Name: La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval Drosophila Tejidos In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a realizar inmunofluorescencia facilitada por sonicación en tejidos de Drosophila melanogaster sin necesidad de disección. Este protocolo mejora la penetración de anticuerpos para visualizar proteínas en desarrollo.

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Estamos muy agradecidos a Ruth Lehman y Dorthea Godt que suministró amablemente anticuerpos Vasa y Tráfico Jam. Nos gustaría reconocer el Stock Center de la Universidad Bloomington de Indiana para el mantenimiento de las reservas previstas y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco elaboradas bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa. Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Wawersik por sus consejos y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Programa de Becarios Monroe Grant (a AF y LB) y NSF conceder IOS0823151 (a MW).

1 Preparación de una jaula de Colección <ol><li> Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO 2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 - periodo de aclimatación de 48 horas. </li><li> En el extremo libre de la jaula, coloque una placa de agar de zumo de manzana preparado previamente con una gota tamaño de una moneda de la pasta de levadura en el centro sobre la abertura de la jaula. A continuación, fije con cinta adhesiva. Sellar la unión entre la placa de agar de zumo de manzana y la jaula con Parafilm. </li><li> Coloque la jaula en un recipiente secundario con placa de agar jugo de manzana como la base y permitir que las moscas para reproducir a una temperatura definida durante un período adecuado de tiempo determinado por el experimento. Nota: Los tiempos de recogida de muestras will variar. Por ejemplo, en la recogida de embriones en fase tardía / larvas L1 precoz (17 - 24 horas), permitirá a las moscas ponen sus huevos en placas de agar de jugo de manzana durante 7 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 17 horas a 25 ° C. Del mismo modo, para una colección de larvas de primer instar a mediados-finales (36 - 48 hr) permiten a las moscas ponen huevos durante 12 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 36 horas a 25 ° C. </li><li> Una vez que el período de tiempo es completa, puntee en la jaula en una mesa para que las moscas caen fuera de la placa de agar jugo de manzana sin anestesia. Colocar inmediatamente la placa utilizada por una nueva que contiene una gota de pasta de levadura. Asegure la placa fresca con cinta y parafina y almacenar la jaula con placa de agar jugo de manzana como base. </li><li> Retire con cuidado la caída de la levadura de la placa utilizada con una espátula de metal. Coloque la tapa en la placa de jugo de manzana se utiliza y permitir embriones puso a la edad si experimentalmente necesario. Nota: Si bien el envejecimiento muestras, placas pueden almacenarse a 25 ° C menos que las temperaturas más altas son ExperimentaLLY necesario. Ejemplos de cómo los embriones para la recolección se ha descrito anteriormente la edad (ver nota para el paso 1.3). La eliminación de pasta de levadura antes de probar el envejecimiento se realiza para evitar que las larvas de meterse en la levadura y romper el agar debajo. El residuo agar jugo de manzana y pasta de levadura restante proporcionan nutrientes para el crecimiento de las larvas. Mientras que los embriones fijados directamente en la pasta de levadura se pierden a través de la eliminación de pasta de levadura, esta pérdida es preferible a la levadura y agar residuo de la muestra que puede reducir la eficiencia de la tinción. Si uno elegir no eliminar la pasta de levadura, la levadura puede ser licuado con tampón fosfato Triton X-100 (PbTx), mezclado con un pincel, y luego se retira de la muestra con un filtro de células antes de la fijación. </li></ol> 2. Fijación <ol><li> Una vez que los embriones fijados sobre la placa de agar jugo de manzana han envejecido hasta el punto de tiempo deseado, use un pincel pequeño humedecido con tampón fosfato Triton X-100 solución (PbTx) para quitar cuidadosamente la muestra de jue plato. Nota: Las larvas más viejas son móviles y puede gatear en el interior de la tapa. Esta muestra se puede recoger de manera similar por la eliminación con un pincel. </li><li> Limpie el pincel-muestra cargado contra la arista interior-frente de un filtro celular. Luego, enjuague las paredes del colador y el pincel con una botella con atomizador que contiene solución PbTx. Coloque una cubierta de placa de Petri debajo del filtro para capturar la solución PbTx. </li><li> Después