Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

Resumen

De ingeniería tisular matriz nativa derivado de fibroblastos es un nuevo instrumento para generar un sustrato del estroma que apoya la proliferación de células epiteliales y la diferenciación. Aquí se presenta un protocolo de aplicación de esta metodología para evaluar el impacto de los diferentes tipos de células del estroma en la biología de las células tumorales.

Resumen

Cultivos organotípicos 3D de células epiteliales en una matriz incrustada con células mesenquimales son ampliamente utilizados para estudiar la diferenciación de las células epiteliales y la invasión. Tipo de cola de rata colágeno I y / o una matriz derivada de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón han sido empleado tradicionalmente como los sustratos para modelar la matriz o estroma microambiente en el que se llenan las células mesenquimales (generalmente fibroblastos). Aunque los experimentos utilizando tales matrices son muy informativo, se puede argumentar que, debido a una presencia dominante de una sola proteína (como en el colágeno tipo I) o un alto contenido de componentes de la membrana basal y factores de crecimiento (tales como en la matriz derivada de ratón Las células del sarcoma), estos sustratos no reflejan mejor la contribución a la composición de la matriz de las propias células del estroma. Para estudiar las matrices nativas producidas por los fibroblastos dérmicos primarios aislados de pacientes con un tumor propensos, trastorno de formación de ampollas genética (distrófica recesivaepidermolisis bullosa), hemos adaptado un protocolo de matriz nativa existente para estudiar la invasión de las células tumorales. Los fibroblastos son inducidas a producir su propia matriz durante un período prolongado en cultivo. Esta matriz nativa se separa entonces de la placa de cultivo y las células epiteliales se siembran en que antes de todo el cocultivo se eleva a la interfaz aire-líquido. Diferenciación y / o la invasión celular se puede evaluar en el tiempo. Esta técnica proporciona la capacidad para evaluar la interacción de células epiteliales mesenquimales en un entorno 3D sin la necesidad de una matriz sintética o extranjera con la única desventaja es el período de tiempo prolongado requerido para producir la matriz nativa. Aquí se describe la aplicación de esta técnica para evaluar la capacidad de una sola molécula expresada por los fibroblastos, colágeno de tipo VII, para inhibir la invasión de células tumorales.

Introducción

El uso de biomaterial en cultivo de tejido 3D ha permitido a los investigadores a estudiar el comportamiento de células en el laboratorio bajo condiciones fisiológicas más similares a un entorno in vivo que el de uno recapitulado con la adhesión 2D y un sustrato de plástico. En particular, los grandes avances se han hecho en el modelado de epitelio estratificado con la adopción de métodos de cultivo en 3D en la interfase aire-líquido ^1-4. Dichas técnicas fielmente imitan la diferenciación de los queratinocitos y la invasión de las células tumorales que permite una mayor flexibilidad y fidelidad para los investigadores que estudian estos procesos. ....

Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo a la Declaración de Principios de Helsinki y fue aprobado por los Comités de Ética apropiados.

1. Preparación de Medios y Reactivos

1. Preparación de 200x de ácido L-ascórbico 2-fosfato de stock
   1. Disolver 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 ml de medio de Eagle modificado (DMEM) solución de Dulbecco y filtrar a través de 0,22 micras filtro de membrana. Tienda como 0,25 ml alícuotas estériles en -20 ° C.
   2. Añadir 0,25 ml de alícuota de ácido L-ascórbico de stock 200x 2-fosfato a cada 50 ml de medio de fibroblastos (DMEM con 1% de L-glutamina y suero bovino fetal al 10%) en e....

Resultados

Esta técnica abre la posibilidad de examinar y comparar el comportamiento invasivo de las células tumorales (en este caso CSCC) bajo diferentes ambientes estromales 3D. Usando esta técnica, no sólo las matrices nativas C7-deficientes que recapitulados el medio ambiente dérmica EADR se pueden generar, sino también matrices adicionales que han sido modificados genéticamente para sobreexpresar C7 ^18. Como se ve en la Figura 2, la invasión de los queratinocitos EADR CSCC fue significativame.......

Discusión

Debido a la naturaleza de este experimento, el tiempo total requerido para la terminación puede ser de hasta dos meses. A lo largo de este tiempo, se deben emplear las prácticas de cuidado de cultivo y del tejido estéril todo lo posible para evitar la contaminación microbiana.

Aparte de su papel como un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina de colágenos, ácido ascórbico estimula el colágeno específica la expresión del ARNm en los fibroblastos <.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960
DMEM con L-glutamina, 4.500 mg/L de D-glucosa, 110 mg/L de piruvato de sodio	Life Technologies	11995-073
100x Penicilina-estreptomicina	Life Technologies	15070
Vaselina	VWR	PROL28908.290
Cilindros clonales	Sigma	Z370789
Disco de filtro de red de nailon hidrófilo 100 μ m 25 μ m de diámetro 100/pk	Millipore	NY1H02500
Soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado	Hecho en casa		Las dimensiones se hicieron para que la malla encajara en placas de 6 pocillos