Un modelo de ratón de la reconstrucción endoscópica de base de cráneo humano se ha desarrollado que crea una interfaz semipermeable entre el cerebro y la nariz con injertos de mucosa nasal. Este método permite a los investigadores estudiar la entrega al sistema nervioso central de la terapéutica de alto peso molecular que se excluyen de otra manera por la barrera sangre-cerebro cuando se administra sistémicamente.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Entrega de agentes terapéuticos en el cerebro se ve impedida por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB), que restringe el paso de compuestos polares y de alto peso molecular de la sangre y en el tejido cerebral. Algún éxito la entrega directa en los seres humanos se ha logrado a través de la implantación de catéteres transcraneal; Sin embargo este método es altamente invasivo y asociada con numerosas complicaciones. Una alternativa menos invasiva sería para dosificar el cerebro a través de un implantado quirúrgicamente, membrana semipermeable tal como la mucosa nasal que se utiliza para reparar defectos de la base del cráneo siguiente transnasal tumor de la cirugía de extracción endoscópica en los seres humanos. Transferencia del fármaco a pesar de esta membrana evitaría eficazmente la acreditación y difundirse directamente en el cerebro y líquido cefalorraquídeo. Inspirado por este enfoque, un enfoque quirúrgico en ratones fue desarrollado que utiliza una membrana donante de la mucosa septal injertado sobre un extracraneal quirúrgica acreditación defecto. Este modelo se ha demostrado que efectivamentepermitir el paso de compuestos de alto peso molecular en el cerebro. Puesto que numerosos fármacos candidatos son incapaces de cruzar la BHE, este modelo es valiosa para la realización de los ensayos preclínicos de nuevas terapias para enfermedades neurológicas y psiquiátricas.
Introducción
El tratamiento de la enfermedad neurológica y psiquiátrica está severamente obstaculizada por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB) que impide que más del 95% de todos los posibles agentes farmacéuticos de alcanzar el sistema nervioso central 1-3. Por ejemplo, factor neurotrófico derivado del glial (GDNF) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson cuando se inyecta directamente en el cerebro, sin embargo, es ineficaz cuando se entrega sistémica, ya que no puede penetrar la acreditación 4-6.
Numerosos acercado se han desarrollado para tratar de solventar este problema. Mejoras en la administración sistémica de neurotheraputics se ha demostrado mediante el uso de conjugados de fármaco que contienen anticuerpos selectivos para proteínas de transporte situados sobre el endotelio capilar cerebral; Sin embargo este método no ha demostrado ser aplicable para una amplia gama de productos farmacéuticos 7,8. Además, la apertura osmótica de la BBB ha sido utilizado clínicaaliado, sin embargo, este método adolece de la dosificación del fármaco sistémico en oposición a una entrega más directo a la región del cerebro de interés 9. Esfuerzo considerable se ha puesto en la optimización de la entrega transnasal con la esperanza de dirigirse directamente al cerebro 10-12. Aunque algo de éxito se ha logrado, resultados concluyentes sólo se han obtenido para fármacos que poseen receptores endógenos, tales como la insulina 13,14. Además, el mecanismo de entrega transnasal ha sido motivo de controversia con la evidencia que sugiere la entrada indirecta en el cerebro a través de la captación de la neurona olfatoria o por el torrente sanguíneo 11. La entrega directa, transcraneal utilizando catéteres implantables se ha conseguido, sin embargo este procedimiento es altamente invasiva y asociada con numerosas complicaciones 15,16. Hasta la fecha, no hay ningún método general, mínimamente invasivo para entregar compuestos de alto peso molecular en el cerebro.
Presentado en el presente documento es un procedimiento quirúrgico murinoque crea una interfaz semipermeable con el cerebro. Esto se logra de injerto de un explante de la membrana mucosa 17 sobre un defecto craneotomía quirúrgica en un ratón. El uso de este procedimiento se ha demostrado que los compuestos solubles de hasta 500 kDa pueden ser entregados en el sistema nervioso central (directamente en el parénquima cerebral, así como en el líquido cefalorraquídeo) tanto en un tiempo y manera dependiente de peso molecular 18. Este método de pasar por la acreditación es un modelo para la reparación de defectos de base de cráneo en los seres humanos que utiliza injertos de mucosa vascularizados para reparar agujeros en el cráneo después de la cirugía endoscópica transnasal 19,20.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Antes de la cirugía asegúrese de todos los procedimientos que hay que hacer son aprobados por IACUC y las autoridades éticas o legales adicionales y utilizan prácticas de tratamiento de los animales sin causarles daño. Esto incluye el uso de cirugía condiciones estériles, anestesiar el ratón usando IACUC método aprobado, lubricantes ojos ratones con la pomada de veterinario durante la cirugía, y la prestación de atención posquirúrgica. No continúe con la cirugía si hay alguna cuestión de si se aprueban aspectos del procedimiento. Todos los procedimientos realizados en este documento fueron aprobados por el Comité Universitario Institucional Cuidado de Animales y Uso Boston.