de toda la muestra se ha transferido al colador, vierta suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. </li><li> Repita el paso 2.3 tres veces para eliminar la levadura y los residuos que puedan haber sido transferido junto con la muestra vuelan. </li><li> Vierta suficiente 50% de lejía (NaOCl) / agua (ddH2O) solución en el colador para elevar las larvas fuera de la malla. Permita que las larvas que se siente en la solución durante 5 minutos. Luego, levante el colador y verter tque el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. Se requiere Bleach sólo en las muestras embrionarias de edades comprendidas 0-22 hr a fin de eliminar la membrana coriónica: Nota. La aplicación de cloro para muestras de mayor edad se puede omitir, pero su inclusión no es perjudicial. Si se desea omisión, sustituya la lejía en este paso con PbTx. Lejía diluida debe utilizarse dentro de las 24 horas de preparación de la solución. </li><li> Lavar la muestra en el colador con PbTx vertiendo suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. Permita que la muestra que se siente en la solución durante 3 min. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. </li><li> Repita el paso 2.6 de cinco veces. </li><li> Frote la parte inferior del filtro celular seco, a continuación, transferir la muestra a un vial de centelleo que contiene 1,75 ml de solución PEMS usando un pincel. </li><li> Trabajar en una campana de humos con ventilación, añadir 250 l de formaldehído al 37% y 8 ml de heptano grado reactivo en el vial de centelleo. <br/&gt; Nota: El formaldehído y el heptano son peligrosos. Por razones de seguridad, seguirá trabajando en una campana extractora ventilada y usar guantes apropiados para los pasos 2.9 a 3.3. </li><li> Dejar que el vial agitar a 200 rpm o velocidad moderada similar para 20 min. </li><li> Añadir 10 ml de metanol para vial de centelleo sin la eliminación de la fase acuosa anterior y permitir que el vial para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min. Nota: El metanol es peligroso. Continuar trabajando en una campana extractora bien ventilada y use guantes adecuados. </li><li> Retire el vial de agitador e inmediatamente vierta el contenido en un filtro de células sobre un recipiente de residuos líquidos en la campana. Añadir metanol adicional para el vial y ejecutar a través del filtro como sea necesario para asegurar que todos célula de muestra se ha eliminado. Nota: coladores celulares pueden drenar lentamente. Para remediar esto, tocar un tejido de laboratorio para la parte inferior del filtro de células a fin de extraer la solución a través del filtro más rápidamente. El metanol, formaldehído, y heptano debería seralmacenada en contenedores para residuos apropiados hasta la eliminación adecuada según las directrices institucionales. </li><li> Fondo seco del filtro de células utilizando un tejido de laboratorio, a continuación, utilizar un pincel para transferir la muestra capturada en el colador a un tubo de 1.5 ml contiene 0,5 ml de metanol. Nota: Si hay varios viales de centelleo están en uso, complete los pasos 2.12 y 2.13 un vial a la vez para evitar que la muestra se seque en células coladeras. </li><li> Una vez que la muestra se ha añadido al tubo de microcentrífuga, eliminar el metanol con una pipeta. Asegurar la muestra ha depositado en el fondo del tubo. </li><li> Enjuague muestra en el tubo de microcentrífuga mediante la adición de aproximadamente 0,5 ml de metanol al tubo. Espere a que la muestra que conformarse entonces eliminar el metanol con una pipeta. </li><li> Repita el paso 15 de tres veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de metanol en el tubo, y luego almacenar en un congelador -20 ° C para su uso posterior. </li></ol> 3. Rehidratación y Preparación de la muestra para la inmunotinción <ol><li> Eliminar el metanol desde el tubo de microcentrífuga con una pipeta, dejando la muestra en el tubo. Tienda metanol residuos al contenedor de desechos apropiado hasta el momento de su eliminación adecuada. Nota: Para mejorar la eficiencia de tratamiento con ultrasonidos, utilizan no más de 3 mm de la muestra se establecieron en la parte inferior del tubo de 1.5 ml. El exceso de muestra puede ser transferida a un tubo separado con una pipeta antes de comenzar la etapa de rehidratación anteriormente. Cortar la punta de la pipeta con una cuchilla de afeitar limpia se puede utilizar para prevenir la obstrucción de la punta de pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de una / tampón fosfato Tween (PBTw) solución de metanol 50% al tubo y de la roca durante 3 min. </li><li> Eliminar la solución de metanol