Dos métodos para fijar las células humanas primarias endometrial estromales de la histerectomía especímenes

Summary

El establecimiento de los sistemas primarios de células endometriales estromales de cultivo a partir de especímenes de histerectomía es una técnica biológica valiosa y un paso crucial antes de continuar con una amplia gama de objetivos de investigación. Aquí se describen dos métodos utilizados para establecer cultivos de estroma de los tejidos del endometrio resecado quirúrgicamente de pacientes humanos.

Abstract

Muchos esfuerzos se han dedicado a establecer en sistemas de cultivo celular in vitro. Estos sistemas están diseñados para modelar un gran número de procesos in vivo. Sistemas de cultivos celulares derivados de muestras endometriales humanas no son una excepción. Las aplicaciones varían desde procesos fisiológicos normales cíclicos a patologías endometriales, tales como los cánceres ginecológicos, enfermedades infecciosas, y fallos del aparato reproductor. Aquí, le ofrecemos dos métodos para establecer células estromales endometriales primarios a partir de especímenes de histerectomía endometrio resecado quirúrgicamente. El primer método se conoce como "el método de raspado" e incorpora raspado mecánico utilizando cuchillas quirúrgicas o de afeitar mientras que el segundo método se denomina "el método de tripsina." Este último método utiliza la actividad enzimática de tripsina para promover la separación de células y primaria excrecencia celular. Nos ilustran la metodología paso a paso a través de imágenes digitales y la microscopía. También provide ejemplos de validación de líneas celulares del estroma endometrial por medio de reacciones cuantitativas en tiempo real de la cadena de la polimerasa (qPCR) e inmunofluorescencia (IF).

Introduction

El corpus útero humano se compone de tres capas, la perimetrio (o serosa), el miometrio, y el endometrio. Distinguir cada una de estas capas es un paso importante para establecer líneas celulares del endometrio. El perimetrio es la capa más externa del útero y compone de células delgadas y serosas. El miometrio es la capa gruesa, medio del útero y compuesta de células del músculo liso. El endometrio se identifica como la capa interior del útero e incluye células epiteliales y estromales poblaciones.

El endometrio se subdivide a su vez en la capa basal cuyo tallo población celular es la hipótesis de la repoblación de la capa functionalis a....

Protocol

Especímenes de histerectomía utilizados en este manuscrito se recogieron en concordancia con un protocolo de ética aprobado por la IRB Universidad numerada IRB-HSR # 14424.

1. Adquisición de la muestra de la Fuente Clínica

1. Obtener el gobierno y las normas éticas basadas en instituciones y la documentación de aprobación antes de comenzar.
2. Llevar a cabo todos los pasos en condiciones estériles.
3. Preservar el tejido derivado del paciente en los medios de comunicación (RPMI o DMEM / de alta glucosa) en un tubo de 50 ml a 4 ° C si la muestra no se puede procesar en la cultura de inmediato. Las muestras pueden cons....

Results

Como se destaca en la sección Protocolo, asegúrese de llevar a cabo todos los métodos en el gobierno, institucionales y directrices éticas al manipular y preparar los tejidos humanos.

Se incluyen en este manuscrito es una ilustración del flujo de trabajo general de "el método de raspado" (Figura 1A) y "el método de tripsina" (Figura 1B) se utiliza para establecer cultivos endometriales primarios. Estos métodos se describen en detalle en la s.......

Discussion

Otros grupos han descrito y adaptado metodología para la preparación de cultivos estromales endometriales, la mayoría de los cuales utilizan colagenasa ^{4,12,13,15-18.} En este manuscrito, hemos proporcionado la metodología y la evidencia de dos métodos de cultivo estromal simplificados primarias endometrial, los cuales son utilizados por nuestro laboratorio por razones económicas y de la disponibilidad adecuada de tripsina y / o una hoja de afeitar.

Al comparar nuestros dos métodos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 Tripsina o 0,05% Tripsina	Hyclone	SH3023602 o SH30004202
tubo de centrífuga micro de 1,7	Genesee Scientific	22-272A
1 y micro; l, 20 y micro; l, 200 ml y 1.000 µ l Pipeta	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
Tubo cónico de 15 ml	Hyclone	339650
50 ml Tubo Cónico	Hyclone	339652
plato de cultivo celular de 6 cm	Thermo scientific	12-556-002
Cámaras de 8 pocillos	Acetato Thermo Scientific	AB-4162
	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzima/Tampón	Bio Labs	M077L
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Formalina de zinc tamponada	Thermo	59201ZF
Tira de carbón FBS	Fisher	NC9019735
Cloroformo	Fisher Scientific	BP1145-1
Cubreobjetos	Marca Fisher	12-544D AMP
cíclico (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/Alta glucosa	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Burro Anti Cabra -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Suero de Burro	Jackson' s lab	017-000-002
E Anticuerpo de Cadherina	Epítomes	1702-1
Etanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Suero fetal bovino (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Anfotericina B	Gibco	15290-018
Sonda GAPDH	Life Technologies	HS99999905
Glucógeno	5Prime	2301440
Cabra Anti Ratón - FITC	Jackson' s Lab	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906-5
Acetato de medroxiprogesterona (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Metanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
(con DAPI)	Vectores Laboratorios	H-1500
N6 ADN Oligos	Raspador Invitrogen
Número 15	BD	371615
Pan Citoqueratina  Ratón mAB	Señalización celular	4545
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicilina-Estreptomicina Solución de glutamina 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Cabra Anti cuerpo	Santa Cruz	SC-9862
Imprimación(es)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (sin fenol)	Gibco	11835
Sybr Verde	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Termo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Anticuerpo Vimentina	Epítomes	4211-1