A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.
Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.
Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila <17 h después de la puesta de huevos (AEL) 1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 st estadio (L1), 2 nd estadio (L2), y 3 º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado 4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera 5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad.
La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales 6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro 8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila 8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado 9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener en la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.
1 Preparación de una jaula de Colección
2. Fijación
3. Rehidratación y Preparación de la muestra para la inmunotinción
4. La sonicación de la Muestra
5. Inmunoticción
6. Análisis
Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la visualización de características morfológicas, así como células individuales en situ durante las etapas finales de-embrionario hasta principios / mediados de L3 de desarrollo de Drosophila.
Los resultados de Testis Inmunotinción:
Desarrollo de los testículos es un buen sistema para ilustrar la eficacia de protocolo desde la maduración de los testículos es dinámico durante el desarrollo larval. Testículos adultos de Drosophila forman un tubo en espiral con un extremo ciego, donde la célula madre de línea germinal (GSC) está situado nicho (véase 13,14 para revisiones). En este nicho, GSCs se disponen en torno a un grupo compacto de células somáticas no mitóticas llamado hub. GSCs someterse a la división asimétrica para producir una GSC que permanece anclada al cubo y una hija gonialblast que se desplaza lejos de la nicho de células madre. Como el gonialblast divide de forma incompleta, extensiones citoplasmáticas llamados fusomes forma, la conexión de las células dentro de la espermatogonia. Después de 4 divisiones sucesivas, la espermatogonia inicia la meiosis para formar esperma.
Formación Testis comienza con la asociación de las células germinales primordiales (PGC) y somáticos células precursoras gonadales (SGPS) durante la embriogénesis (ver 15,16 para revisiones). Esta asociación resultado la formación de un nicho GSC funcional por el final de la embriogénesis 8-10. A mediados de L1, divisiones asimétricas SGC dentro del nicho de GSC dan lugar a la diferenciación de las espermatogonias con fusomes ramificados 9. GSC división asimétrica continúa a lo largo de las larvasdesarrollo, lo que resulta en la producción de espermatogonias adicional y un aumento progresivo en el tamaño de las gónadas. Imágenes representativas de finales de los testículos / mid-L1, L2 y L3 embrionarias y tempranas, immunostained para las células germinales, células de cubo y fusomes, se muestran (Figura 1A-D). Estas imágenes ilustran los cambios dinámicos en tamaño de las gónadas y la diferenciación de células germinales observados en los testículos en el tiempo.
Los resultados de Inmunotinción Ovario:
Ovarios adultos de Drosophila se componen de 16 a 20 unidades productoras de huevos individuales llamados ovarioles (ver 17,18 para revisiones). En un extremo de cada ovariole, una estructura llamada germarium contiene un nicho de células madre. El nicho ovariole se compone de GSCs indiferenciadas y dos poblaciones de células somáticas: las células de cabeza y las células de filamentos terminales (TFS). Similar a los testículos, GSCs someterse a la división asimétrica para producir una GSC que queda adyacente a las células gorra y una célula hija diferenciador, Llamado cystoblast, que se apartó de la hornacina. El cystoblast posteriormente se somete a 4 rondas de división celular para formar un quiste de la línea germinal, interconectados por una fusome ramificada. Cada línea germinal-quiste es entonces rodeado por las células del folículo para producir una cámara de huevos que sigue madurando medida que se mueve hacia abajo la longitud de la ovariole.
Al igual que los testículos, los ovarios se forman por primera vez durante la embriogénesis 16,18. Múltiples ovarioles surgen de una sola gónada embrionaria compuesto de PGCs y los PGS. A mediados de L3, SGPS dan lugar a precursores TF en la parte anterior del ovario, mientras que las células germinales se localizan en la parte posterior del ovario y asociarse con células entremezcladas derivados-SGP (CI) 19-22. A finales-L3, células TF se diferencian y se organizan en las pilas que se encuentran en el nicho de células madre adultas, GSCs y tope células se establecen, y la diferenciación del quiste de la línea germinal se observa 19,20,23. Imágenes representativas de embriones en etapa tardía y ovarios principios / mediados de L3, immunostained para las células germinales, SGPS, ICs, precursores TF y fusomes, se muestran (Figura 1 E, F). Estas imágenes muestran la morfología normal y la progresión del desarrollo para su edad.
