Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Resumen

Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo.

Resumen

Probando el destino de la célula de vástago derivados embrionarios o pluripotentes en protocolos in vitro ha conducido a resultados controvertidos que no reflejan necesariamente su potencial in vivo. Preferiblemente, estas células deben ser colocados en un entorno embrionario adecuado con el fin de adquirir su fenotipo definido. Por otra parte, el linaje celular rastreo estudios en el ratón después de etiquetar las células con colorantes o vectores retrovirales se ha mantenido mayormente limitada a los embriones de ratón en fase inicial con los órganos todavía poco desarrollados. Para superar estas limitaciones, hemos diseñado protocolos de microinyección estándar y de ultrasonido mediada para inyectar diversos agentes en regiones específicas del corazón en embriones de ratón en E9.5 y etapas posteriores del desarrollo. Explante embrionarias o embriones se cultivan o hacia la izquierda para seguir desarrollando en el útero. Estos agentes incluyen los tintes fluorescentes, virus, shRNAs, o las células madre derivadas de células progenitoras. Nuestros enfoques permiten la preservación de la funciones del órgano mientras se monitorea la migración y el destino de las células marcadas y / o inyectados. Estas tecnologías pueden extenderse a otros órganos y va a ser muy útil para hacer frente a cuestiones biológicas fundamentales en la biología del desarrollo.

Introducción

Hace más de una década, las células madre embrionarias humanas (HuESCs) se han derivado de blastocistos humanos ^1. Desde entonces, estas células han sido objeto de un importante campo de investigación que se ocupa de las cuestiones no cubiertas en la biología del desarrollo humano. HuESCs han proporcionado, además, las esperanzas en la medicina regenerativa. En los últimos años, las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs humanos) se han generado a partir de células somáticas específicas del paciente, proporcionando modelos de enfermedad genética ^2. Muchos en los protocolos in vitro para la diferenciación de células madre ....

Protocolo

1. Preparación

Animal procedimientos

Obtener la aprobación de un comité ético de los animales y seguir las directrices institucionales para el trabajo con virus, HuESC y / o de IPSC (cuando corresponda), así como el manejo del ratón, la obtención de embriones de ratón, y la realización de la cirugía de ratón. Para apareamientos programados, el día de la clavija es considerado el día embrionario (E) 0,5 / 0,5 días post-coito.

1. Agujas de microinyección:
   Para ex utero microinyección, tire de pipetas de vidrio (1,2 mm tubos capilares de borosilicato de diámetro externo) con un extractor d....

Resultados

El uso de los protocolos de inyección descritos anteriormente, las células pueden ser etiquetados y / o inyectados en el corazón embrionario de ratón. Como prueba de concepto, se muestran varios ejemplos en los que el protocolo de inyección y el vivo explante ex AVC, aislado del corazón, o el cultivo de embriones entera se combinaron (Figura 1).

La Figura 1 muestra la preparación del embrión antes de la inyección de células. El embrión E9.5.......

Discusión

Los in vivo protocolos intra-cardíacos ex inyección descritos anteriormente están diseñados para preservar la función miocárdica durante al menos 48 horas a mediados de la etapa (E9.5-E11.5 embriones de ratón). Estos enfoques de inyección permiten para inyección espacialmente selectiva de ADN o células. Los pocos ejemplos que se muestran en las figuras 1-3 proporcionan una prueba de concepto para delinear ex vivo e in vivo los mecanismos moleculares de los procesos de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Setups/Hardware
40 MHz Transductor	VisualSonics	MS550S
Microinyector	VisualSonics
Micromanipulador	Eppendorf	5242
	Eppendorf	5171
Nitrógeno			necesario para presurizar el inyector
Sistema de rieles	Rotador
	para rotar el tubo de vidrio con embriones dentro de la incubadora Incubadora
Microscopio estereoscópico	C Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicato tubos capilares	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μ m diámetro exterior
Extractor de pipetas	Sutter Modelo	P87
Agujas de microinyección	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1,14 mm/53 mm, con 50/35 μ m OD/ID punta
jeringas Hamilton
Placas			de 10 cm de diámetro
Aceite mineral	Sigma	M8410
Membrana de silicona	Visualsonics		4,3 x 4,3 cm
Play-Doh
Isoflurano	Vet Un
agente depilatorio
Lubricante ocular	Optixcare	31779
Gel de electrodos (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Gel de ultrasonidos	Aquasonic
Buprenex Buprenex (clorhidrato de buprenorfina)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0,05-0,1 mg/kg en solución salina
Otros
Petri de vidrio	Fine Science Tools		de 60 mm de diámetro
Alfileres para insectos	Fine Science Tools	26002-20
Medio Optimem	Life Technologies	51985026
medio M2	Sigma	M7167
Dulbecco' s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F alto	contenido de glucosa y 50% suero de rata
M16 medio	Sigma	M7292
suero de rata	Janvier	ODI 7158
Pennicilina/estreptomicina	Life Technologies	15140-12
oxígeno 40%	Aire líquido		necesario para oxigenar el medio de cultivo embrionario
Suero	de ternero fetalFisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Colágeno tipo I	BD	354236	para recubrir placas de cultivo para explante
Placas de cultivo	Dutcher /Orange	131020
Inyectados>
CDCFDA-SE	Invitrogen/Sondas moleculares	C1165	25 mg/ml de DMSO. Almacene a -20 °C. Diluya 1:100-200 en solución salina antes de usar.
Lentivirus que expresa PGK-GFP			~8E9 unidades de transducción/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019