Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo

Un evento crucial en la defensa del huésped antiviral es la detección rápida del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón de llamadas (PRRS) ^1,2. La detección intracelular de la infección por virus de ARN depende de dos helicasas de ARN citoplásmico, RIG-I (ácido retinoico de genes inducibles I) y MDA5 (proteína asociada a la diferenciación del melanoma 5) ^3-5. RIG-I está compuesta por dos dominios N-terminales de reclutamiento de caspasas (tarjetas), un tipo DECH-box RNA helicasa dominio central, y un dominio C-terminal (CTD) ^{de 4,6.} Considerando que el CTD y el dominio helicasa se requieren para el reconocimiento de la no auto RNAs (virales), las tarjetas median la señalización corriente abajo que conduce a establecimiento de un estado anfitrión antiviral.

Si RIG-I está en el estado de silencio, es decir, en ausencia de un ligando de ARN específico, la segunda tarjeta interactúa con el dominio helicasa central y mantiene GAR-I en una conformación auto-inhibidor ^7-11. RIG-I se une a corto doble-hebra (ds) de ARN que lleva un 5'-trifosfato (5'PPP), largo dsRNA, y polyU / UC-rica ARN, estructuras de firma clásicos que están presentes en los genomas de muchos virus de ARN ^12-16. Dos características importantes de la activación de RIG-I son un cambio a una conformación cerrada ^6,17 y la homo-oligomerización ^6,18,19. El cambio conformacional mejora ARN vinculante, expone las tarjetas de señalización corriente abajo, y reconstituye un sitio ATPasa activa ^8,9,11,20. La formación de complejos oligoméricos RIG-I conduce a una mayor captación de las moléculas adaptadoras de señalización aguas abajo para formar una plataforma para la transducción de señales antiviral ^11. La cadena de señalización regulada por el RIG-I se activa con el tiempo el factor de transcripción IRF-3 para la regulación de interferón genes (IFN-alpha/beta) y por lo tanto la expresión génica de los genes de interferón estimulado (ISGs) para una respuesta antiviral completa ^21,22 . Uno de los mejor caracterizados ISGs es la proteinuria ARN-activadon quinasa (PKR) ^23. PKR pertenece a la familia de iniciación de la traducción eucariótica factor de 2 alfa (eIF2α) quinasas y se compone de un dominio de ARN de doble cadena de unión y un dominio C-terminal de la quinasa N-terminal. El dominio quinasa constituye la interfaz de dimerización crucial para la activación de PKR y lleva a cabo las funciones catalíticas de la proteína. La unión de PKR a dsRNA viral conduce a su cambio conformacional que permite la dimerización y auto-fosforilación en Thr 446, entre otros residuos. PKR continuación, media la fosforilación de eIF2α, bloqueando de este modo la traducción de los ARNm viral ^23-27.

Tanto RIG-I y PKR sufrir importantes reajustes estructurales, forman complejos oligómeros y son después de la traducción modificado por fosforilación / desfosforilación y ubiquitinación ^{10,11,19,23,24,26-29.} Para una mejor comprensión de lo que las estructuras de ARN virales están activando RIG-I y PKR (y en qué etapa antagonistas virales podrían be interferir), es importante determinar con precisión el estado de activación. Para ambos parentales que se ha descrito anteriormente que la activación conduce a la aparición de fragmentos de proteína resistente a tripsina ^6,17,30 y oligómeros de orden superior ^6,18,19. Sin embargo, dada la gran cantidad de literatura sobre estos factores clave de la respuesta del huésped antiviral ^1,2,24, la aplicación de métodos directos parece relativamente rara. En la esperanza de estimular el uso más amplio, ofrecemos protocolos convenientes y sensibles para analizar con firmeza los estados de activación de RIG-I y PKR. El IFN competente línea celular humana A549 está infectado con un activador establecida de RIG-I y PKR, el virus de la fiebre del Valle del Rift atenuada clon mutante 13 (Cl 13) ^31,32. Después de un procedimiento de lisis simple, los extractos de células infectadas se prueban por digestión análisis de transferencia limitada tripsina / Western para evaluar conmutación conformacional, y por azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (PAGE) / Analys Western blotes medir la formación de oligómeros.