al recipiente de desechos adecuado y enjuague con 1,0 l de PBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de albúmina de suero bovino / Phosphate Buffered Tween (BBTw) mezclar al vial y el rock. Después de 3 minutos en un agitador, permitir que el sample se asiente y retire la BBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 3.4 dos veces, teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad BBTw como sea posible sin perder la muestra después del último lavado. </li><li> Añadir 0,5 ml de BBTw al tubo y colocar el tubo en hielo. </li></ol> 4. La sonicación de la Muestra <ol><li> Ajuste el aparato de ultrasonidos a 10% de la amplitud máxima y designar un tiempo de ejecución de sonicación constante 2 seg. Nota: Estos ajustes son específicos para el aparato de ultrasonidos se indica en los materiales y equipos Mesa y pueden requerir de optimización para diferentes sonicadores. </li><li> Antes de la sonicación de la muestra, limpiar la sonda de ultrasonidos mediante la colocación de la punta de la sonda en un tubo cónico de 50 ml lleno de agua desionizada y ejecutar sonicador para limpiar la sonda. Sonda de ultrasonidos en seco con papel de laboratorio después de la ejecución. </li><li> Sumergir la sonda en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra de modo que se sitúe aproximadamente 3 a 4 mm por encima de la muestra y empezar a sonicación. </li><li> Retire la microcentrifuge tubo y colocarlo en hielo durante al menos 30 segundos para disipar el calor de sonicación y permitir que la muestra se asiente en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Repita los pasos 4.3 y 4.4, según sea necesario por motivos de edad de la muestra que se está procesando. Nota: Para obtener el volumen de muestra sonicación óptima, los embriones menos de 17 horas, no requieren tratamiento con ultrasonidos, pero aquellos entre 17 y 24 horas (etapa 17 / early-L1) requieren dos sonicaciones. Las larvas entre 24 - 36 (a principios / mediados de L1), 36 - 48 (mediados / finales-L1), 48 - 60 (a principios / mediados de L2), 60 - 72 (mediados / finales-L2), 72-84 ( principios-L3), 84-96 (principios / mediados de L3), 96-108 (mediados / finales-L3) hr requieren 5, 9, 11, 13, 15, 18, y 22 sonicaciones respectivamente. Véase la discusión para más explicaciones sobre los tiempos de sonicación. </li><li> Enjuague con 1,0 ml BBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la BBTw con pipeta. &lt;/ Li&gt; <li> Repita el paso 4.7 dos veces. </li></ol> 5. Inmunoticción <ol><li> Bloque de muestras mediante la adición de 5% de suero normal diluida en BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 1 hora. Nota: Utilice el suero normal de la especie en la que se generan los anticuerpos secundarios. </li><li> Diluir anticuerpos primarios para apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%. </li><li> Muestra de la roca en la solución de anticuerpo primario O / N a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. Nota: Los tiempos de incubación de anticuerpos y las temperaturas pueden variar. O / N de incubación a 4 ° C o 3 horas a RT es típicamente suficiente. Sin embargo, un período de incubación de dos días puede mejorar la calidad de la tinción, especialmente con muestras mayores o cuando se utilizan anticuerpos primarios de baja afinidad. Incubaciones más largas se realizan normalmente a 4 ° C. Consideraciones similares se deben hacer al utilizar anticuerpos secundarios (véase 5.10). </li><li> Permita que la muestra se deposite enparte inferior del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos primarios con pipeta. Ahorra anticuerpos para la reutilización, si lo desea. </li><li> Enjuague con 1,0 ml de BBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, deje la muestra se asiente y eliminar BBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 5.6 de cinco veces. </li><li> Bloque de muestras mediante la adición de solución al 5% / suero normal de BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 30 minutos a 1 hora. Nota: No se requiere este paso adicional de bloqueo, pero puede mejorar la calidad de la tinción de anticuerpos específicos. </li><li> Diluir anticuerpos secundarios de apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%. </li><li> Envuelva tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para reducir el desvanecimiento debido a la exposición a la luz. Muestra de la roca en la solución de anticuerpo secundario durante 12 a 48 horas a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. </li><li> Permita que la muestra se deposite en el fondo del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos secundarios