Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y Ex vivo Los fibroblastos

Resumen

Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.

Resumen

Invadir el cáncer colorrectal células (CRC) han adquirido la capacidad de liberarse de sus células hermanas, infiltrarse en el estroma, y ​​remodelar la matriz extracelular (ECM). La caracterización de la biología de este grupo fenotípicamente distintas de células podría mejorar sustancialmente nuestra comprensión de los eventos tempranos durante la cascada metastásica.

La invasión tumoral es un proceso dinámico facilitado por interacciones bidireccionales entre epitelio maligno y el estroma cáncer asociado. Con el fin de examinar las respuestas de células específicas en el estroma interfaz tumor hemos combinado co-cultivo y técnicas de micro-disección láser organotípico.

Modelos organotípicos, en el que los componentes del estroma clave tales como los fibroblastos son 3-dimentioanally co-cultivadas con células epiteliales cancerosas, son herramientas experimentales altamente manipulables que permiten la invasión y las interacciones con el cáncer del estroma para ser estudiados en casi phcondiciones ysiological.

Microdisección láser (LMD) es una técnica que implica la disección quirúrgica y la extracción de los diversos estratos dentro del tejido del tumor, con precisión nivel de micras.

Mediante la combinación de estas técnicas con el perfil genómico, transcriptómica y epigenética nos proponemos desarrollar una comprensión más profunda de las características moleculares de la invasión de las células del tumor y el tejido circundante del estroma, y ​​al hacerlo, potencialmente revelar nuevos biomarcadores y oportunidades para el desarrollo de fármacos en el CCR.

Introducción

Co-cultivos organotípicos son modelos de ingeniería tisular que ayuda en la reconstrucción del microambiente del tumor in vivo en en 3-dimensiones mediante la yuxtaposición de las células epiteliales malignas y células estromales en un gel de colágeno que contiene componentes de la matriz extracelular esenciales ^1-3. Principalmente concebido como un método de medición de la invasión tumoral, organotypics reducir la dependencia en modelos animales in vivo, y evitar las deficiencias de otras técnicas in vitro tales como ensayos Transwell, en el que las células invasoras se ven obligados artificialmente en un estado mono-dispersado ^2-4. La inclusión de las células del estroma en estos modelos, tales como fibroblastos, refleja el papel esencial de la microambiente del tumor en la regulación de la invasión maligna y metástasis ^3-4, sin embargo, la heterogeneidad fenotípica de la estroma es tal que con el fin de maximizar la relevancia fisiológica de organotípicos modelos, específica de órganos, de precisión anatómica ex vivofibroblastos deberían incluirse siempre que sea posible ^{de 3,6.}

Organotypics son una plataforma versátil para estudiar las interacciones entre el tumor y las células del estroma y se utilizan cada vez más en nuevas formas de examinar el impacto en la invasión tumoral de los inhibidores químicos y alteraciones genéticas específicas ^7,8. Estudiar el margen del tumor invasivo es una perspectiva particularmente emocionante. En los modelos organotípicos, cáncer colorrectal establecido (CRC) las líneas celulares se caracterizan por producir una capa epitelial bien estratificada, y en sección transversal, las células que han adquirido la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM) son fácilmente discernibles. A la luz de la heterogeneidad de micro-topográfico establecido de tumor y el tumor asociado células estromales in vivo, la extracción de estas células usando microdisección láser y el estudio de ellos en el aislamiento, puede revelar importantes conocimientos biológicos con respecto a los orígenes de la metástasis del cáncer colorrectal y cómo puede ser más eficiente apuntado. Yon la siguiente metodología, todos los pacientes que donaron muestras de tejidos por escrito el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por los comités de ética instituciones regionales de investigación.