1. Siembra de células A549 para la infección

1. Cultivar un matraz T75 de células A549 a 37 ° C y 5% de _CO2 en medio de cultivo celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50.000 U / l de penicilina, y 50 mg / l de estreptomicina).
2. Antes de comenzar a cosechar las células, calentar medio de cultivo celular, PBS y 0,05% de tripsina-EDTA en un baño de agua calentado a 37 ° C.
3. Se retira el medio y se lavan las células con 10 ml de PBS. Retire la PBS de nuevo.
4. Añadir 3 ml de tripsina-EDTA y distribuir por igual en el matraz. 5% de CO ₂ Transferir el matraz en un incubador con 37 ° C y.
5. Cuando se separan todas las células, añadir 7 ml de medio de cultivo celular, resuspender las células, y transferir la suspensión de células en un tubo Falcon de 15 ml.
6. Centrifugar las células a 800 xg durante 5 min a TA, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de medio de cultivo celular fresco.
7. Contar las células con una cámara de recuento.
8. Añadir 2,5 x 10 ⁶ células en 5 ml de medio de cultivo celular en dos matraces T25 cada uno. Incubar durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO _2. Un matraz sirve para el control de maqueta y uno para la infección Cl 13.

2. Infección con Clone fiebre de Rift Valley Virus 13 (Cl 13)

1. NOTA: Cl 13 es un mutante de virus atenuado que en Alemania se puede manejar bajo BSL-2 condiciones. Consulte las normativas nacionales pertinentes. Otros inductores de IFN típicos serían virus Sendai (cepa Cantell) o el virus de la enfermedad de Newcastle.
2. , Medio libre de suero Pre-caliente PBS, y el medio de cultivo celular que contiene 5% de FCS.
3. Preparar 1.25 x 10 ⁷ PFU / ml de Cl 13 en medio libre de suero para infectar a 2,5 x 10 ⁶ células A549 con una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Preparar un poco (aproximadamente 10%) mayor cantidad de la necesaria para tener en cuenta errores de pipeta.
4. Lavar las células con PBS como se describe en 1.3.
5. Añadir 1 ml de la dilución o Cl 13de medio libre de suero (control no infectado, maqueta) a las células, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO _2. Mueva el frasco cuidadosamente cada 15 minutos para asegurar la distribución equitativa de la Cl 13 dilución y medio libre de suero, respectivamente.
6. Después de 1 h de infección, retire la inoculación, añadir 5 ml de medio de cultivo de células pre-calentado con 5% de FCS, y se incuba durante 5 horas a 37 º C y 5% de CO _2.

3. Preparación de lisados ​​de células

1. Preparar PBS / 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C. No agregue inhibidores de la proteasa de serina.
2. Lavar las células con PBS frío y añadir 10 ml de PBS fresca.
3. Raspar las células fuera, transferir la suspensión de células en un tubo Falcon, y centrifugar a 800 xg durante 5 min a TA.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 30 l de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transferir el lisado en un tubo nuevo de 1,5 ml y se incuba durante al menos 10 min a 4 ° C.
5. Centrifugar el lisado a 10,000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el lisado celular clarificado (sobrenadante) en un tubo fresco.
6. Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford como se describe en otra parte ^33.
7. Almacenar a -20 ° C o proceder a la digestión de tripsina (4,1) o PAGE nativa (5.1).

