Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Resumen

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Resumen

Hace unos años, la creación de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) marcó el comienzo de una nueva era en la biomedicina. Los usos potenciales de iPSCs humanos incluyen el modelado patogénesis de enfermedades genéticas humanas, la terapia celular autóloga después de la corrección de genes, y la detección de drogas personalizada, proporcionando una fuente de células relevantes y los síntomas específicos del paciente. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar, como la eliminación del factor de reprogramación transgén expresión restante después de la producción iPSCs humanos. Más importante aún, la expresión transgénica residual en iPSCs humanas indiferenciadas podría obstaculizar diferenciaciones adecuadas y confundir a la interpretación de los fenotipos in vitro relevantes enfermedad. Con este motivo, se han desarrollado-la integración libre y / o iPSCs humanos transgenes gratis con varios métodos, como el adenovirus, el sistema piggyBac, minicircle vector, vectores episomales, entrega directa de proteínas y ARNm sintetizado. Sin embargo, la eficiencia de reprogramming utilizando métodos de integración libre es bastante bajo en la mayoría de los casos.

A continuación, presentamos un método para aislar iPSCs humanos mediante el uso de Sendai-virus (virus RNA) sistema de reprogramación en base. Este método de reprogramación muestra resultados consistentes y de alta eficiencia en forma rentable.

Introducción

Las células madre embrionarias (hESCs) tienen una capacidad de auto-renovación in vitro y tienen la pluripotencia, lo que podría ser potencialmente útil para el modelado de la enfermedad, para la detección de drogas, y para el desarrollo de terapias basadas en células para tratar lesiones de la enfermedad y del tejido. Sin embargo, hESCs tienen una limitación para la terapia de reemplazo de la célula debido a las barreras inmunológicas, oncológicas y éticas, y para estudiar los genes relacionados con la enfermedad, hESCs específicos de la enfermedad pueden ser aislados a través de pre-implantación diagnóstico genético (PGD) se acerca, pero sigue siendo un re....

Protocolo

1. Preparación de la célula y Medios de Comunicación (Día 1)

1. Cultura y ampliar fibroblastos humanos con medio DMEM que contiene 10% de SFB.
2. Placa fibroblastos humanos (Figura 1) en una placa de 24 pocillos a una densidad apropiada por pozo en el día antes de la transducción.
   NOTA: Se recomiendan las siguientes diluciones en serie (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K y 6,25), ya que los diferentes tipos de células tienen diferente capacidad de unión.
3. Se incuban las células durante un día más en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora, lo que garantiza que las células han cumplido plenamente y extendid....

Resultados

Por lo general, los fibroblastos infectados no muestran cambios morfológicos en varios días después de la transducción de virus Sendai, pero cinco días después, empiezan a tener diferentes formas (Figura 1). Como se describe en un panel de la derecha de la Figura 1, las células no tienen la morfología típica de fibroblastos más. Ellos tienen una forma redonda y el núcleo más grande que el citoplasma. Incluso cuando la transducción se realiza en el 80% de confluencia celular, parece que .......

Discusión

La reprogramación de las células somáticas humanas con hiPSCs sostiene promesas sin precedentes en la biología básica, la medicina personal, y el trasplante ^12. Anteriormente, las generaciones IPSC humanos necesarios virus de ADN que tiene riesgo de integración en el genoma huésped, que puede crear mutaciones genéticas indeseables que limitan otras aplicaciones clínicas tales como el desarrollo de medicamentos y terapias de trasplante ^13. Con este motivo, se ha informado de muchos estudios para gen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de reprogramación CytoTune-iPS	Invitrogen A1378002
CF-6, MEFs, resistente a la neomicina, tratado con mitomicina C	Tallo global	GSC-6105M	x 105/6 cm o 12,5 x 105/placa de 24 pocillos
Tripsina EDTA 0.25% Tripsina con EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medio	Invitrogen	11330-032
Placa de cultivo celular de 24 pocillos, fondo plano con tapa	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Stock: 10 mM)
factor de crecimiento básico de fibroblastos	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock: 100 ug)
Reemplazo de suero knock-out	Gibco	10828028
Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (D-MEM, DMEM) (1X), líquido (glucosa alta)	Invitrogen	11965118
Suero fetal bovino	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamina-200 mM (100X), líquido	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Solución de aminoácidos no esenciales, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		11140050 1/100
2-Mercaptoetanol (1,000X), líquido	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Fase Contraste Hemacitómetros	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1% Solución de Gelatina	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Señalización Celular	4745S	1/200
anticuerpo Oct4 monoclonal de ratón	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog	R& D	AF1997	1/1.000
Alexa Flouor 488 cabra anti-ratón	Invitrogen		948492 1/2.000
DPBS (Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato), 1X sin calcio & magnesio	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Kit de transcripción inversa	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	campana
	NuAire	NU-301
visor de disección	Nikon	SMZ745

5 de recogida 15596018