con pipeta. </li><li> Enjuague con 1,0 ml de PBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de PBTw al vial y el rock. Después de 5 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la PBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 5.13 tres veces. </li><li> OPCIONAL: Añadir DAPI diluido 1: 1000 en PBTw. Muestra de la roca envuelta en papel de aluminio durante 3 min; a continuación, eliminar la solución de DAPI con una pipeta. Enjuague cinco veces con 1,0 ml de PBTw, permitiendo que la muestra se asiente antes de extraer PBTw con la pipeta. </li><li> Añadir 80-100 l de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano solución (DABCO) al tubo de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C. Nota: Otro agente anti-fade basado en glicerol puede ser sustituido por. </li></ol> 6. Análisis <ol><li> Antes de la muestra de montaje en portaobjetos, añadir un extra de 5 - 10 l de DABCO / p-phenilenodiamina (PPD) Antifade solución al tubo de microcentrífuga. Nota: La muestra se puede añadir a las diapositivas sin disección. El volumen de muestra añadido a una diapositiva varía con el tamaño de hoja de la cubierta. Cuando el pipeteado de la muestra en un portaobjetos, la punta de pipeta se puede cortar utilizando una cuchilla de afeitar para prevenir muestra de cizallamiento. A menudo es útil para alinear muestra en filas para el análisis fácil. La adición de PPD como un agente Antifade adicional puede no ser necesaria, pero puede evitar photobleaching si las muestras se almacenan a largo plazo. </li><li> Coloque suavemente hoja de la cubierta de vidrio sobre la muestra. Entonces, cubreobjetos seguro en su lugar con el esmalte de uñas. </li><li> Ver muestra montada mediante microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos 1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través de un colad...

Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila &lt;17 h después de la puesta de huevos (AEL) 1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 st estadio (L1), 2 nd estadio (L2), y 3 º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado 4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera 5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad. La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales 6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro 8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila 8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado 9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener en la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabla 1: Reactivos y tampones</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Para 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Tienda en RT.</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Para 1 L en dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Agregue componentes y rellene hasta el volumen adecuado. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Para 50 ml: 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH2O. Roca para mezclar. Tienda en RT.</td></tr><tr><td>Tubos PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Tienda en RT.</td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td>Para una solución de 400 ml de 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubos dH20 NaOH. Disuelva las tuberías en 300 ml de dH2O y luego ajuste a pH 6.9 con NaOH. Lleve el volumen total a 400 ml con dH2O y autoclave. Tienda en RT.</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td></td><td></td><td>37% de formaldehído en peso en metanol. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.</td></tr><tr><td>Heptano</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptano. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Almacene en RT. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Para hacer 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtre la esterilización después de agregar todos los componentes. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Para 50 ml: 5 ml de Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rock para mezclar. Tienda en RT.</td></tr><tr><td>Tampón de albúmina/fosfato en suero bovino Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Para hacer 1 L: 100 ml de PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue BSA y luego esterilice usando un 0.2 &mu; m Unidad de filtro de vacío. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Para hacer 10 ml: Suero normal de cabra 10 ml ddH2O. Añadir ddH2O al vial de NGS y esterilizar con un 0,2 &mu; M Syrninge Filter. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>Para hacer 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO sólido, 3,5 ml 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml de glicerol. En un vaso de precipitados de 250 ml con barra agitadora, añada ddH2O, Tris HCl y DABCO. Revuelva y luego agregue 6N HCl, 10 N NaOH y glicerol. A continuación, añada 10N NaOH gota a gota hasta que la solución alcance un pH de 7,5. Alícuota. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>DABCO + solución de p-fenilendiamina (PPD)</td><td></td><td></td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Disuelva PPD en una solución de NaHCO3 y NaCO3. Agregue 60 &mu; l de solución de PPD a 500 &mu; l de DABCO. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Platos de jugo de manzana</td> Para hacer ~ 200 platos: 45 g de agar (CAS # 9002-18-0), 45 g de azúcar granulada (comprado en la tienda), 500 ml de <td></td><td></td><td>jugo de manzana (comprado en la tienda), 15 ml de Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Agregue agar a ddH2O en un matraz de 4 L y luego autoclave durante 30 min. Mezcle el jugo de manzana y el azúcar en una placa para remover caliente. Agregue gradualmente la mezcla de jugo de manzana al agar esterilizado en autoclave. Mezcle en una placa de agitación calentada, luego alícuota volúmenes de 10 ml en placas de Petri de 35 mm y deje reposar a RT para que se solidifique. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Para hacer 100 ml: 10 g de Tegosept, 100 ml de etanol. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Pasta</td><td></td><td></td> de levadura <td>~ 50 g de levadura activa seca. Agregue gradualmente ddH2O al vaso de precipitados que contenga levadura mientras revuelve hasta obtener una consistencia pastosa. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 2: Materiales de tinción</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, stock a 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Conejo anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, regalo de Ruth Lehmann.</td></tr><tr>Banco de Hibridomas de Estudios <td>del Desarrollo de Ratones anti-Factina III</td><td>(DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr>Banco de Estudios de Desarrollo de<td>Ratones anti-1B1</td><td>(DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Cerdo Guniea anti-Traffic Jam</td><td></td><td></td><td>1:2500, un regalo de Dorthea Godt (Li et al, 2003).</td></tr><tr><td>Ratón anti-Prospero</td><td>Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rat anti-Elav</td><td>Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr> ratón <tr><td>anti-Repo</td><td>Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cerdo anti-guniea de cabra Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-rata Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 3: Materiales y equipos</td></tr><tr><td>Jaulas de moscas</td><td>hechas a mano; Genesee Scientific Corporation</td><td>No aplicable; botellas: 32-130; Jaula prefabricada: 59-101</td><td>Hecha cortando tubos acrílicos fundidos transparentes (1 3/4 pulgadas de diámetro) en segmentos de 4 pulgadas de alto con una sierra ingletadora compuesta a 400 rpm. Pantalla ultrafina de acero inoxidable (se fijó a un extremo de la bañera con pegamento acrílico compuesto. Un método alternativo que utiliza una botella vacía de comida para moscas se puede encontrar en Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Las jaulas también se pueden comprar en Genesee Scientific Corporation.</td></tr><tr><td>Sonificador: Sonificador digital Branson 250</td> Modelo <td>Branson</td><td>: Sonificador digital Branson 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Sonicada</td><td>Branson</td><td>Modelo #: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 &mu; m celulosa, filtro de membrana de acetato</td></tr><tr><td>Sistema de imagen: Microscopio confocal de disco giratorio con fuente de luz multicromática, cámara CCD digital y software de imagen</td><td>Microscopio: Olympus, Fuente de luz: Lumen Dynamics, Cámara: Q-Imaging, Software de imagen: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Microscopio: BX51 equipado con disco giratorio DSU, Fuente de luz: X-Cite 120Q, Cámara: RETIGA-SRV, Software de imagen: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Unidad de filtro de vacío</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &mu; M Filtro de membrana de nitrato de celulosa</td></tr></tbody></table>

la sonicación-facilitado inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; drosophila</em&gt; tejidos<em&gt; in situ</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.

Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la visualiz...