Los resultados de Neural Inmunotinción:
El sistema nervioso central de Drosophila (CNS) se deriva de las células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), que surgen de neuroepitelio embrionario (ver 24,25 para revisiones). RN en embriones y larvas división asimétrica para producir células madre ganglio (GMC) que, a su vez, generar neuronas y células gliales que se encuentran en el cerebro adulto y cordón nervioso ventral. Debido NB larvas dan lugar a la mayoría de las neuronas adultas y se pueden distinguir sobre la base de su posición dentro del cerebro, cerebros de larvas se han convertido en un importante modelo para estudiar el comportamiento NB y la diferenciación neural.
El cerebro L3 se compone de dos lóbulos y un cordón nervioso ventral situado en el centro 24.Imágenes representativas de cerebros mediados de L3 inmunoteñidas para los RN, GMC, las neuronas diferenciadas, las neuronas inmaduras y primaria y las células gliales se muestran (Figura 2A-C) 26-30. Estas imágenes muestran fuerte tinción en distintos patrones de expresión dentro de los lóbulos del cerebro y el cordón nervioso ventral. Dependiendo de la orientación de montaje, permite la visualización de imágenes de tejido cerebral de la superficie dorsal (Figura 2A), la superficie ventral (Figura 2B), o en sección transversal sagital (Figura 2C).
Eficiencia de tinción:
Nuestros resultados representativos demuestran que un procedimiento de inmunotinción a base de sonicación es versátil. No sólo puede ser utilizado para identificar los tipos de células específicas, pero también puede ser utilizado para indicar la presencia de proteínas y orgánulos específicos. Sin embargo, los resultados ambiguos pueden derivar de la variación esperada en la eficiencia de la tinción. Por ejemplo, anti-vasa manchado al menos una gónadaen el 73,2% de todas las larvas examinadas (n = 781), mientras que anti-Elav manchado cerebro en el 86% de las larvas (n = 115). Además, se observa que la eficiencia de la tinción es más o menos inversamente proporcional a la etapa de desarrollo. En los embriones en etapa tardía, anti-vasa manchada 89,8% de las gónadas (n = 206), mientras que la tinción estuvo presente en sólo el 59,8% y el 46,9% de las larvas en L2 y mediados de L3, respectivamente (n = 132 y 49). Además, los resultados de sonicación en la pérdida de muestra. Cuando se contó el número de embriones y larvas presente en una muestra de volumen óptimo de sonicación antes y después de la sonicación, un promedio de 41,0% de la muestra se determinó inadecuados para el análisis (n = 1165). Para maximizar la eficiencia de la tinción, los protocolos deben ser optimizados para los anticuerpos específicos mediante la alteración de las concentraciones de anticuerpos publicados o de los tiempos de incubación de anticuerpos.
Figura 1.. mmunostain de gónadas Drosophila in situ (AD) Imágenes de testículos en situ en embriones en etapa tardía (etapa 17 / early-L1) hasta principios / mediados de larvas L3 inmunotiñó con anti-Vasa (AD, rojo; A'-D ' solo) para detectar las células germinales, anti-Fasicilin III (III) y Fas anti-1B1 (AD, verde; A '' - D '' solo) para detectar las células de cubo y fusomes respectivamente, y DAPI (AD, azul; A ' '' D '' 'solo) para detectar los núcleos. (A) Etapa 17 / principios de testículo L1 muestra el hub recién fusionado y fusomes esféricas en las células germinales indiferenciadas. (B) Early / mid-L1 testículo muestra fusomes esféricas en GSCs localizadas cerca del centro y de alguna posterior células germinales alargadas fusomes indicativos de diferenciación temprana espermatogonias. (C) Temprano / mid-L2 y (EF) Imágenes de ovarios in situ en embriones en etapa tardía y larvas L3 mediados de inmunotinción con anti-Vasa (EF, rojo;. E'-F ' solo) para detectar las células germinales, anti-1B1 (EF, verde; E '' - F '' solo) para detectar fusomes y membranas de células somáticas en L3, y anti-atasco (TJ) (EF, azul; e '' Etapa 17 / principios de ovario L1 '-F' '' solo) para detectar células de ovario somáticas. (E) muestra que las células somáticas se distribuyen a lo largo de la gónada y que las células germinales tienen fusomes esféricas. (F) A principios / mediados de L3ovario se amplía ligeramente y se detecta asociada a la