Artículo de método

Neonatal electroporación superficie pial

DOI:

10.3791/51319

7 de mayo de 2014

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.

Resumen

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En los últimos años la superficie pial ha sido identificado como un nicho germinal de importancia durante embrionario, perinatal y adultos neuro-y gliogénesis, incluyendo después de la lesión. Sin embargo, los métodos para interrogar genéticamente estas poblaciones progenitoras y el seguimiento de sus linajes habían sido limitadas debido a la falta de especificidad o mucho tiempo la producción de virus. Por lo tanto, el progreso en esta región ha sido relativamente lento con sólo un puñado de investigaciones de esta ubicación. La electroporación se ha utilizado durante más de una década para estudiar las propiedades de células madre neurales en el embrión, y más recientemente en el cerebro postnatal. Aquí se describe una técnica eficiente, rápido, y sencillo para la manipulación genética de los progenitores superficie pial basadas en un enfoque adaptado electroporación. Pial electroporación superficie permite el etiquetado genética fácil y manipulación de estos progenitores, lo que representa un enfoque de ahorro de tiempo y económico para el estudio de estas células.

Introducción

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Células madre y progenitoras neurales están presentes en todo el SNC de mamíferos 1, 2. Su naturaleza y propiedades en zonas germinales embrionarias y adultas que rodean las regiones ventriculares del cerebro y la médula espinal han sido ampliamente documentados en la década pasada 1-3. En gran parte, esto se ha debido al desarrollo de herramientas genéticas cada vez más precisas, como el sistema nervioso específico recombinación Cre de alelos floxed o linaje retroviral trazando 4. Sin embargo, una región-el progenitor pial progenitor superficie de la zona-sólo recientemente ha sido descrito en detalle 5-7 y espera examen e....

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Protocolo

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Este procedimiento es conforme a los requisitos Cedars-Sinai IACUC. Los investigadores deben velar por el cumplimiento IACUC institucional antes de proceder. Todas las herramientas y los reactivos deben ser esterilizados antes de su uso.

1. Preparación de herramientas, soluciones, y la mezcla de ADN

  1. Inserte borosilicato pulido tubos capilares de vidrio de 100 mm de incendio en un extractor de micropipeta. Ajuste de calefacción para permitir la extracción ponderada estándar para formar la punta de la pipeta de aproximadamente 17,5 mm. Cortar las extremidades con tijeras quirúrgicas nítidas a una distancia aproximadamente de 8-9 ....

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Resultados

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Pial superficie resultados de electroporación en la expresión de ADN plásmido en las células progenitores-sobre todo-en o cerca de la superficie pial 6. Más específicamente, la orientación de los electrodos es crítica en el dictado de la dirección del movimiento plásmido y expresión posterior. Por lo tanto, en configuraciones de electrodos duales, el plásmido está dirigida más o menos en un vector recta entre el electrodo negativo y positivo. Por lo tanto, si el polo negativo se coloca sobre el sitio de la in.......

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Discusión

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El aspecto más crítico para la electroporación éxito de progenitores superficie pial son: 1) la orientación de la mezcla de plásmido a la superficie de la pía madre; 2) evitando la generación de hematomas en el lugar de la inyección; y 3) evitar la mortalidad asociada con la electroporación mesencéfalo.

Apropiadamente la orientación de la superficie de la pía madre se lleva a cabo por punción medido y cuidadoso del cráneo para evitar la penetración de la superficie de la pía madre. Inadecuad.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto del Cáncer Cancer Research Award Samuel Oschin Integral Foro, así como los fondos del Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, y la familia de Guerin. El proyecto que se describe fue apoyado en la forma de un CTSI Core Vale financiado por el Centro Nacional de Recursos para investigación, Grant UL1RR033176, y ahora está en el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, de Grant UL1TR000124. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de borosilicato pulido al fuegoWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
Extractor de micropipetasSutter Instruments CompanyP-30
Fast Green FCFSigma Aldrich, Inc.F7528
Microinyector digital XenoWorksSutter Instruments Company
ECM 830 GeneratorAparato Harvard, Instrumento BTX Div45-0052
Pinzas de platino de 3 mmAparato Harvard, Instrumento BTX Div45-0487
SignaGel Gel de electrodoCardinal Health70315-025
Tampón Tris-EDTA, pH 8.0Integrated DNA Technologies, Inc.11-01-02-05
lámpara de calor infrarrojaVWR36547-009
Tijeras finas afiladasHerramientas científicas finas14060-09

Referencias

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  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.

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Etiquetas

Cerebro neonatalManipulaci n gen ticaInyecci n de pl smidosT cnica de electroporaci nProgenitores neuralesEspacio men ngeoPipeta de vidrioMicroinyectorPinzas de platino

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