4. Determinación de Cambios conformacionales de Reconocimiento de Patrones Receptores

1. Tratamiento TPCK-tripsina de lisados ​​de células
   1. Diluir L-1-tosilamido-2-feniletil clorometil cetona tratada con (TPCK) tripsina en PBS a una concentración de trabajo final de 2 mg / l.
   2. Ajuste en dos nuevos tubos una concentración final de proteína de 25 g de cada proteína lisado (mock o Cl 13) en un volumen final de 9 l con PBS. Por lo tanto, debería ser de cuatro tubos con 25 g de lisado de cada uno, dos veces simuladas y dos veces Cl 13 infección. Un juego como el control de entrada (sin tratar) y otro para el tratamiento con TPCK-tripsina.
   3. Añadir 1 l de PBS (sin tratar)o 1 l de 2 mg / l de TPCK-tripsina (concentración final: 0,2 g / l) a los lisados ​​de células y mezclar las reacciones mediante pipeteo. NO congelar y descongelar alícuotas-TPCK tripsina, porque va a poner en peligro la eficiencia de la digestión.
   4. Incubar los lisados ​​a 37 ° C durante 25 min. Detener la reacción mediante la adición de 5x tampón de desnaturalización de la muestra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 25% β-mercaptoetanol, 0,5% azul de bromofenol) y mediante ebullición durante 5 min a 95 ° C. Es importante no extender el tiempo de incubación con tripsina. En caso de que no hay fragmentos resistentes a la proteasa son detectables, el tiempo de digestión con tripsina se debe acortar.
   5. Después de la ebullición, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C.
2. SDS poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) y transferencia Western
   1. Cargar las muestras en un dodecil sulfato de sodio (SDS) en gel de poliacrilamida que contiene un apilamiento de 5% en un gel de resolución 12%. Separar las proteínas a 25 mA por gel hastael azul de bromofenol se agote.
   2. Activar una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) durante 30 segundos con metanol y ponerlo en tampón de transferencia (48 mM Tris, 39 mM glicina, 1,3 mM de SDS, 20% de metanol).
   3. Preparar la transferencia con un sistema de transferencia semiseco y permitir la transferencia de las proteínas a 10 V durante 1 hora. Tome la membrana, enjuáguelo brevemente con agua y deje que se seque.
   4. Reactivar la membrana por poco transfiriendo en metanol. Lavar durante 5 min con TBS. Se bloquea con 10% de leche desnatada en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 º CO / N. Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBS.
   5. Preparar la dilución de anticuerpo como se recomienda en la tabla 1 y se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 º CO / N.
   6. Lavar la membrana 3x durante 10 min cada uno con TBS-T. Añadir el anticuerpo secundario apropiado acoplado con peroxidasa de rábano picante a una dilución 1:20.000 en 1% de leche desnatada en TBS. Incubar 45 min a TA.
   7. Lavar la membrana 3x durante 10 min cada uno con TBS-T, y Otiempo adicional ne con TBS.
   8. Para la detección de la señal de utilizar un kit de quimioluminiscencia comercial y un sistema de imágenes de gel digital.
3. Coomassie Brilliant tinción azul G-250
   1. Realice SDS-PAGE como se describe en el punto 4.2.1. Cargue las muestras en un gel de poliacrilamida SDS y corren el gel a 25 mA por gel hasta azul de bromofenol se agote.
   2. Realice brillante coloración azul de Coomassie G-250 a RT. ¿Todas las incubaciones con agitación constante.
   3. Transferir el gel a la solución de fijación que contiene 40% de metanol y ácido acético al 10% durante 30 min.
   4. Cambiar el buffer para solución decolorante (25% de etanol y ácido acético al 8%) y se incuba durante 5 min.
   5. Tinción del gel con 0,2% de Coomassie Azul Brillante G-250 en 40% de metanol y ácido acético al 10% durante 1 hora.
   6. Destain el gel con la solución decolorante y el intercambio de la memoria intermedia después de 10 min, 30 min, y 60 min.
   7. Almacenar el gel en 25% de etanol, ácido acético 8%, y 4% de glicerol a 4 ° C. Realice imagen y el análisis como se describe en 4.2.8.