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar o saturar tejidos en C dos mediante microscopía de fluorescencia tras la sonicación. Esto se logra primero recolectando muestras embrionarias y larvarias y luego fijándolas usando formaldehído, heptano y metanol. El segundo paso consiste en someter la muestra fijada a sonicación para eliminar el cutículo y permitir la penetración del anticuerpo. A continuación, la muestra se tiñe mediante inmunomarcado con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes. El paso final consiste en montar la muestra en una solución Antifa basada en glicerol. Finalmente, se utiliza microscopía confocal o microscopía epifluorescente para visualizar el tejido en desarrollo, así como la expresión y la localización de proteínas.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la disección de tejidos es que permite la visualización in situ de una variedad de tejidos en desarrollo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el paso de sonicación depende de varios factores para lograr una eficiencia máxima, incluyendo la posición adecuada de la sonda sónica. El procedimiento será demostrado por Ashley Fiddler y Lauren Bole, dos talentosas investigadoras universitarias de mi laboratorio.Para comenzar el experimento, retire cuidadosamente los embriones recolectados en una placa de agar utilizando un pincel pequeño humedecido con solución de tampón fosfato con Triton X-100 o solución PBTX. A continuación, pase el pincel cargado con la muestra contra el reborde interior del filtro celular. Coloque la tapa de una placa de Petri debajo del filtro celular.Luego enjuague el pincel y las paredes del colador celular con una botella de goteo que contenga PBTX. Después de transferir la muestra al colador, vierta suficiente PBTX en el colador para elevar la muestra por encima de la malla. Repita este paso tres veces para eliminar la levadura y los desechos de mosca, y luego elimine el PBTX.Luego, vierta la solución de lejía al 50 % en el colador y deje que las larvas permanezcan en la solución durante cinco minutos. A continuación, retire la solución. Luego, lave la muestra con PBTX y deje que la muestra permanezca en la solución durante tres minutos.Repita el paso cinco veces y seque la parte inferior del tamiz de celda. Luego, use un pincel humedecido con PBTX para transferir la muestra a un frasco de centelleo que contenga 1,75 mililitros de pems. En una campana extractora, agregue 250 microlitros de formaldehído al 37 % y ocho mililitros de reactivo grado analítico.Añadir heptano al vial de centelleo y agitar el vial a 200 rpm durante 20 minutos. Luego, agregar 10 mililitros de metanol al vial de centelleo sin retirar la fase acuosa y agitar vigorosamente a 500 rpm. Inmediatamente después de agitar, verter el contenido en un colador celular colocado sobre un recipiente para residuos líquidos.Agregue metanol adicional al vial y pase el contenido a través del filtro celular. Para asegurar que se haya eliminado toda la muestra, seque el fondo del filtro celular con un tejido de laboratorio.Luego, utilice un pincel para transferir la muestra del colador a un tubo microcentrífugo de 1.5 mililitros que contenga 0.5 mililitros de metanol. Espere a que la muestra se sedimente. A continuación, retire el metanol con una pipeta y reemplácelo con un nuevo alícuota de 0.5 mililitros de metanol.Repita este paso tres veces y agregue finalmente 0,5 mililitros de metanol al tubo antes de almacenarlo a menos 20 grados Celsius. Para su uso posterior, retire la muestra almacenada del congelador y elimine el metanol con una pipeta. Luego agregue un mililitro de una solución de tampón fosfato con tween al 50% en metanol o PBTW al tubo, y agite suavemente el tubo durante tres minutos.A continuación, enjuague la muestra con un mililitro de PBTW dos veces, dejando que la muestra se sedimente antes de retirar el PBTW con una pipeta. Añada 1,0 mililitros de albúmina de suero bovino en tampón fosfato con Tween, o BBTW, al vial y agítelo suavemente durante tres minutos. Deje que la muestra se sedimente y retire el BBTW con una pipeta. Repita este paso dos veces.Teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad posible de BBTW sin perder ninguna parte de la muestra. A continuación, agregue 0,5 mililitros de BBTW al tubo y colóquelo en hielo. Luego, configure el sonicador a un 10 % de amplitud máxima y un tiempo de funcionamiento de dos segundos con acción constante, limpie la sonda del sonicador colocando la punta en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con agua desionizada y active el sonicador.Luego seque la sonda ultrasónica con un tejido de laboratorio. Sumerja la sonda en el tubo, a tres o cuatro milímetros por encima de la muestra, e inicie la sonicación. A continuación, retire el tubo y colóquelo en hielo durante 30 segundos para evitar el sobrecalentamiento debido a la sonicación y permitir que la muestra se sedimente en el fondo del tubo.Repita este paso según sea necesario según la