Este artículo de video describe un método in vitro modificado para examinar el papel de las hormonas, citocinas y/o factores de crecimiento en la invasión de células cancerosas.
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Resumen
Resumen
Suero de la sangre sirve como un quimioatrayente hacia el cual las células cancerosas migran e invaden, facilitando su intravasación en microvasos. Sin embargo, las moléculas reales hacia el que las células migran siendo difícil de alcanzar. Este ensayo de invasión modificado ha sido desarrollado para identificar objetivos que impulsan la migración celular y la invasión. Esta técnica compara el índice de invasión en tres condiciones para determinar si una hormona específica, factor de crecimiento o citoquina juega un papel en la mediación el potencial invasivo de una célula de cáncer. Estas condiciones incluyen i) de suero bovino fetal normal (FBS), ii) con carbón vegetal FBS (CS-FBS), que elimina hormonas, factores de crecimiento y citoquinas y iii) CS-FBS + molécula (denotado "X"). Un cambio significativo en la invasión de células con CS-FBS en comparación con FBS, indica la implicación de las hormonas, citoquinas o factores de crecimiento en la mediación del cambio. Las moléculas individuales se pueden agregar de nuevo a CS-FBS para ensayar su capacidad de volververso o rescatar el fenotipo invasión. Además, dos o más factores pueden combinarse para evaluar el efectos aditivos o sinérgicos de los múltiples moléculas en la conducción o inhibir la invasión. En general, este método permite al investigador determinar si las hormonas, citoquinas, y / o factores de crecimiento juegan un papel en la invasión de células sirviendo como quimioatrayentes o inhibidores de la invasión para un tipo particular de célula de cáncer o un mutante específico. Mediante la identificación de factores quimiotácticos y los inhibidores específicos, este ensayo de invasión modificado puede ayudar a dilucidar las vías de señalización que dirigen la invasión de células de cáncer.
Introducción
Un nuevo ensayo de invasión se ha desarrollado con el objetivo de identificar la participación de hormonas específicas, citoquinas y / o factores de crecimiento como quimioatrayentes en la invasión de células de cáncer. La capacidad de las células tumorales para invadir a través de la matriz extracelular (ECM) es una característica del fenotipo metastásico 1-3. Cámaras de invasión se han utilizado ampliamente como herramientas in vitro para estudiar la invasión de células de cáncer y la migración y pueden proporcionar conocimiento en cuanto a los mecanismos de invasión tumoral in vivo y la metástasis en. Las cámaras consisten en insertos de cultivo de células cilíndricas anidadas dentro de los pocillos de placas de cultivo celular. Los fondos de los insertos son de policarbonato o poliestireno membranas semi-permeables de tamaños de poro definidos.
En el ensayo de invasión estándar, las células se sembraron sobre la membrana inserto con medio libre de suero y se colocaron en pocillos de cultivo celular que se llenan con suero o sin suero como quimioatrayentes para set un grupo de quimioatractivas. Esto lleva a la fuerza de las células para moverse a través de la membrana semi-permeable (migración) o, alternativamente, a través de una capa de matriz extracelular (invasión), que luego se pueden teñir usando tintes convencionales para detectar y cuantificar el número de células. El número de células se normaliza entonces de acuerdo con la medida de la migración y la invasión en una línea celular no invasivo. Este método permite a un investigador para evaluar el potencial invasivo de diferentes tipos celulares bajo una variedad de condiciones, incluyendo manipulaciones genéticas.
Hormonas, citoquinas y factores de crecimiento son componentes críticos de suero y cada vez más se están demostrado estar asociados con la conducción del fenotipo invasivo 4. Sin embargo, la naturaleza, la función y la especificidad de estas moléculas séricas quimioatractivas en la mediación de la invasión sigue siendo difícil de alcanzar. El reto sigue siendo para determinar qué factores específicos en suero o suero como quimioatrayentes son responsables de la conduccióninvasión de células cancerosas, así como qué moléculas pueden inhibir el proceso de invasión. En este reporte se describe una metodología para evaluar la posible participación de las hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento presentes en el suero, como moléculas que impulsan la quimioatracción y la invasión de las células cancerosas.
