Artículo de método

Evaluación de la función vascular en pacientes con enfermedad renal crónica

DOI:

10.3791/51478

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16 de junio de 2014

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1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El grado de disfunción vascular y contribuir mecanismos fisiológicos se puede evaluar en los pacientes con enfermedad renal crónica mediante la medición de la dilatación de la arteria braquial mediada por flujo, velocidad de onda de pulso aórtica y vascular endotelial la expresión de proteínas de la célula.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) han aumentado significativamente el riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV) en comparación con la población general, lo que se explica sólo en parte por factores de riesgo de ECV tradicionales. Disfunción vascular es un factor de riesgo no tradicional importante, caracterizado por la disfunción endotelial vascular (más comúnmente evaluado como deteriorado dependiente del endotelio dilatación [EDD]) y la rigidez de las grandes arterias elásticas. Si bien existen varias técnicas para evaluar EDD y la rigidez de la arteria elástica grande, la más comúnmente utilizados son la dilatación de la arteria braquial mediada por flujo (FMD BA) y la velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV), respectivamente. Ambas medidas no invasivas de la disfunción vascular son predictores independientes de eventos cardiovasculares futuros en pacientes con y sin enfermedad renal. Los pacientes con enfermedad renal crónica demuestran tanto deteriorada fiebre aftosa BA, y el aumento de aPWV. Aunque el mecanismo exacto por el cual deve disfunción vascularlops en la ERC se conocen por completo, un aumento del estrés oxidativo y la consiguiente reducción en el óxido nítrico (NO) la biodisponibilidad son contribuyentes importantes. Cambios celulares en el estrés oxidativo se pueden evaluar mediante la recopilación de las células endoteliales vasculares de la vena antecubital y la medición de la expresión de proteínas de los marcadores de estrés oxidativo utilizando inmunofluorescencia. Ofrecemos aquí una discusión de estos métodos para medir la fiebre aftosa BA, aPWV y vascular endotelial la expresión de proteínas de la célula.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad renal crónica (ERC) es un importante problema de salud pública que ha alcanzado proporciones de epidemia, afectando ~ 11,5% de la población, sólo en 1 de los Estados Unidos. El riesgo de muerte cardiovascular o un evento cardiovascular en los pacientes con ERC se incrementa de manera significativa en comparación con la población general 2-4. Aunque los pacientes con ERC presentan una alta prevalencia de factores de riesgo cardiovascular tradicionales, esto sólo explica parte de su aumento de la incidencia de enfermedad cardiovascular (ECV) 5. Disfunción vascular es un importante factor de riesgo cardiovascular no tradicionales ganando mayor reconocimiento en el campo de la nefrología 6-9.

Mientras que muchos cambios probablemente contribuyen al desarrollo de la disfunción arterial, entre los de mayor preocupación son el desarrollo de la disfunción endotelial vascular, más comúnmente evaluada como la dilatación dependiente del endotelio alterada (EDD), y la rigidez de la Large arterias elásticas 10. Existen diversas técnicas para evaluar EDD y la rigidez de la arteria elástica grande, pero el más comúnmente utilizado son la dilatación mediada por flujo de la arteria braquial fiebre aftosa BA y la velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV), respectivamente. Otra técnica muy utilizada para evaluar EDD es medir el antebrazo respuesta del flujo sanguíneo a los agentes farmacológicos tales como la acetilcolina utilizando pletismografía de oclusión venosa 11,12. Sin embargo, esta metodología requiere la cateterización de la arteria braquial, que es más invasiva que la fiebre aftosa BA y puede ser contraindicado en pacientes con ERC. Una técnica alternativa para evaluar la rigidez arterial es medir la distensibilidad arterial locales (la inversa de la rigidez) de la arteria carótida, aunque esto no es tan ampliamente utilizado o validado con puntos finales clínicos como aPWV 13.

Los pacientes con enfermedad renal crónica demuestran tanto deteriorada fiebre aftosa BA 14-16 y una mayor velocidad de la onda del pulso aórtico aPWV 13,17,18, incluso antes de necesitar diálisis. Es importante destacar que desde una perspectiva clínica, tanto de estas medidas no invasivas de la disfunción vascular son predictores independientes de futuros eventos cardiovasculares y la mortalidad en pacientes tanto con ERC 19-21, así como en otras poblaciones 22-26. Estas técnicas se pueden aplicar al estudio de varias poblaciones en situación de riesgo de las enfermedades cardiovasculares, incluidos los pacientes con ERC.