1. Preparación de los animales y Suministros Quirúrgicos
- Autoclave todo instrumento quirúrgico que se utiliza durante la cirugía.
- Asegúrese de que todas las técnicas que se van a realizar son aprobados por los organismos reguladores de los animales.
2. La recolección de la mucosa del injerto
- Elija un ratón genéticamente idéntico de edad similar a lael ratón experimental y practicar la eutanasia en un método aprobado IACUC (aquí: la asfixia isoflurano seguido por dislocación cervical).
- Con unas tijeras quirúrgicas, quitar la piel alrededor de la región nasal de la cabeza del ratón exponer el cráneo.
- Con un taladro neumático, marca con tres líneas dos de los cuales flanquean lateralmente la región nasal y una tercera en la línea de los ojos que conecta las dos líneas perpendiculares.
- Perforar abajo ventralmente con el fin de separar el tabique nasal del tejido circundante. Un camino más amplio evitará daños a la membrana de la mucosa sin embargo, también hará que sea más difícil aislar la membrana. Se recomienda un corte estrecho cerca de la línea media.
- Utilice unas tijeras para cortar el tabique libre de cualquier tejido adherido al mismo y guárdelo en una solución salina estéril. En este momento el injerto se puede limpiar para eliminar cualquier tejido conectado. La situación ideal es tener las membranas mucosas no dañadas expuestas en ambos lados del tabique cartílago. Uno grpopa se puede suministrar de membrana para dos ratones proporcionó el área de la superficie de la membrana es suficiente para cubrir los sitios de craneotomía. Se recomienda que el injerto se utiliza lo más rápidamente posible y el investigador procede a la etapa 3, tan pronto como se aísla el injerto.
3. Implantación quirúrgica de la mucosa del injerto
- El uso de procedimientos estándar, asépticas murinos quirúrgicos, anestesiar y montar un ratón en el marco estereológico. Utilice aproximadamente 2% de isoflurano en oxígeno puro usando una máquina de anestesia de roedores.
- Inmovilizar el ratón en un aparato estereotáxico con barras de oído y un soporte de la nariz. Aplique una pomada oftálmica para los ojos y frote el cuero cabelludo con betadine y etanol al 75% durante tres rondas. El uso de cualquiera de tijeras o un cortador de pelo, quitar el pelo de la cabeza. Exponer el cráneo con una hoja de afeitar y nivelar la cabeza. Realizar una craneotomía por encima de la ubicación del cerebro que se dosifica. Por ejemplo, cuando la orientación del cuerpo estriado cortar un 1,25 mmdiámetro del orificio circular en el cráneo (con centro en AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) usando un taladro neumático. Humedecer la zona perforada con solución salina estéril y utilizar una hoja de afeitar para quitar el cráneo.
- Retire con cuidado la duramadre con la punta de una aguja. Además, esto se puede lograr mediante la aplicación de una cantidad mínima de adhesivo tisular a la superficie de la duramadre húmedo. Una vez que esta capa se ha endurecido, el movimiento lateral con una punta de cuchilla de afeitar se puede utilizar para eliminar la membrana.
- Coloque la membrana de la mucosa por encima de la superficie del cerebro teniendo cuidado extremo para mantener el lado epitelial hacia fuera de la herida. Esto se hace mejor mediante la transferencia de todo el tabique sobre la superficie del cráneo adyacente al sitio de la craneotomía con pinzas. Con la punta de un par de tijeras quirúrgicas, tire de la membrana fuera del cartílago y en la superficie del cráneo y del cerebro. No deje que la membrana se seque o toque con cualquier material absorbente. El injerto debe superponerse generosamente todos los bordes óseos de la craneotomía site.
- Cubra el injerto con una pieza estéril de nitrilo. Esto actúa para impedir la adherencia de la piel al injerto durante la cicatrización. El nitrilo necesita ser lo suficientemente grande como para cubrir toda la membrana de la mucosa. Recorte membrana excesiva si es necesario. Evite cualquier movimiento del nitrilo, una vez que ha entrado en contacto con el injerto.
- Cierre la piel con una sutura 5-0 estéril y dejar correr el ratón recuperar durante 3-7 días antes de proceder a la siguiente etapa. Tenga cuidado de no perturbar la barrera de nitrilo o el injerto de mucosa durante el cierre de la piel.
4. Administración de la solución de dosificación
- Después de asegurar el ratón anestesiado en el marco estereotáxico, cortar la sutura con unas tijeras y eliminar el exceso de piel alrededor del cráneo.
- Retire la barrera de nitrilo y limpiar la superficie del cráneo. Utilice salinos y algodón hisopos estériles para limpiar el área hasta que el injerto es visible. Puede ser necesario cortar el injerto con una maquinilla de afeitar si ha crecido más grande que el desired superficie.
