La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval Drosophila Tejidos In Situ
14 de agosto de 2014
La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.
El objetivo general de este procedimiento es visualizar o saciar los tejidos en C dos utilizando microscopía de fluorescencia después de la sonicación. Esto se logra recolectando primero muestras embrionarias y larvales y luego fijándolas con formaldehído, heptano y metanol. El segundo paso es sonicar la muestra fija para eliminar la cutícula y permitir la penetración de los anticuerpos.
A continuación, la muestra se tiñe inmunológicamente con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes. El paso final es montar la muestra en una solución Antifa a base de glicerol. En última instancia, la microscopía confocal o epifluorescente se utiliza para visualizar el tejido en desarrollo, así como la expresión y localización de proteínas.
La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos como la disección de tejidos, es que permite la visualización de una variedad de tejidos en desarrollo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el paso de sonicación depende de una serie de factores para lograr la máxima eficiencia, incluido el posicionamiento adecuado de la sonda sónica. Ashley Fiddler y Lauren Bole, dos talentosas investigadoras universitarias de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento.
Para comenzar el experimento, retire con cuidado los embriones recolectados en una placa de agar con un pequeño pincel unido con tampón de fosfato Triton X 100 o solución de PBTX. A continuación, limpie el pincel cargado de muestra contra la cresta orientada hacia el interior de un colador de celdas. Coloque una cubierta de placa de Petri debajo del colador de celdas.
A continuación, enjuague el pincel y las paredes del filtro de células con un frasco rociador que contenga PBTX. Después de que la muestra se haya transferido al colador, vierta suficiente PBTX en el colador para levantar la muestra de la malla. Repita este paso tres veces para eliminar los desechos de levadura y moscas, elimine PBTX.
Luego vierta la solución de lejía al 50% en el colador y deje que las larvas se asienten en la solución durante cinco minutos. A continuación, retire la solución. A continuación, lave la muestra con PBTX y deje reposar la muestra en la solución durante tres minutos.
Repita el paso cinco veces, seque la parte inferior del colador de celdas. A continuación, utilice un pincel unido con PBTX para transferir la muestra a un vial de centelleo que contenga 1,75 mililitros de pems. En una campana extractora, agregue 250 microlitros de formaldehído al 37% y ocho mililitros de grado reactivo.
Heptano al vial de centelleo y agite el vial a 200 RPM durante 20 minutos. A continuación, añada 10 mililitros de metanol al vial de centelleo sin eliminar la fase acuosa y agite enérgicamente a 500 RPM. Después de agitar, vierta inmediatamente el contenido en un colador de celdas sobre un contenedor de desechos líquidos.
Agregue metanol adicional al vial y pase el contenido a través del colador de celdas. Para asegurarse de que se ha extraído toda la muestra. Pruebe la parte inferior del filtro de células con tejido de laboratorio.
A continuación, aplique un pincel para transferir la muestra del colador a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene 0,5 mililitros de metanol. Espere a que la muestra se asiente. A continuación, retire el metanol con una pipeta y sustitúyalo por una alícuota nueva de 0,5 mililitros de metanol.
Repita este paso tres veces y agregue 0,5 mililitros finales de metanol al tubo antes de almacenarlo a menos 20 grados centígrados. Para más tarde, use recuperar la muestra almacenada del congelador y eliminar el metanol con una pipeta. A continuación, añada un mililitro de una solución tampón de fosfato de metanol al 50% o PBTW al tubo, y agite el tubo durante tres minutos.
A continuación, enjuague la muestra con un mililitro de PBTW dos veces dejando que la muestra se asiente antes de extraer el PBTW con una pipeta, agregue 1,0 mililitros de albúmina sérica bovina tamponada con fosfato tween, o BBTW al vial, y muévalo durante tres minutos. Deje que la muestra se asiente y retire el BBTW con una pipeta. Repita este paso dos veces.
Teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad posible de BBTW sin perder nada de la muestra. A continuación, añade 0,5 mililitros de BBTW al tubo y colócalo sobre hielo. A continuación, configure el sonicateto al 10% de amplitud máxima y un tiempo de ejecución de dos segundos con constante activación, limpie la sonda del ator colocando la punta de la sonda en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de agua desionizada y ejecute el sonicate.