En este protocolo modificado propuesto, el decapado de carbón se usa para eliminar las hormonas, citoquinas y factores de crecimiento de 2% de suero bovino fetal (FBS) para generar FBS 2% tratado con carbón vegetal (CS-FBS). Tanto FBS al 2% y 2% CS-FBS se utilizan como agentes para establecer la fuerza de quimioatrayentes para conducir la invasión de células de cáncer. Uso de 2% CS-FBS como un agente quimioatrayentes en comparación a la normalidad 2% de FBS proporciona varios beneficios, incluyendo en primer lugar, y lo más prominente, la capacidad de estudiar el fenotipo de la invasión del cáncer en el reducido / ausencia relativa de hormonas, citoquinas y factores de crecimiento. También permite al investigador evaluar si la eliminación colectiva de las hormonas, factores de crecimiento, y Cycitoci- provoca un aumento o disminución en el índice invasiva. El ensayo es entonces diseñado para determinar si la adición de un componente individual, designado como "X" puede inhibir, aumento, descenso o restaurar el índice invasiva a su valor original (véanse las Figuras 2 y 3). Aunque esta metodología es específico para el logro de los niveles fisiológicos del componente que se retira a partir del suero durante el decapado de carbón, también debe tenerse en cuenta que decapado de carbón también puede afectar a vías de transducción de señal. Por ejemplo, se ha informado de que decapado de carbón puede disminuir la actividad de la fosfatasa alcalina de las células osteoprogenitoras e inducir la adipogénesis mediante la reducción de los activadores de MAPK 5. De carbón medios pelados están disponibles comercialmente y se basan en el protocolo descrito que combina carbón de leña con dextrano y se incubaron con suero bovino fetal O / N 6.
Este ensayo se desarrolló en RESPONSE a un resultado reportado por Zucker et al. 7 Los autores demostraron que un fenotipo mutante que afecta a la comunicación brecha de la salida demostró un aumento en el índice de invasión al migrar hacia los medios normales con 2% de FBS. Este aumento fue eliminado con la sustitución de suero con carbón vegetal. De este resultado, los autores concluyeron que esta migración afectados mutante hacia una molécula lipófila (más específicamente, una hormona, factor de crecimiento o citoquinas) 7. Es bien sabido que las hormonas, factores de crecimiento y citoquinas median en las vías de señalización implicadas en la promoción de tumores y la invasión 4. Por lo tanto, es importante para los investigadores científicos para determinar qué factor (s) están impulsando la invasión tumoral de sus células de cáncer en particular o mutantes bajo estudio. El ensayo está diseñado para abordar el papel de componentes individuales en su concentración fisiológica como se determina de acuerdo con la diferencia entre la concentración del componente y# 8220; X "en FBS normal y el CS-FBS. Mediante el desarrollo de este ensayo, los investigadores pueden obtener mayor conocimiento en la vía invasiva específica que regule su sistema.
Hormonas, factores de crecimiento y citocinas a menudo han sido clasificados como promotores tumorales 8. Algunos de estos factores, tales como EGF se utilizan como fuentes directas para quimioatrayentes en cámaras de invasión 9. Por lo tanto, parece probable que estos representan los principales componentes del suero que la invasión tumoral directa. Este protocolo propone una simple, pero significativa, modificación el ensayo in vitro convencional en la invasión que permite a un investigador para evaluar la participación de las hormonas, factores de crecimiento y citoquinas en la mediación del potencial invasivo de las células cancerosas. Sin embargo, el ensayo está diseñado para proporcionar al investigador con una respuesta de si el procedimiento será eficaz para su estudio en una primera etapa en el análisis, a fin de no utilizar un tiempo precioso y resources si consideran innecesarios. Este método utiliza CS-FBS y se basa en la discreción investigadores en cuanto a que las moléculas de perseguir como candidatos de plomo que potencialmente median invasión de células cancerosas. Los resultados de estos análisis deben demostrar ser útil en la identificación de los componentes del suero que sirven como quimioatrayentes o inhibidores de la línea celular en particular o mutante siendo estudiados. Además, este enfoque puede ayudar al investigador a identificar vías de señalización clave, ya sea que promueven o inhiben la invasión de células de cáncer; dirigiendo así el futuro diseño de fármacos.