Protocolo

1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos primarios de colon explantes

1. Obtener muestras de tejido normal de la mucosa del colon humano directamente de la sala de operaciones quirúrgica, y suspender en 7-10 ml de PBS suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,25 mg / ml de Fungizone.
2. En el laboratorio, colocar la muestra en el centro de un 10 cm de placa de cultivo tisular y lavar 3 veces con PBS / Pen-Strep / Fungizone. No aspirar después del último lavado.
3. Con pinzas y bisturí estériles, cortar el tejido en trozos pequeños (aproximadamente 2 mm) y colocar cada pieza en el centro de una cruz dibujada con la hoja de bisturí en una placa de 12 pocillos. Rock the bisturí suavemente sobre el tejido para permitir que se adhiera.
4. Cultura los especímenes en 750 l de medios de crecimiento de fibroblastos primario (DMEM suplementado con 20% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 292 mg / ml de L-Glutamina), que debe submerge del tejido sin que le permite flotar. Evite molestar a la placa en los próximos 5 días, salvo para volver a la alimentación cada 2 días.
5. Durante los siguientes 5 días fibroblastos se lentamente comenzar a crecer fuera desde el borde del tejido. En aproximadamente 7 días, este será más visible. Después de aproximadamente 3-4 semanas, y si no son suficientes los fibroblastos que crecen fuera, añadir 750 l de tripsina a cada pocillo. Después las células se han separado (que puede tardar 5-10 min), la piscina y la transferencia a un matraz de cultivo tisular T-25.

2. Preparación Organotípicos

Preparación de los fibroblastos impregnada de gel de organotípicos:

1. Preparar una suspensión de células de fibroblastos que contiene 5 x 10 ⁵ células por organotípicos en DMEM suplementado con 10% de FCS y 292 mg / ml de L-Glutamina.
2. Se llevan los geles organotípicos en el hielo, en las siguientes proporciones:
   • 7 volúmenes de colágeno de cola de rata: mezcla de Matrigel (01:01)
   • 1 volumen de filtrado 10x DMEM
   • 1 volumen de FCS
   • 1 volumen de suspensión celular de fibroblastos que contiene 5 x 10 ⁵ fibroblastos
     Para 9 geles (1 ml por gel) preparar 10 ml y mezclar suavemente para evitar burbujas.
3. Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera húmeda para permitir que los geles para ajustar. Después de 1 hora se añade 1 ml de DMEM (10% de FCS) / GLUT en la parte superior de los geles y volver a la incubadora durante la noche.
4. Al día siguiente, el medio aspirado desde la parte superior de los geles y la placa 1 ml de medio que contiene 5 x 10 ⁵ células epiteliales CRC.

Preparación de láminas de nylon recubierto de gel:

5. Preparar estéril, hojas de nylon autoclave de 1,5 cm x 1,5 cm, por adelantado.
6. El uso de pinzas estériles, colocar el número requerido de hojas de nylon en una placa de cultivo de 10 cm (por lo general 4 hojas de nylon pueden ser acomodados por plato).
7. Invente gel en el hielo en el siguiente orden (250 l total deSe requiere volumen por hoja de nylon):
   • 7 volúmenes de colágeno de cola de rata
   • 1 volumen de filtrado 10x DMEM
   • 1 volumen de FCS
   • 1 volumen de DMEM 10% FCS / Superabundancia
8. Si la solución es de color amarillo, neutralizar añadiendo 0,1 M de NaOH en 50 ml de alícuotas hasta que la solución se vuelve rosa.
9. Añadir 250 l de esta solución a cada lámina de nylon y se incuba a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ durante 30 minutos para permitir gel se cuaje.
10. Invente solución de glutaraldehído al 1% en PBS. Añadir 10 ml a cada 10 cm de placa de cultivo una vez que el gel se haya establecido y se incuba a 4 ° C durante 1 hora.
11. Sábanas de nylon lava 3X en PBS y 1x en DMEM (10% de FCS) / Glu y Incubar toda la noche en DMEM / Glu en 4 ° C.