Los mecanismos exactos por los que la disfunción arterial se desarrolla en la ERC se conocen por completo; Sin embargo, la reducción de óxido nítrico (NO) biodisponibilidad es un contribuyente fundamental 27-30 y un mecanismo común de ambos impedimentos EDD y el aumento de la rigidez arterial 10,31. En la ERC, el estrés oxidativo se incrementa y contribuye a la reducción en la biodisponibilidad de NO 32-34. El estrés oxidativo se define como biodisponibilidad excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) relativos a las defensas antioxidantes. Estímulos fisiológicos, incLuding señalización inflamatoria, promover sistemas de enzimas oxidantes para producir ROS, incluyendo el anión superóxido (O 2 ● -) (por ejemplo, la enzima oxidante NADPH oxidasa.) 35. Producción de superóxido conduce en última instancia a reduce la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO).

Deterioro de la biodisponibilidad de NO puede a su vez contribuir al desarrollo de la ERC, como la disfunción endotelial es un predictor independiente de la ERC incidente 36. Esto es consistente con los datos en animales que demuestran que la inhibición de la eNOS induce hipertensión (sistémica y glomerular), isquemia glomerular, glomeruloesclerosis y daño túbulo-intersticial 37. De hecho, parece necesario reducir la biodisponibilidad de NO para el desarrollo y la progresión de la enfermedad renal experimental que imita la enfermedad humana, lo que sugiere un papel clave para la disfunción endotelial en la enfermedad renal crónica humana 38,39.

Marcadores de estrés oxidativo vascular pueden ser evaluados en vascular células endoteliales recolectados de sujetos humanos de investigación, utilizando una técnica desarrollada originalmente por Colombo et al. 40 y modificado Seals et al 41-43. Uso de 2 J-alambres estériles, las células se recogieron de la vena antecubital, recuperado, fijo, y más tarde identificado positivamente como células endoteliales y se analizaron para la expresión de proteínas de interés usando inmunofluorescencia.

Ofrecemos aquí una discusión de esta metodología que se puede utilizar para: a) la medida de la fiebre aftosa BA; b) medir aPWV; c) medir endotelial vascular expresión de la proteína celular de los marcadores de estrés oxidativo. La atención se centra en los pacientes con ERC, que no requieren diálisis crónica.

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Protocolo

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Este protocolo sigue las directrices de la Junta de Revisión Institucional múltiple Colorado (COMIRB).

1. Preparación para las pruebas Sesión

  1. Los participantes deben seguir las siguientes restricciones para realizar mediciones más precisas: 12 hr ayuno de comida y cafeína, 12 horas de restricción de ejercicio, 12 horas de restricción de fumar, en su caso,> 4 moderación vida media de los medicamentos si es posible (puede no ser factible en un población, como los pacientes con ERC), y las mujeres pre-menopáusicas deben ser probados en los días 1-7 del ciclo menstrual para reducir al mínimo las influencias hormonales.
  2. Preparar 500 ml de tampón de disociación por la adición de 2 ml de 0,5 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,05 g de heparina (180 unidades USP / mg), y 2,5 g de albúmina de suero bovino a 476,8 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH de 7,4. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses.
  3. Encienda el ultrasonido, el ordenador y la hemodinámica no invasivaEstación de trabajo (NIHem, equipo rigidez arterial). Conecte los cables de la salida de la ecografía para la caja del gatillo de la onda R del ordenador.