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Protocolo
1. Prepare los diferentes medios de comunicación y componentes adicionales
- Antes del experimento, que consiste en preparar los medios DMEM u otros medios especificados con la adición de FBS normales, tratado con carbón vegetal FBS, o FBS tratado con carbón vegetal más el componente a ensayar. Tenga en cuenta que varios componentes pueden ser probados en cada experimento.
- Pesar y diluir las hormonas, factores de crecimiento o citoquinas apropiadamente para ser disueltos en el suero tratado con carbón vegetal a la concentración fisiológica.
2. Preparar la matriz de colágeno en el hielo
- Preparar 2 ml de colágeno I matriz a 2,2 mg / ml mediante la adición de los siguientes componentes filtrados estériles en hielo: 200 l 10x PBS (pH 7,4), 5,4 l de NaOH 1 N, 600 l de doble H 2 O destilada y 1,2 ml de colágeno I (a 3,63 mg / ml).
- Mantenga solución de colágeno I en hielo hasta que esté listo a la placa.
3. Preparar las placas de la migración / invasión de ensayo
- Para cada línea celular a ensayar, utilizar una placa de cámara de 24 pocillos en la que 12-pocillos contienen insertos. Usa los 12 pozos adicionales que no contienen insertos para la adición de los medios de comunicación quimioatrayentes y transferir los insertos para el conjunto experimental arriba.
NOTA: una matriz de colágeno en placas con un tereftalato de polietileno (PET) de la membrana y 8 micras de tamaño de poro es óptimo para las líneas celulares utilizan aquí. Sin embargo, una matriz de Matrigel en placas prerrevestidas también puede estar sustituido con el tamaño de poro disminuido de acuerdo con la línea celular siendo investigado. - Etiquetar claramente la placa, utilizando 3 pozos por condición de ser analizados (migración FBS, migración CS-FBS, de invasión de SFB, y la invasión CS-FBS, así como FBS a la migración para un control, línea celular no invasivo). Ensayo de migración por el movimiento a través de poros en una membrana de PET, y la invasión de ensayo por el movimiento a través de una matriz de colágeno o Matrigel y luego a través de poros en la membrana. Utilice diferentes marcadores de color para cada condición de la celda a unIdentificación en el proceso de recubrimiento.
4. Vierta la Matriz Invasion
- Cuidadosamente pipeta 75 l de la solución matriz de colágeno en los insertos que se utilizarán para ensayos de invasión. Tenga cuidado para evitar burbujas. Dispersar las burbujas de mediante la aplicación de una punta de pipeta invertida a la superficie.
- Transferir la placa con los insertos recubiertos con colágeno a una incubadora de CO 2 37 ° C y 5% durante 30 min para permitir que el gel se solidifique.
5. Placa de las células en la membrana o matriz Invasion
- Mientras tanto, trypsinize células y añadir medios con 10% de SFB. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 minutos en una centrífuga de mesa y enjuague 3x en medio libre de suero.
- Volver a suspender en medio libre de suero. Contar las células con un hemocitómetro o un contador de diapositivas automatizada. Añadir medio libre de suero a una concentración final de 5 x 10 4 células / ml.
- Cuando la matriz de colágeno se ha solidificado (después de 30 minutos), añadir 700 l de los medios de comunicación, ya sea con2% FBS o definidos con carbón vegetal FBS a cada pocillo. De las 12 inserciones por placa:
- 3 insertos tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + FBS al 2%
- 3 insertos tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + 2% CS-FBS
- 3 insertos no tienen colágeno y pozos con los medios de + 2% de FBS
- 3 insertos no tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + 2% CS-FBS
- Use platos adicionales dependiendo del número de factores siendo probado y con un control sin colágeno correspondiente a cada condición.
- Añadir suspensión celular a los insertos en 5 x 10 4 células / ml, placas 500 células l por inserción en todas las inserciones de migración e invasión.
