez internalizado por las APC, una proteína se escinde en pequeños fragmentos de péptidos, y los segmentos inmunogénicos putativos se cargan en la ranura de clase II proteínas principales complejos de histocompat....
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Protocolo
Cuatro actividades principales comprenden el ensayo de unión péptido-MHC II: 1-Encuadernación: péptidos de ensayo compiten con los péptidos de control marcado por la unión en fase de solución de proteínas MHC II solubles. Encuadernación se mide a través de una amplia gama de concentraciones de péptido de prueba. 2-Captura: Después de la reacción de unión se aproxima al equilibrio, los complejos de péptido-MHC II se capturan y se separan de péptido no unido y la proteína por el reconocimiento dependiente de la conformación con un anticuerpo inmovilizado. 3-Detección: péptido de control capturado se detecta cuantitativamente usando fluorescencia resuelta en el tiempo. ....
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Resultados
La secuencia de péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 de beta-lactamasa (bla) (GenBank ID # X07274.1) se analizó con ProPred 16 para aglutinantes de péptidos putativos a MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabla 4). ProPred identificado péptidos nonamer 117 con un residuo de anclaje P1 obligatoria (es decir, un M, L, I, V, F, Y, o W en la posición 1, que se requiere para MHC II de unión 31). En el umbral del 5%, sólo los péptidos con puntajes mayores o iguales a 2.6 so.......
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Discusión
Biotherapeutics se han establecido como uno de los pilares de la medicina moderna, que representan cuatro de las cinco principales drogas que venden en 2012 32. El sector de la biofarmacia ha mostrado un crecimiento sostenido durante varios años y 6, y el desarrollo continuo de nuevos agentes, así como la aparición de los biosimilares se ha expandido ductos biofarmacéuticos. Mirando hacia el futuro, evaluar y mitigar la inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas se convertirá en una parte integr.......
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Divulgaciones
Leonard Moise está empleado y tiene opciones sobre acciones en EpiVax, Inc., una compañía de biotecnología de propiedad privada con sede en Providence, RI. El trabajo contenido en este informe de investigación es libre de cualquier sesgo que podría asociarse con los objetivos comerciales de la empresa.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-GM-098 977 y R21-AI-098 122 para CBK y KEG. RSS fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Luce y en parte por una beca del Programa de Innovación Thayer de la Escuela de Ingeniería Thayer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tetraborato de sodio Decahidrato | Sigma | 221732 | |
| Ácido cítrico | Sigma | C1901 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-& beta;-D-Glucopiranato | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco' s 10x Fosfato Tamponado Solución Salina | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Tampón de ensayo | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Tampón de mejora | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europio Estreptavidina marcada con Europio | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anticuerpo anti-HLA-DR | Biolegend 307602 | ||
| péptidos trazadores | 21st Century Biochemicals | Pedido | |
| Péptidos de prueba (1-4 mg, 85% de pureza) | Genscript Pedido | ||
| Monómeros HLA-DRB1 purificados (no biotinilados) | Benaroya Research Institute* | Pedido | |
| Placa EIA/RIA blanca de 384 pocillos | Termo | 460372 | |
| Placa de polipropileno de 384 pocillos | Costar | 3656 | |
| Película, AxySeal, 80 y micro; m, Aplicador de ELISA | Axygen | Ascientific PCR-SP | |
| MilliQ Water N | /A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (o similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (o similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (o similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Las moléculas recombinantes humanas MHC II se pueden obtener del Laboratorio Central de Tetrámeros de Benaroya. Véase: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory |
Referencias
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2 in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (mM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (ml) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (ml): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
to:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (μM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (μl) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (μl): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