2. Recopilación y procesamiento de células endoteliales vasculares

  1. Una enfermera o un médico entrenado realiza la recolección (pasos 2.2 a 2.5, 2.7) y un investigador recopila y procesa los cables (pasos 2.6, 2.8 a 2.19)
  2. Prepara el sitio antecubital con un antiséptico tópico, aplicar un torniquete, localizar la vena, y cannulate con un catéter 18 G. Colocar un adaptador de heplock en el extremo de la IV.
  3. Póngase los guantes estériles y poner paños fenestrados estériles sobre el sitio.
  4. Coloque 2 J-cables en las cortinas. Tire del arco de la "J" para desenrollar la forma de "J" de los dos cables.
  5. Destape la heplock y alimentar a J-cable en la vena de aproximadamente 8 cm. Empuje hacia atrás y hacia adelante varias veces antes de retirar el cable. Evite arterial grave por cable.
  6. Use cortadores de alambre para cortar los cables para que quepan en unTubo cónico de 50 ml que contiene ~ 30 ml de tampón de disociación
  7. Repita el paso 2.5 para el segundo alambre.
  8. Repita el paso 2.6 para el segundo alambre. Tubo de retorno al laboratorio húmedo.
  9. Sus brazos a los cables con un par de fórceps y mantener los cables en el interior del tubo, pero por encima de la solución. Durante 10 min, utilizar una pipeta motorizada para recoger varias veces el tampón de disociación desde el tubo cónico de 50 ml y liberarlo de modo que se ejecuta abajo de la longitud de los cables para enjuagar y vibrar los cables, a continuación, sacuda el exceso de líquido de los cables en el tubo.
  10. Centrifugar durante 7 minutos a 400 x g y 4 ° C.
  11. Preparar la solución de formaldehído en tubo de aluminio recubierto mediante la combinación de 100 ml de solución de formaldehído + 900 ml de PBS.
  12. Lentamente retire el tubo de centrífuga, encender la bomba de vacío, coloque una punta de la pipeta en el extremo de la manguera de succión y dejar ~ 400 ml en el tubo, la aspiración de los demás y sin perturbar el sedimento.
  13. Cubra con papel aluminio y pipeta de 1 ml de solución de formaldehído enel tubo para fijar la muestra. No volver a suspender. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
  14. Preparar 8 diapositivas mediante marcaje con tema y la información visita de estudio y la elaboración de un óvalo en cada portaobjetos con una pluma de Papanicolaou.
  15. Añadir 15 ml de PBS, volver a suspender, y se centrifuga durante 5 min a 400 xg y 4 º C.
  16. Repita el paso 2.15, agregar 12 ml de PBS, resuspender y centrifugar durante 6 minutos a 400 x g y 4 ° C.
  17. Lentamente retire el tubo de centrífuga, encender la bomba de vacío, coloque una punta de la pipeta en el extremo de la manguera de succión y dejar ~ 2 ml en el tubo, la aspiración de los demás y sin perturbar el sedimento.
  18. Resuspender y pipeta de forma homogénea en las 8 toboganes en las áreas ovales.
  19. Coloque en la incubadora a 37 ° C durante 5 horas y luego almacenan a -80 ° C hasta que esté listo para su análisis (muestras estarán bien durante muchos años).

3. Evaluación de la fiebre aftosa y BA aPWV

  1. Haga que la investigación del cambio sujeto en pantalones cortos desechables y tienen him / su supina mentira en una tranquila tenue, ambiente, clima controlado.
  2. Coloque el número apropiado de ECG para la ecografía específica y el dispositivo de la rigidez arterial (este procedimiento se utiliza la no invasiva hemodinámica estación de trabajo [NIHem] para medir la rigidez arterial, que requiere 4 electrodos) y manguito de presión arterial en sujetos.
  3. Después de 20 minutos, comenzará lecturas de la presión arterial. Realizar al menos 3, y repetir hasta que las mediciones están dentro de 5 mmHg, descansando 2 minutos entre cada lectura.
  4. Comience tonometría palpando el pulso de la arteria braquial y colocar el tonómetro para registrar las formas de onda braquial mediante el programa de software.
  5. Repita el procedimiento para las arterias radiales, femorales y carótidas.
  6. Medir la distancia a cada uno de estos sitios de la muesca supersternal utilizando una cinta métrica (braquial, radial y carotídeo) y una regla personalizada / pinza (femoral).
  7. Calcular la carótida-braquial, la carótida-radial y carotídeo-femoral (aPWV) utilizando el programa de software.
  8. Lugarmanguito de presión arterial antebrazo distal al olécranon y grabar al menos 10 ciclos cardíacos de imágenes de ultrasonido de la arteria braquial de referencia y medidas de la velocidad del flujo sanguíneo, con un software vascular se establece en el modo de accionar. Un brazo mecánico se puede utilizar para estabilizar la sonda de ultrasonido, si se desea.
  9. Inflar el antebrazo manguito de presión arterial a 250 mmHg y comenzar temporizador. Instruya a los participantes a permanecer muy quieto.
  10. Comience velocidades de grabación con un conjunto de software vascular al modo de disparar cuando el temporizador lee 04:45. Suelte el gatillo del manguito a las 5:00 y cambiar el ultrasonido para grabar imágenes en modo B (diámetro) cuando el reloj marca las 05:10.
  11. Continuar el registro hasta que el reloj marca las 7:00.
  12. Consigue al menos 10 ciclos cardíacos de imágenes de ultrasonido de la arteria braquial de referencia con un software vascular establecido en el modo de disparo.
  13. Tomar la presión arterial del sujeto. Si la presión arterial sistólica> 100 mmHg, coloque 0,4 mg de nitroglicerina sublingual debajo de la asignatura y# 39; s lengua y comenzar temporizador, a menos que el paciente tiene otra contraindicación.
  14. Comience a grabar en modo B (imágenes de diámetro) cuando el reloj marca las 03:00 con el software vascular establecida en modo de disparo.
  15. Detenga la grabación cuando el reloj marca las 08:00.
  16. Vigilar la presión arterial hasta que vuelva a la línea de base