5. Análisis de oligoméricas Unidos de Reconocimiento de Patrones Receptores

1. PÁGINA Nativo
   1. Preparar 50 g de lisado de células en un volumen final de 10 l con PBS y añadir 5 x tampón de muestra nativo (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 1% de desoxicolato de sodio, 50% de glicerol, 0,5% azul de bromofenol) a una concentración final de 1x.
   2. Cargar las muestras inmediatamente en un gel de poliacrilamida nativo con 5% como el apilamiento y 8% como gel de resolución. Cualquier retraso se traducirá en una pérdida de complejos nativas ^34.
   3. Correr el gel a 20 mA por gel a 4 ° C con 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glicina como como ánodo y 50 mM de Tris pH 8,3, 384 mM de glicina, 1% de desoxicolato de sodio como tampón de cátodo. Después de 1,5 a 2 horas (banda azul de bromofenol haya abandonado el gel de aproximadamente 45 min antes) la electroforesis ha terminado.
2. Western Blotting
   1. Activar un PolyVinylidene fluoruro (PVDF) membrana durante 30 segundos con metanol y se puso en tampón de Towbin (25 mM de Tris, 192 mM glicina, 0,1% de SDS, 20% metanol).
   2. Montar una cámara blot húmedo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y llene el tanque con tampón Towin.
   3. Realice la transferencia de 250 mA durante 1,5 horas a 4 ° C.
   4. Cuando secante proseguir de la forma descrita a partir de 4.2.3 a.

El reconocimiento de un agonista viral RIG-I o PKR desencadena conmutación conformacional 6,17,30 y oligomerización 6,18,27. Estamos analizarse estos dos marcadores de activación por digestión con proteasa limitada y electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE), respectivamente.

Células A549 humanas fueron infectadas con el clon de virus de la fiebre del Valle del Rift 13 (Cl 13), que se caracteriza por una mutación del antagonista de IFN NSS 35,36. Debido a la ausencia de NSs funcional, Clon 13 induce fuertemente RIG-I y PKR, que condujo al establecimiento de un estado antiviral robusto en las células 12,31,32,37.

La digestión con tripsina de simulacros de lisados ​​de células infectadas resulta en una rápida degradación de RIG-I, mientras que 13 Cl infección conduce a la generación de un 30 kDa resistente a la GAR-I fragmento de la figura 1A. También PKR muestra resistencia parcial a la digestión de tripsina en muestras infectadas, lo que coincide con su fosforylation Figura 1A. Para supervisar la eficiencia y la especificidad de la digestión con tripsina, los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie G-250. Las muestras no tratadas muestran cantidades iguales de proteínas cargadas Figura 1B. Someter a 13 lisados ​​celulares simuladas y Cl a la digestión de tripsina conduce a una disminución comparable de las cantidades de proteínas globales. Esto demuestra que el tratamiento con tripsina tiene la misma eficacia para las muestras de 13-infectados de forma simulada y Cl.

La formación de complejos oligoméricos se ensayó por PAGE nativa. En las células no infectadas, sólo monómeros de RIG-I y PKR se detectaron Figura 2. Como control adicional incluimos el factor de transcripción IRF-3, que está presente como un monómero, pero conocida a dimerizar tras la activación a través de por ejemplo, RIG-I 38. Cl 13 infección conduce a una fuerte acumulación de complejos oligoméricos-RIG I en forma de una mancha y de PKR y la FIC-3 dímeros / oligómeros como una banda de proteína definido.

class = "jove_content"> Estos resultados demuestran que la digestión con tripsina limitado y PAGE nativa son herramientas útiles para monitorear los cambios conformacionales y la formación de oligómeros de RIG-I y PKR tras la infección.

Figura 1. Cambio conformacional de RIG-I y PKR. Células A549 fueron simulacros de infectados o infectadas con Cl 13 en una MOI de 5. Después de 5 horas, las células fueron zadas en PBS suplementado con 0,5% Triton X-100 y se despeja lisados ​​celulares fueron dejaron sin tratar o se trataron con tripsina. Las muestras fueron sometidas a SDS PAGE seguido por transferencia Western (A) o tinción de Coomassie (B). Las transferencias se tiñeron contra RIG-I, PKR, PKR fosforilada (Thr 446) y contra la nucleoproteína RVFV (RVFV N) y beta-actina como infección y control de carga, respectivamente._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Oligomerización de RIG-I, PKR, y de IRF-3. Lisados ​​celulares de lisados ​​de células 13-infectados de forma simulada y Cl se sometieron a PAGE natural seguido por análisis de transferencia Western. La tinción se realizó con anticuerpos contra RIG-I, PKR, IRF-3, y beta-actina como control de carga. Oligómeros PKR probablemente, representan dímeros 27. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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