A continuación, seque la sonda de sonicate con un pañuelo de laboratorio. Sumerja la sonda en el tubo, de tres a cuatro milímetros por encima de la muestra, e inicie la sonicación. A continuación, retire el tubo y colóquelo en hielo durante 30 segundos para evitar el sobrecalentamiento de la sonicación y permitir que la muestra se deposite en el fondo del tubo.
Repita este paso según lo requiera la edad de la muestra una vez finalizada la sonicación. Enjuague la muestra dos veces con un mililitro de BBTW. Después de cada enjuague, deje que la muestra se asiente antes de secar BBTW Con una pipeta, agregue un mililitro de BBTW al vial y colóquelo en un balancín.
Después de tres minutos, deje que la muestra se asiente y retire el BBTW con una pipeta. A continuación, repita esto. Paso dos veces, bloquee la muestra con 0,5 mililitros de suero normal al 5% diluido en BBTW en el tubo y coloque la muestra en un balancín durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, agregue 0,5 mililitros de solución de anticuerpo primario y balancee la muestra durante la noche a cuatro grados centígrados, deje que la muestra se asiente en el fondo del tubo. A continuación, extraiga los anticuerpos primarios con una pipeta y enjuague dos veces con un mililitro de BBTW. Agregue un mililitro de BBTW al vial y luego colóquelo en un balancín durante tres minutos.
A continuación, retire el BBTW con una pipeta y repita esto. Paso cinco veces, bloquee la muestra con una solución BBTW de suero normal al 5% y muévala durante 30 minutos. A continuación, retire la solución.
Agregue el anticuerpo secundario diluido al 5% de la solución de BBTW sérico normal y envuelva el tubo en papel de aluminio. A continuación, mece la muestra durante la noche a cuatro grados centígrados. Extraiga los anticuerpos secundarios con una pipeta y enjuague la muestra con un mililitro de PBTW dos veces.
A continuación, agregue un mililitro de PBTW al vial y colóquelo en un balancín durante cinco minutos. A continuación, deje que la muestra se asiente y retire el PBTW con una pipeta. Repite esto.
Paso tres veces. Agregue de 80 a 100 microlitros de solución de DAB co al tubo y guárdelo a 20 grados centígrados negativos. Finalmente, para montar la muestra, use de cinco a 10 microlitros de dab BCO p lene diamina, o PPD anti decoloración.
Luego obsérvalo con microscopía de fluorescencia. Estas proyecciones Z de cuatro cortes confocales demuestran la eficacia del protocolo para visualizar las características morfológicas, así como las células individuales en C, dos, durante las etapas embrionarias tardías a principios y medias L tres del desarrollo de Drosophila. El desarrollo de los testículos es un sistema particularmente bueno para ilustrar la eficacia del protocolo porque la maduración de los testículos es dinámica a lo largo del desarrollo larval.
Estas imágenes resaltan las células germinales en las células rojas y centrales, y las zonas FU en verde, secciones confocales simples de tres cerebros L medio. Tinción inmunológica para células madre ganglionares, neuronas indiferenciadas en neuronas verdes e inmaduras y primarias. En rojo muestran una tinción fuerte con distintos patrones de expresión en los lóbulos cerebrales y el cordón nervioso ventral, dependiendo de la orientación del montaje, las imágenes permiten la visualización del tejido cerebral desde la superficie dorsal, la superficie ventral o en la sección transversal sagital.
Esta técnica in situ dos permite a los biólogos explorar el desarrollo de órganos en la morfogénesis de tejidos en organismos donde la cutícula protectora impide la penetración de anticuerpos. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo sonicar e inmunoteñir muestras de esófago embrionario y larvario en fase tardía para visualizar los tejidos en desarrollo en C dos. No olvide que trabajar con formaldehído, heptano y metanol puede ser extremadamente peligroso y precauciones como trabajar en una campana extractora.
Siempre se debe observar el uso de guantes adecuados y una bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la inmunotinción de tejidos de Drosophila melanogaster utilizando sonicación. El método permite la visualización de tipos celulares y proteínas específicos sin necesidad de disección, mejorando la eficiencia en el estudio de tejidos en desarrollo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- La inmunotinción es fundamental para visualizar proteínas en tejidos.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren disección, lo cual puede llevar mucho tiempo.
- La sonicación puede facilitar la penetración de los anticuerpos al eliminar la cutícula.
- Se utiliza microscopía de fluorescencia para observar la localización de proteínas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo eficiente de inmunotinción para larvas en montaje completo.