membrana 1B-1 de expresión indicativo de desarrollo TF progenitor en células somáticas anteriores. Las células germinales en mid-L3 se encuentran en la parte posterior testículos, muestran fusomes esféricas, y asociarse con TJ positivo / 1B1 atenúan ICs somáticas. Todas las imágenes son proyecciones de Z-4 rebanadas sucesivas confocal con la parte anterior de las gónadas orientada hacia la izquierda. Las gónadas se esbozan y el cubo se indica con una flecha amarilla en los testículos. La barra de escala es de 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Inmunotinción de los tejidos neuronales de Drosophila in situ. Larvas Early / mid-L3 immunostained con anti-Elav ( A '' solo) para detectar los núcleos de las neuronas inmaduras y primaria, y ya sea anti-Prospero (Pros) (A, verde, A 'solo) para detectar los núcleos en las CMG y neuronas diferenciadas o anti-Polaridad invertida ( Repo) (BC, verde, B '-C' solo) para detectar células gliales. núcleos y DAPI (AC, azul; A '' 'solo) se utilizó para detectar todos los núcleos celulares. Todas las imágenes orientadas con hasta anterior. Sección sagital orientado con ventral a la izquierda. (A) sección dorsal muestra una fuerte tinción para Pros y Elav en las regiones periféricas del lóbulo cerebral (BL) y a lo largo de la línea media y la periferia del cordón nervioso ventral (VNC). Inserción en el panel A muestra Pros y tinción Elav en núcleos distintos a lo largo de la línea media VNC. (B) Sección ventral muestra la expresión de base amplia de Repo positivo wi células glialesº tinción más fuerte a lo largo de la línea media VNC y la periferia. (C) Corte sagital muestra el enriquecimiento de tinción Repo en la cara ventral de la VNC. Todas las imágenes son confocal secciones individuales. La barra de escala es de 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los autores no tienen nada que revelar.
La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.
Estamos muy agradecidos a Ruth Lehman y Dorthea Godt que suministró amablemente anticuerpos Vasa y Tráfico Jam. Nos gustaría reconocer el Stock Center de la Universidad Bloomington de Indiana para el mantenimiento de las reservas previstas y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco elaboradas bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa. Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Wawersik por sus consejos y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Programa de Becarios Monroe Grant (a AF y LB) y NSF conceder IOS0823151 (a MW).
| Tabla 1: Reactivos y tampones | |||
| Tampón de fosfato Triton X-100 (PBTx) | Para 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Tienda en RT. | ||
| Tampón de fosfato salino 10X (PBS 10X) | Para 1 L en dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Agregue componentes y rellene hasta el volumen adecuado. Almacenar a 4 °C. | ||
| Triton 10% | Para 50 ml: 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH2O. Roca para mezclar. Tienda en RT. | ||
| Tubos PEMS | 0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Tienda en RT. | ||
| Tubos | Para una solución de 400 ml de 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubos dH20 NaOH. Disuelva las tuberías en 300 ml de dH2O y luego ajuste a pH 6.9 con NaOH. Lleve el volumen total a 400 ml con dH2O y autoclave. Tienda en RT. | ||
| Formaldehído | 37% de formaldehído en peso en metanol. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales. | ||
| Heptano | CAS 142-82-5 | n-Heptano. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales. | |
| Metanol | CAS 67-56-1 | Almacene en RT. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales. | |
| Tampón de fosfato Tween (PBTw) | Para hacer 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtre la esterilización después de agregar todos los componentes. Almacenar a 4 °C. | ||
| Tween 10% | Para 50 ml: 5 ml de Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rock para mezclar. Tienda en RT. | ||
| Tampón de albúmina/fosfato en suero bovino Tween (BBTw) | Para hacer 1 L: 100 ml de PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue BSA y luego esterilice usando un 0.2 μ m Unidad de filtro de vacío. Almacenar a 4 °C. | ||