Elevar geles organotípicos en las parrillas de acero para la invasión:

12. Pre-preparar rejillas de andamiaje por plegado de chapas de acero inoxidable en una formación de trípode. Esterilizar en autoclave antes de su uso.
13. El uso de fórceps esterilizados en etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.
14. Coloque una lámina de nylon recubierto de gel con la parte superior de colágeno, en cada cuadrícula.
15. Transferir cuidadosamente los geles organotípicos de la placa de 24 pocillos a la lámina de nylon planteado usando una espátula esterilizada en etanol.
16. Llenar el pocillo con DMEM 10% de FCS / GLUT suplementado con 10% de FCS hasta que la lámina de nylon está en contacto con el medio, pero no sumergido. Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico.
17. Incubar durante 14 días a 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO _2, en sustitución de los medios de comunicación cada 2 días.

3. Organotípicos Fijación

1. Retire toda organotípico incluyendo lámina de nylon del bien y colocar en papel film.
2. Biseccionar organotípico y lámina de nylon con un bisturí desechable limpio y fijar las dos mitades en formol durante 24 horas a temperatura ambiente.
3. Reemplace formaldehído con 70% ethanol después de 24 horas y dejar toda la noche antes de la inclusión en parafina, seccionando y tinción.

4. Microdisección láser del Margen Invasiva

1. Sección a 10 micras de espesor sobre una membrana de diapositivas montadas.
2. Desparafinar secciones mediante la aplicación de xileno durante 1 minuto, luego retire Xileno y fijan en etanol al 75% durante 1 min.
3. Eliminar el etanol y tinción con solución de violeta de cresilo 0,125% durante 1 min. Cresil violeta resalta las células epiteliales y permite una fácil discriminación de la estroma.
4. Eliminar violeta de cresilo y aplicar etanol al 100% durante 1 min antes de enjuagar con etanol al 100%. Permitir diapositivas secar al aire durante 30 min.
5. Realizar microdisección láser utilizando plataforma elegida (por ejemplo, el sistema Leica AS).
6. Coloque la placa de vidrio con la sección manchada que se microdissected boca abajo en la platina del microscopio.
7. Montar un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el casete de la colección y añadir 50 l detampón de lisis celular (por ejemplo, ADN, ARN o proteína de tampón de lisis) a la tapa en la que el tejido microdissected recogerá.
8. Bajo visión directa, utilice el joystick para identificar el tejido de interés, y el uso de la interfaz de software, realizar anotaciones en la sección orgánica de colores, destacando las células que se microdissected en el frente de invasión tumoral.
9. Instruir al láser para disparar, que debe tanto cortar la sección resaltada e impulsar el tejido microdissected en la tapa del tubo de microcentrífuga.
10. Una vez que el material suficiente se ha recogido, expulse el cassette colección, cerrar el tubo de microcentrífuga y girar suavemente para sacarla del tampón de lisis a la parte inferior del tubo.
11. Coloque las muestras en hielo hasta microdisección se ha completado. Procesar muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés.

Resultados

Hemos aplicado el método anterior para múltiples combinaciones de líneas celulares de CRC y células del estroma. Un ejemplo que se presenta aquí es las líneas de células SW480 epitelial CRC con ex vivo fibroblastos primarios de colon humano. Co-cultivos 3-dimensionales se construyen (Figura 1), se sometieron a microscopía de láser y microdisección de captura (Figura 2), y se analizaron por microARN (miARN) de perfiles (Figura 3) para la comparación de miRNAs ex...

Discusión

Aquí se describe un método para aislar y caracterizar las células tumorales que han adquirido la capacidad de invadir el estroma asociado cáncer durante las primeras etapas de la progresión metastásica en un constructo de co-cultivo de 3 dimensiones de células epiteliales y estromales específicamente.

Se utilizaron modelos de co-cultivo formadas por células epiteliales CRC yuxtapuestos con un estroma sintética que contiene ex vivo fibroblastos colon humano para estudiar la invasión ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Líneas celulares de cáncer colorrectal - ejemplo mostrado SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Colágeno	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Membrana de nylon	Merck Millipore	VVLP01300
Rejilla metálica	The Mesh Company	WSS20-A4
themeshcompany.com Laser plataforma de microdisección	: Leica Microsystems	, Leica AS LMD,
portaobjetos montados en membrana	, dispositivos
moleculares, Cresyl, violeta	Merck, Millipore	1052350025