- Visualizar la expresión proteica en tejidos de Drosophila.
- Mejorar la accesibilidad de la penetración de anticuerpos en muestras fijadas.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras embrionarias y larvarias.
- Fijación utilizando formaldehído, heptano y metanol.
- Sonicación para eliminar la cutícula.
- Inmunotinción con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes.
Resultados principales
- Visualización exitosa de tejidos en desarrollo mediante microscopía de fluorescencia.
- Penetración eficaz de anticuerpos lograda mediante sonicación.
- Localización clara de proteínas dentro de las muestras.
- El protocolo mejora la eficiencia de los procedimientos de inmunotinción.
Conclusiones
- El método descrito simplifica el proceso de inmunotinción.
- La sonicación es una técnica valiosa para preparar tejidos de Drosophila.
- Este protocolo puede adoptarse ampliamente para estudios similares en biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de inmunofluorescencia facilitado por sonicación aborda un cuello de botella clave en la investigación de biología del desarrollo: la cutícula impermeable en embriones y larvas de Drosophila en estadios tardíos que dificulta la penetración de los anticuerpos. Al permitir la inmunotinción en preparaciones completas sin necesidad de disección, el protocolo mejora el rendimiento y preserva la morfología del tejido, lo que favorece una validación confiable de los objetivos en cribados genéticos y fenotípicos. El enfoque aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar datos cuantitativos y resueltos espacialmente sobre la expresión proteica, esenciales para reducir el riesgo mecanicista de las hipótesis terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la localización proteica en tejidos intactos, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Facilita el procesamiento de alto rendimiento de un gran número de muestras, mejorando la eficiencia en los flujos de trabajo de validación de dianas.
- Valor estratégico: Posibilita el cribado fenotípico al permitir el análisis simultáneo de múltiples tipos de tejidos (por ejemplo, testículos, ovarios, tejidos nerviosos) a lo largo de las etapas del desarrollo.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia que permiten la evaluación estandarizada de los niveles de expresión de antígenos.
- Valor operativo: Mantiene la arquitectura tisular in situ, asegurando la reproducibilidad del ensayo y reduciendo la variabilidad debida a artefactos del disección.
- Valor estratégico: Prepara sistemas biológicos validados para el cribado de compuestos posteriores al confirmar la interacción con el blanco y los patrones de expresión.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona resolución celular relevante para enfermedades en modelos de Drosophila, apoyando el descubrimiento traslacional de biomarcadores para vías neurodesarrolladoras y reproductivas.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de protocolos consistentes de preparación y tinción de tejidos.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar datos fiables de localización proteica con resolución espacial.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder, especialmente cuando el cribado fenotípico requiere el análisis de tejido intacto y la localización cuantitativa de proteínas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la visualización de tipos celulares específicos y la expresión proteica en tejidos en desarrollo.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante inmunotinción estandarizada y reproducible con salidas cuantitativas de fluorescencia adecuadas para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables (intensidad de fluorescencia, patrones de localización) que permiten a los equipos comparar condiciones experimentales y evaluar la modulación del blanco.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar datos a nivel tisular alineados con fenotipos del desarrollo relevantes para modelos de enfermedades humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de preparación de muestras reutilizable aplicable en múltiples proyectos de biología del desarrollo y tamizaje genético.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir los falsos negativos provocados por una mala penetración del anticuerpo y mejora la precisión en la validación del blanco.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante un protocolo optimizado, sin necesidad de disección, compatible con el procesamiento de alto volumen.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/no continuar al proporcionar información mecanicista confiable, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo del blanco.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en patrones de expresión validados y en su relevancia funcional en sistemas relacionados con la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la optimización de parámetros de sonicación (posición de la sonda, amplitud, duración) para evitar daños en la muestra mientras se asegura la eliminación de la cutícula.
- Depende del acceso a equipos de sonicación con controles precisos de amplitud y temporización, junto con reactivos estándar de inmunofluorescencia y microscopía de fluorescencia.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de sonicación y tinción para garantizar la reproducibilidad entre usuarios y laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de tejidos y etapas de desarrollo de Drosophila, ya que la eficiencia de la sonicación puede variar según la edad de la muestra y el grosor de la cutícula.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de optimizar los tiempos de incubación de anticuerpos para dianas de baja abundancia y el manejo cuidadoso de reactivos peligrosos (formaldehído, heptano, metanol).