- Si el experimento será más de unos pocos días, es conveniente implantar al menos dos tornillos del cráneo para reforzar el implante de cabeza.
- Coloque el muy por encima del injerto de modo que los bordes están en contacto con el cráneo. Aplicar el adhesivo de cianoacrilato en la unión entre el pozo y el cráneo. Llene el bien con solución salina estéril y comprobar para asegurarse de que no haya fugas. Wells se hacen de agujas de jeringa corte.
- Aplique cemento para huesos en el cráneo para asegurar el bien en su lugar.
- Quitar la solución salina desde el pozo con una pipeta. Lave bien las varias veces para verificar que el adhesivo no se ha filtrado in Agregar la solución deseada; en este caso se utiliza 50 l de dextrano fluorescente. Se espera que los compuestos solubles en agua de una polaridad similar se comportan de la misma como dextrano. Entrega de compuestos hidrófobos o suspensiones no ha sido explorado con este método.
- Se tapa la parte superior del pozo mediante el uso de una pieza circular de nitrilo asegurado a laarriba usando adhesivo de cianoacrilato. Asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con los contenidos del pocillo.
5. Análisis de transmucosa de entrega
- Una vez transcurrido el período de tiempo deseado, anestesiar el ratón y el intercambio de los contenidos del pocillo con una solución de colorante azul de Evan. Este colorante se utiliza para verificar que el injerto estaba intacto.
- Después de 30 min, anestesiar el ratón en gran medida, se retira la solución colorante, y la eutanasia mediante decapitación.
- Elimine manualmente el implante y retire el cerebro utilizando tijeras quirúrgicas. Tenga cuidado de mantener el injerto en su lugar.
- Una vez retirado, el flash-congelar el cerebro en una solución de isobutano se enfrió en un baño de hielo seco.
- Incrustar el cerebro en temperatura óptima de corte solución (OCT) y el tramo a 50 micras.
- Colocar las rebanadas deseadas directamente en un portaobjetos de microscopio.
- Imagen de la rebanada utilizando un microscopio de fluorescencia tan pronto como la solución de octubre se ha secado.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La obtención de una lo suficientemente grande como explante tabique nasal es crucial para las etapas subsiguientes. Esto se puede lograr mediante la perforación en el lugar en el cráneo del ratón donante se muestra en la Figura 1a. Corte a lo largo de este camino producirá un explante de suficiente tamaño como se muestra en la Figura 1b. Si la profundidad de la perforación no es lo suficientemente profunda, el injerto será truncado y que será difícil obtener una membrana lo suficienteme...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El paso más difícil del procedimiento descrito en el presente documento es la transferencia con éxito de una membrana mucosa de tamaño adecuado sobre la superficie del cerebro. Este paso se hace mucho más fácil si el tabique nasal cosechado es lo suficientemente grande y las limpiaban bien. Si se trunca la porción ventral del septum, se debe obtener un nuevo injerto. El ángulo de perforación debe ser perpendicular a la cabeza del ratón para asegurar que la membrana de la mucosa no es dañado por el taladro. Si se toma un...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Benjamin S. Bleier MD es el inventor de plomo de los métodos de recubrimiento de patente provisional de la administración de fármacos al sistema nervioso central.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la Fundación Mcihael J. Fox para la Investigación del 2011 Innovaciones de Respuesta Rápida de Parkinson Programa de Premios. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurano | Piramal Healthcare | ||
| Estudiante tijeras finas | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Taladro neumático | MTI Dental | 333-CB | |
| Broca | |||
| Pinzas | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Inyección de cloruro de sodio al 0,9% USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Placa de Petri de poliestireno | Fisher | 08-757-12 | para el almacenamiento temporal de injertos |
| Esterilizador de perlas | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sistema de oxígeno/isoflurano | SurgiVet | ||
| sistema de control de temperatura | Physitemp | TCAT-2LV | |
| instrumento estereotáxico para animales pequeños | KOPF | Modelo 940 | |
| Pomada ocular Afeitadora | |||
| Aplicadores con punta de algodón | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone yodo | Betadine exfoliante quirúrgico | ||
| 70% Etanol | |||
| Cuchilla quirúrgica inoxidable | Feather | 2976#10 | |
| Mango de bisturí - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Peróxido de | para la limpieza del cráneo | ||
| Vetbond adhesivo tisular | 3M | 1469SB | |
| Agujas | Becton, Dickinson and Company | 305176 | punta de aguja cortada y utilizada así |
| Jeringas | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Guantes de nitrilo | Denville Scientific Inc | G4162 | para el cierre de pozos y la protección del injerto |
| 5-0 Hilo | |||
| Student Halsey portaagujas Fine | Science Tools | 91201-13 | |
| cianoacrilato | superpegamento disponible de forma inmediata | ||
| Kit de cemento dental, 1 lb, rosa opaco | Stoelting | 51458 | |
| Isobutano (2-metilbutano) | Aldrich | M32631 | para baño de hielo seco |
| Hielo |
Referencias
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
