Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Resumen

Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.

Resumen

Los poxvirus son una familia de virus de ADN de doble cadena que incluyen patógenos humanos activos tales como viruela de los monos, molusco contagioso, y virus de Contagalo. La familia también incluye el virus de la viruela, de la viruela. Debido a la complejidad de la replicación del virus de la viruela, aún quedan muchas preguntas con respecto a su estrategia de la expresión génica. En este artículo se describe la conceptualización y el uso de los virus vaccinia recombinantes que permiten la medición en tiempo real de las etapas individuales y múltiples de la expresión génica viral en un formato de alto rendimiento. Esto es posible mediante el uso de proteínas fluorescentes espectralmente distintas como reporteros para cada una de tres etapas de la replicación viral. Estos virus ofrecen una alta relación señal-ruido al tiempo que conserva los patrones de expresión específicos de la etapa, los ensayos basados ​​en la placa de habilitación y observaciones microscópicas de la propagación del virus y la replicación. Estas herramientas tienen usos para el descubrimiento antiviral, los estudios de la interacción virus-huésped, y la bio evolutivología.

Introducción

Tradicionalmente, la expresión del virus se estudia el uso de técnicas de biología molecular (por ejemplo, transferencia de Northern, Western Blot, microarrays de hibridación, etc) ^1. Si bien estos métodos son capaces de proporcionar información detallada con respecto a los cambios de expresión de ARNm o proteínas individuales categorizar, por lo general no son susceptibles de procesos en tiempo real y de alto rendimiento. Los enfoques alternativos que utilizan los periodistas basados ​​en fluorescencia se han aplicado anteriormente al trabajar con poxvirus; Sin embargo, su desarrollo y su uso ha sido motivado por diversos objetivos. Vari....

Protocolo

1. Células de la placa

1. Disociar las células HeLa de la placa y se diluye en medio de crecimiento (DMEM, 2 mM de L-superabundancia, 10% de FBS) a aproximadamente 2,0 x 10 ⁵ células / ml. Dispense 100 l / pocillo en una placa de negro-amurallado, clara de fondo plano de 96 pocillos (20.000 células / pocillo).
2. Se incuban las células durante 24 horas hasta la confluencia en un incubador de 37 º C + 5% de CO _2.

2. Infectar células

1. Diluir el virus e infectar las células.
   1. Descongele TRPV (virus Triple; Early Venus, Intermedio mCherry, Abierto TagBFP) y PLV (promotor de menos Ve....

Resultados

Como un ejemplo de la utilización típica de estos virus, se utilizó el virus de triple fluorescencia de reportero para comparar el punto de la inhibición de varios inhibidores de poxvirus bien definidos.

Las células HeLa se colocaron en placas en cultivo de tejidos claros placas de 96 pocillos de fondo plano de paredes negras tratadas y se incubaron durante la noche. Monocapas confluentes fueron infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 utilizando virus reportero triples (TRPV,.......

Discusión

Aquí, hemos descrito el uso práctico de un multi-etapa reportero virus vaccinia (TRPV), que proporciona medidas de retroalimentación en tiempo real reproducibles de la replicación del virus. Mediante el uso de inhibidores de poxvirus bien definidos, hemos sido capaces de demostrar que TRPV responde de una manera consistente con el mecanismo entendido de acción para cada inhibidor. Mientras que el virus TRPV proporciona la información más completa acerca de la progresión de la fase de virus, de dos etapas (iRev, LREV) y .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Suero Fetal Bovino - Optima, Inactivado por Calor (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamina, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Poliestireno Negro Microplacas tratadas	con TC Corning	3603
384 Pozo, Plano Fondo Transparente, Poliestireno Negro Tratado con TC Microplacas	Corning	3712
Tripsina, 2X, Estéril, Irradiado	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
dimetilsulfóxido, cultivo celular (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-arabinofuranosilcitosina  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin & beta; -tiosemicarbazona (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
rifampicina, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Solución acuosa de paraformaldehído (formaldehído)	Microscopía electrónica Sciences	157-8
TempPlate RT película ópticamente transparente	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070