- Se incuban las células durante 22 horas a 37 ° C.
6. cuantificar el número de Migración y células invasoras
- Configure tinción de pozos utilizando fijador metanol, eosina y hematoxilina, en pocillos separados.
- Use hisopos de algodón para eliminar las células y la matriz de cada pocillo.Rrepeat con segunda aplicación hisopo para cada pozo.
- Con unas pinzas, sumerja cada inserto 5 veces durante 1 seg en cada una de las 3 soluciones en sucesión.
- Permitir inserciones se sequen O / N.
- O bien i) eliminar filtros con un bisturí, cortar cuidadosamente alrededor de los bordes y montar en un portaobjetos con cubreobjetos y de inmersión en aceite, o ii) permitir que las inserciones se sequen O / N invierte y se utilizan los insertos directamente para microscopía.
- El día siguiente, ver diapositivas o insertos bajo un microscopio con un objetivo de 20X y tomar 5 imágenes de diferentes regiones del filtro. Para mejorar la consistencia, tome 4 campos exteriores y uno central.
- Contar las células para todas las condiciones utilizando el software ImageJ y se aplican a las siguientes fórmulas.
- Determinar la invasión por ciento de la siguiente manera:
La media de # de células invasoras a través de colágeno inserto = a
La media de # de células que migran a través de inserción de control = b
Invasion% = (a / b) * 100 - Determinar el índice de invasión en 2% de FBS como sigue:
% Invasión de las células se sometió a ensayo (en 2% FBS) = c
% Invasión de las células no invasivas de control en (2% FBS) = d
Invasión Index (FBS) = (c / d) - Determinar el índice de invasión en 2% CS-FBS como sigue:
% Invasión de las células se sometió a ensayo (en 2% CS-FBS) = e
% Invasión de las células no invasivas de control en (2% CS-FBS) = f
Invasión Index (CS-FBS) = (E / F)
7. Repita Protocolo experimental Comparando con carbón vegetal FBS al FBS despojado-carbón + X n con múltiples factores combinados
- Repetir el procedimiento varias veces como sea necesario el uso de diferentes componentes para "X" o una combinación de componentes.
- Aplicar los cálculos para determinar la contribución de cada factor "X" para los efectos de la migración y la invasión.
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Resultados
El índice de invasión se calcula para cada condición de acuerdo a la normalización a una línea celular no invasivo. Para nuestros experimentos, utilizamos la línea celular de melanoma 1205Lu y variantes establecido líneas celulares estables como nuestras líneas invasivos, así como la variante no invasiva premaligna, WM793 de la que se derivaron las células 1205Lu 10 que sirve como un control lógico. También utilizamos colágeno I como la matriz invasión, ya que es el componente principal de la dermis. Esto est...
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Discusión
Metástasis tumoral es un proceso de varios pasos. Las células deben romper a través de la membrana basal, intravasate en cualquiera del sistema linfático o de la sangre microvasos, en los que se transporten a sitios distantes. Las células tumorales entonces extravasan y colonizan en un macrometástasis 12. La progresión a través de la epitelial a mesenquimal (EMT), invasión tumoral y la metástasis se ha mejorado por las hormonas esteroides 13,14, factores de crecimiento 15-18, 19-21 y cit...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen las fuentes de financiación de la Escuela de Farmacia del Colegio D'Youville, Buffalo, NY.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Insertos de control BioCoat con 8.0 y micro; m Membrana de PET | Corning 354578 | 12 en cada una de las dos placas de 24 pocillos. PET = polietileno teraftalato | |
| Colágeno I, cola | de rata Corning | 354236 | Source = tendón de cola de rata, pureza = 90% |
| Fijador; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Fijador a base de metanol, hematoxilina/eosina |
| Suero fetal bovino | Life | Technologies 16000 | Designado como FBS |
| Suero fetal bovino despojado con carbón | vegetal Life Technologies | 12676 | Designado como CS-FBS |
| Suero fetal bovino | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designado como FBS |
| Suero fetal bovino despojado con carbón | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | designado como CS-FBS |
Referencias
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