4. Preparación de vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC) Control Slides

  1. Crecer HUVECs al paso 5-6 y ~ 80% de confluencia.
  2. Tripsinizar con 3 ml de tripsina o lo que sea necesario para el plato / recipiente.
  3. Neutralizar la tripsina usando un volumen igual de solución de neutralización de tripsina.
  4. Centrifugar a 200 xg durante ~ 5 min y eliminar la tripsina y la solución de neutralización por vacío.
  5. Resuspender en 10 ~ ml de PBS para lavar.
  6. Centrifugar a 200 xg ~ 5 min. Retire PBS.
  7. Retire PBS y fijar en 1800 l de PBS + 200 l de formaldehído.
  8. Resuspender en PBS (~ 10 ml).
  9. Centrifugar a 200 xg ~5 min. Retire PBS, se resuspenden en un volumen apropiado para agregar ~ 200 l por diapositiva.
  10. Diapositivas Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su análisis (muestras estarán bien durante muchos años).

5. La tinción de las células vasculares endoteliales

  1. Tome diapositivas de -80 ° C congelador y esperar 5 minutos a temperatura ambiente (este procedimiento es para un lote de 10 muestras, incluyendo una diapositiva de control HUVEC).
  2. Limpie el exceso de agua con una delicada tarea limpiar (no tocar el centro de la diapositiva).
  3. Re-hidratar las diapositivas mediante la adición de PBS alterado para cada diapositiva y se dejan por 10 min.
  4. Aunque las diapositivas están de pie, preparar 5% de suero de burro y otras soluciones.
    1. Preparar 5% de suero de burro añadiendo 300 l de suero de burro para 5.700 l de PBS alterado (a un pH de 7,4) durante un máximo de 10 diapositivas (aumentar esta cantidad para más).
    2. Diluir el anticuerpo primario de interés en 1000 l de 5% de suero. Por ejemplo, nitrotirosina y NADPHoxidasa (1:300 y 1:1.500) podrían ser utilizados como marcadores de estrés oxidativo.
    3. Preparar AF568 secundaria mediante la dilución de 5 l de AF568 a 1500 μll de 5% de suero.
    4. Preparar VE cadherina mediante la dilución de 2 l de VE cadherina a 1000 l de 5% de suero.
    5. Preparar AF488 diluyendo 5 l de VE cadherina a 1.000 l de 5% de suero.
    6. Mantenga AF568, AF488 VE cadherina y bajo la hoja a través de todo el proceso y luego se coloca en eje de balancín de 4 ° C refrigerador mientras se prepara diapositivas.
  5. Después de 10 minutos de rehidratación, toboganes secos con una tarea delicada limpie.
  6. Añadir 5% de suero de burro durante 60 minutos y coloque un pedazo de lámina de parafina de plástico sobre el área de un círculo para asegurar una cobertura completa de la sustancia química.
  7. Deseche la película de parafina de plástico y láminas secas con una delicada tarea limpie. No lave. Añadir el anticuerpo primario durante 60 minutos y coloque un pedazo de lámina de parafina de plástico sobre el área de un círculo para asegurarla cobertura completa de la sustancia química.
  8. Deseche la película de parafina de plástico, enjuague con PBS alterado de botella con atomizador y sumergirse en las columnas de diapositivas durante 5 min. Aunque las diapositivas están en remojo, los trasladan a una habitación oscura. Trabajar en la oscuridad durante todos los pasos restantes.
  9. Diapositivas secos con Kimwipes, añaden AF568 (anticuerpo secundario) durante 45 minutos y colocar un trozo de película de parafina de plástico sobre el área de un círculo para asegurar una cobertura completa de la sustancia química. Cubra la luz.
  10. Deseche la película de parafina de plástico en el envase para peligros biológicos. Lavar con PBS alterado de botella con atomizador, y luego sumergirse en las columnas durante 5 min.
  11. Diapositivas secos con Kimwipes, a continuación, añadir VE cadherina durante 60 minutos y colocar un trozo de película de parafina de plástico sobre el área de un círculo para asegurar una cobertura completa de la sustancia química. Cubra la luz.
  12. Deseche la película de parafina de plástico en el envase para peligros biológicos. Lavar con PBS alterado de botella con atomizador, y luego sumergirse en las columnas durante 5 min.
  13. Diapositivas secos conuna tarea delicada limpie, añada AF488 durante 30 minutos y coloque un pedazo de lámina de parafina de plástico sobre el área de un círculo para asegurar una cobertura completa de la sustancia química. Cubra la luz.
  14. Deseche la película de parafina de plástico en el envase para peligros biológicos. Lavar con PBS alterado de botella con atomizador, y luego sumergirse en las columnas durante 5 min.
  15. Diapositivas secos con una tarea delicada limpie y deje que se sequen durante 20 min. Cubra la luz.
  16. Añadir una gota única de fluoroshield medio de montaje con 4 ', clorhidrato de 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a cada diapositiva y cubrir cada uno con una hoja de cubierta.
  17. Coloque los portaobjetos en 4 ° C refrigerador cubierto con papel de aluminio. Imaging debe ser completado dentro de 48 horas.