antigüedad de la muestra después de completar la sonicación. Enjuague la muestra dos veces con un mililitro de BBTW. Después de cada enjuague, permita que la muestra se asiente antes de eliminar el BBTW con una pipeta. Agregue un mililitro de BBTW al vial y colóquelo en un agitador rotatorio.Después de tres minutos, deje que la muestra sedimente y retire el BBTW con una pipeta. A continuación, repita este paso dos veces. Bloquee la muestra con 0,5 mililitros de suero normal al 5% diluido en BBTW agregado al tubo, y coloque la muestra en un agitador durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, agregue 0,5 mililitros de solución de anticuerpo primario y agite la muestra durante la noche a cuatro grados Celsius, permitiendo que la muestra se sedimente en el fondo del tubo. Luego, retire los anticuerpos primarios con una pipeta y enjuague dos veces con un mililitro de BBTW. Añada un mililitro de BBTW al vial y colóquelo luego en un agitador durante tres minutos.Luego, retire el BBTW con una pipeta y repita este paso cinco veces. Bloquee la muestra con una solución de suero normal al 5 % en BBTW y agítela suavemente durante 30 minutos. A continuación, retire la solución.Añada anticuerpo secundario diluido al 5 % en solución BBTW con suero normal y envuelva el tubo con papel de aluminio. Luego, agite la muestra durante la noche a cuatro grados Celsius. Retire los anticuerpos secundarios con una pipeta y enjuague la muestra dos veces con un mililitro de PBTW.A continuación, agregue un mililitro de PBTW al vial y colóquelo en un agitador durante cinco minutos. Luego, deje que la muestra sedimente y retire el PBTW con una pipeta. Repita este paso.Dé tres pasos. Añada de 80 a 100 microlitros de solución DAB co al tubo y almacénelo a menos 20 grados Celsius. Finalmente, para montar la muestra, use de cinco a 10 microlitros de diamina de dab BCO p lene, o PPD anti desvanecimiento.Luego, obsérvelo mediante microscopía de fluorescencia. Estas proyecciones Z de cuatro cortes confocales demuestran la eficacia del protocolo para visualizar características morfológicas así como células individuales en C dos durante las etapas tardías embrionarias hasta las etapas tempranas e intermedias de L tres del desarrollo de drosophila. El desarrollo de los testículos es un sistema particularmente adecuado para ilustrar la eficacia del protocolo porque la maduración testicular es dinámica a lo largo del desarrollo larval.Estas imágenes resaltan las células germinales en rojo y las células del centro y las zonas FU en verde, en secciones confocales simples de cerebros de tercer estadio larvario medio. Inmunotinción para células madre ganglionares, neuronas no diferenciadas en verde y neuronas inmaduras y primarias. En rojo se observa una tinción intensa con patrones de expresión distintos en los lóbulos cerebrales y en la cuerda nerviosa ventral, dependiendo de la orientación del montaje; la imagen permite la visualización del tejido cerebral desde la superficie dorsal, la superficie ventral o en sección transversal sagital.Esta técnica in situ permite a los biólogos explorar el desarrollo de órganos en la morfogénesis tisular de organismos cuya cutícula protectora impide la penetración de anticuerpos. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sonicar y realizar inmunotinción en muestras de esófago de embriones y larvas en estadios tardíos para visualizar tejidos en desarrollo en C dos. No olvide que trabajar con formaldehído, heptano y metanol puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora.Siempre se debe usar guantes adecuados y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Se presenta un protocolo de inmunotinción de montaje completo en embriones de pulgón, en el que se abordan las condiciones críticas para disminuir la tinción de fondo y aumentar la permeabilidad del tejido. Estas condiciones se han desarrollado específicamente para la detección eficaz de la expresión de proteínas en los tejidos embrionarios de los pulgones.

Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Aquí, describimos un protocolo para la detección y localización de la proteína embrionaria de Drosophila y el ARN desde la recolección hasta la preincrustación e incrustación, la inmunotinción y la hibridación in situ de ARNm.

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Estos protocolos describen cómo caracterizar la organización y la función de oclusión de las uniones septadas plisadas en epitelios embrionarios de Drosophila de control y mutantes.

Experimentos de inmunotinción y penetración de colorantes para definir proteínas de unión septata plisadas en el núcleo en epitelios embrionarios de Drosophila

Aprende a realizar inmunofluorescencia facilitada por sonicación en tejidos de Drosophila melanogaster sin necesidad de disección. Este protocolo mejora la penetración de anticuerpos para visualizar proteínas en desarrollo.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval

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