| Suero normal de cabra (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | Para hacer 10 ml: Suero normal de cabra 10 ml ddH2O. Añadir ddH2O al vial de NGS y esterilizar con un 0,2 μ M Syrninge Filter. Almacene las alícuotas a -20 °C. |
| 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) | CAS: 281-57-9 | Para hacer 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO sólido, 3,5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml de glicerol. En un vaso de precipitados de 250 ml con barra agitadora, añada ddH2O, Tris HCl y DABCO. Revuelva y luego agregue 6N HCl, 10 N NaOH y glicerol. A continuación, añada 10N NaOH gota a gota hasta que la solución alcance un pH de 7,5. Alícuota. Almacene las alícuotas a -20 °C. | |
| DABCO + solución de p-fenilendiamina (PPD) | 1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Disuelva PPD en una solución de NaHCO3 y NaCO3. Agregue 60 μ l de solución de PPD a 500 μ l de DABCO. Almacene las alícuotas a -20 °C. | ||
| Platos de jugo de manzana | Para hacer ~ 200 platos: 45 g de agar (CAS # 9002-18-0), 45 g de azúcar granulada (comprado en la tienda), 500 ml dejugo de manzana (comprado en la tienda), 15 ml de Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2< / sub>O. Agregue agar a ddH2O en un matraz de 4 L y luego autoclave durante 30 min. Mezcle el jugo de manzana y el azúcar en una placa para remover caliente. Agregue gradualmente la mezcla de jugo de manzana al agar esterilizado en autoclave. Mezcle en una placa de agitación calentada, luego alícuota volúmenes de 10 ml en placas de Petri de 35 mm y deje reposar a RT para que se solidifique. Almacenar a 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | Para hacer 100 ml: 10 g de Tegosept, 100 ml de etanol. Almacene las alícuotas a -20 °C. | ||
| Pasta | de levadura | ~ 50 g de levadura activa seca. Agregue gradualmente ddH2O al vaso de precipitados que contenga levadura mientras revuelve hasta obtener una consistencia pastosa. Almacenar a 4 °C. | |
| Tabla 2: Materiales de tinción | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock a 5 mg/ml. |
| Conejo anti-Vasa | 1:250, regalo de Ruth Lehmann. | ||
| del Desarrollo de Ratones anti-Factina III | (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Ratones anti-1B1 | (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Cerdo Guniea anti-Traffic Jam | 1:2500, un regalo de Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Ratón anti-Prospero | Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| anti-Repo | Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Cabra anti-conejo Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Cabra anti-ratón Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Cerdo anti-guniea de cabra Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Cabra anti-rata Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Tabla 3: Materiales y equipos | |||
| Jaulas de moscas | hechas a mano; Genesee Scientific Corporation | No aplicable; botellas: 32-130; Jaula prefabricada: 59-101 | Hecha cortando tubos acrílicos fundidos transparentes (1 3/4 pulgadas de diámetro) en segmentos de 4 pulgadas de alto con una sierra ingletadora compuesta a 400 rpm. Pantalla ultrafina de acero inoxidable (se fijó a un extremo de la bañera con pegamento acrílico compuesto. Un método alternativo que utiliza una botella vacía de comida para moscas se puede encontrar en Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Las jaulas también se pueden comprar en Genesee Scientific Corporation. |
| Sonificador: Sonificador digital Branson 250 | ModeloBranson | : Sonificador digital Branson 250 | |
| Sonda Sonicada | Branson | Modelo #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Filtro de jeringa | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μ m celulosa, filtro de membrana de acetato |
| Sistema de imagen: Microscopio confocal de disco giratorio con fuente de luz multicromática, cámara CCD digital y software de imagen | Microscopio: Olympus, Fuente de luz: Lumen Dynamics, Cámara: Q-Imaging, Software de imagen: Intelligent Imaging Inc. | Microscopio: BX51 equipado con disco giratorio DSU, Fuente de luz: X-Cite 120Q, Cámara: RETIGA-SRV, Software de imagen: Slidebook 5.0 | |
| Unidad de filtro de vacío | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μ M Filtro de membrana de nitrato de celulosa |