6. Imagen y Análisis de las células endoteliales vasculares

  1. Preparar microscopio para obtener imágenes de las células endoteliales teñidas de acuerdo a las especificaciones del microscopio específico. Un solo técnico ciego debe analizar cualquier proteína particular de un murciélagoCH de las células.
  2. Escanear diapositivas de forma sistemática. Identificar las células endoteliales mediante tinción positiva para VE cadherina y confirmar la integridad nuclear por tinción positiva para DAPI.
  3. Imagen 30 células por diapositiva para su posterior análisis. Repita el proceso para cada diapositiva en el lote de colores, incluyendo el HUVEC.
  4. Analizar la intensidad de la tinción para el anticuerpo primario de interés usando un software de cualitativa.
  5. Para minimizar el posible efecto de confusión de las diferencias en la intensidad de la tinción entre las diferentes sesiones de tinción, los valores del informe como proporción de expresión de la proteína en las células endoteliales recogidos a la misma expresión de la proteína en las HUVEC.

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Resultados

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Fiebre aftosa BA se cuantifica como el cambio máximo en el diámetro de la arteria braquial siguiente hiperemia reactiva. Por lo tanto, el diámetro en reposo se compara con el diámetro tras el final de un período de 5 min manguito de presión arterial de oclusión (Figura 1). El panel A muestra una imagen de ultrasonidos representativa de la arteria braquial, y el panel B muestra un gráfico del cambio de la onda R cerrada en diámetro desde la liberación del manguito a 2 min después, tal como se ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La obtención de resultados precisos para la fiebre aftosa y BA aPWV requiere la adquisición de imágenes de ultrasonido de alta calidad y formas de onda de presión, respectivamente. Para ello resulta fundamental la formación y el uso adecuado y continuo de cada técnica por parte del operador 44. Además, es fundamental para el control de la mayor cantidad de variables externas que pueden influir en los resultados como sea posible mediante la estandarización de la sesión de pruebas (por ejemplo,

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Nina Bispham por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (12POST11920023), y el NIH (K23DK088833, K23DK087859).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
J-wireSt. Jude4045842 por colección
Pantalones cortos desechables (MediShorts)Quick Medical4507
Estación de trabajo hemodinámica no invasiva (NIHem)Cardiovascualr EngineeringN/AIncluye regla personalizada.  Un sistema alternativo es el Sphygmocor
UltrasoundG.E.Modelo: Vivid7 DimensionUtilizamos un G.E., pero hay muchas empresas y modelos
de software vascular (Vascular Imager) Aplicaciones de imágenes médicasN/A Caja
de disparo de onda RAplicaciones de imágenes médicasN/A
inflado rápido del manguitoHokanson: Hokanson E20
Manguito de presión arterial en el antebrazoHokansonN/Amanguito personalizado con vejiga de 6,5 x 34 cm 
HUVECsInvitrogrenC-015-5C
Suero de burroJackson017-000-121
Pap penResearch Products International 195505
VE CadherinAbcamab33168
AF568Life TechnologiesA11011depende de las especificaciones de microscpe 
AF488Life TechnologiesA11034depende de las especificaciones de microscpe 
Anticuerpo de nitrotirosina Abcamab7048
NADPH anticuerpo oxidasaUpstate07-001
DAPI VectorH-1200
Toallita para tareas delicadas (Kimwipe) Fisher Scientific06-666-A Película plástica de parafina
(parafilm) Fisher Scientific13-374-10
Microscopio confocal Modelo Olympus: FV1000 FCS/RICSexisten muchas opciones 
Sistema de hecho a medida Modelo

Referencias

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