Summary
Questo articolo descrive un metodo per generare embrioni chimerici che sono progettati per testare i contributi specifici per specie di cresta neurale e / o di altri tessuti per lo sviluppo craniofacciale.
Abstract
La generazione di embrioni chimerici è un approccio diffuso e potente per studiare destini cellulari, interazioni tessuti, e contributi specie-specifici per l'istologico e sviluppo morfologico degli embrioni dei vertebrati. In particolare, l'uso di embrioni chimerici ha stabilito l'importanza della cresta neurale nel dirigere la morfologia specie-specifico del complesso craniofacciale. Il metodo descritto utilizza due specie aviarie, anatre e quaglie, con notevolmente diversa morfologia cranio-facciale. Questo metodo facilita notevolmente la ricerca di regolazione molecolare e cellulare del modello di specie-specifico nel complesso cranio-facciale. Esperimenti di quaglia e anatra embrioni chimerici hanno già rivelato interazioni dei tessuti neurali cresta-mediata e comportamenti cellule autonome che regolano specie-specifico modello nello scheletro cranio, muscolatura e tegumento. La grande diversità dei derivati neurali della cresta suggerisce un potenziale significativoper le applicazioni future del sistema chimerico quaglia-anatra alla comprensione dello sviluppo dei vertebrati, la malattia, e l'evoluzione.
Introduction
Lo scheletro facciale sviluppa dalla crescita e fusione di più processi facciali che sono costituiti da cresta neurale e mesodermica mesenchima circondato da ectodermica e endodermico strati epiteliali 1-11. Eventi morfogenetici all'interno di ogni processo sono disciplinate dalle interazioni segnalazione distinte tra mesenchima e epiteli circostanti 12-16. Modifiche di queste interazioni di segnalazione e / o dei loro effettori a valle contribuiscono a fenotipi della malattia e possono anche essere rilevanti per l'evoluzione dello scheletro cranio-facciale 17, 18. Pertanto, chiarire i tempi e la natura delle interazioni dei tessuti ha un grande potenziale per aumentare la nostra comprensione della biologia dello sviluppo ed evolutiva dello scheletro facciale.
L'uso di embrioni chimerici per studiare le interazioni dei tessuti ha una lunga storia nella biologia dello sviluppo. Questo approccio è stato lanciato da Hans Spemann e il suo laboratorioche ha scoperto embrionali "organizzatori" di trapianto dei tessuti tra gli embrioni di diverse specie di anfibi. Spemann era un maestro di tecniche micro-chirurgiche la cui mano-competenze sono state integrate dal suo sviluppo di strumenti specializzati, in particolare la pipetta Spemann. Viktor Hamburger era uno studente laureato nel laboratorio di Hans Spemann a Friburgo nel corso del 1920, che è quando sono stati eseguiti gli esperimenti di trapianto originali che hanno portato il Premio Nobel Spemann. Quando Hamburger trasferì a Washington University di St. Louis nel 1935, ha dettagliato il processo di creazione di una micropipetta Spemann nel suo Manuale di Experimental Embryology 19. Drew Noden era uno studente laureato nel laboratorio di Hamburger alla Washington University fino al 1972. Dopo essersi trasferito alla University of Massachusetts, Amherst e poi a Cornell University, Noden continuato fabbricazione e l'utilizzo di micropipette Spemann per i suoi trapianti chirurgici che coinvolgono chimere quaglia-chick. &# 160;. Mentre uno studente laureato, uno degli autori (Rich Schneider) addestrati, con Drew Noden alla Cornell 1995-1998 Il seguente protocollo per fare una micropipetta Spemann è basato sulle descrizioni scritte da Hamburger e Noden, e comprende successive modifiche apportate by Schneider.
L'uso di chimere quaglia-chick per lo studio dello sviluppo cranio-facciale e soprattutto per comprendere i contributi di cellule della cresta neurale è stato lanciato da Noden e Le Douarin nei primi anni 1970, rivisto a Le Douarin et al 20. Questo approccio è stato largamente adottata in molti studi e da numerosi altri ricercatori 1, 4, 5, 21-38. I tassi equivalenti di crescita e la morfologia della quaglia e pulcino fanno trapianti al loro interno ideale per lo studio del destino delle cellule e lineage tracing. Tuttavia, a causa delle somiglianze tra quaglie e pulcino, cambiamenti morfologici induced da cellule del donatore sono difficili da decifrare. Al contrario, altri sistemi chimerici aviaria hanno incluso anatra domestica come un modo per studiare i meccanismi che fanno gli embrioni anatomicamente distinti 39-50. Più in particolare, il sistema chimerico quaglia-duck offre molteplici vantaggi per discernere gli effetti del donatore sull'host, e viceversa. In primo luogo, quaglia e anatra embrioni sono distinti in termini di dimensioni del corpo e la forma, che fornisce un modo diretto per esplorare donatori-o meccanismi specifici dell'host di formazione del pattern testando per i domini differenziali di espressione genica (Figure 1 A e B). In secondo luogo, quaglie e anatre embrioni hanno notevolmente diversi tassi di maturazione, con quaglia cova in 17 giorni e anatra cova in 28 giorni. Trapiantato cresta neurale mantiene il suo tasso di maturazione intrinseca all'interno dell'ambiente ospite, e, quindi, l'identificazione di cambiamenti temporali nell'espressione genica, interazioni di tessuto, istogenesi e morfogenesi è possibile51-57. Infine, l'anticorpo anti-nucleare quaglia (Q ¢ PN) consente donatori e ospitare contributi cellulari siano permanentemente distinti l'uno dall'altro riconoscendo una proteina che è ubiquitariamente espresso in cellule quaglia ma assente da cellule anatra.
Protocol
1. Preparare tungsteno aghi
- Tagliare una canna tungsteno a metà con tronchesi in modo che l'asta non si piega.
- Infilare l'asta fino alla fine conica di un 5 3/4 in vetro borosilicato pipetta Pasteur.
- Lasciando circa 3/4 della attaccare in asta dal vetro, aderire l'asta alla punta della pipetta con una piccola quantità di "hot melt" (HMA), che è il bastone colla utilizzata per una pistola per colla. L'HMA deve essere rapidamente sciolto in una fiamma di alcool, facendo attenzione a non bruciare la colla e generare fumo nero.
- Usando un paio di pinze, piegare la punta della canna tungsteno (circa 1/4 in dall'estremità superiore) fino a un angolo di 45 ° è raggiunto.
- Tenendo la pipetta Pasteur, collocare circa 1/8 della punta della canna tungsteno nella fiamma di un bruciatore a gas propano. Tenere la punta costante e esattamente perpendicolare alla fiamma.
- Estrarre l'ago della fiamma del momento in cui un minuscolo granello arancione tungsdieci vola via dell'ago.
2. Preparare Spemann Pipettes
- Utilizzando un becco Bunsen, riscaldare l'estremità più stretta di una pipetta Pasteur finché il vetro poco oltre la conicità inizia a fondere. Togliere dal fuoco e tirare la punta fino a quando la pipetta viene sigillato. Assicurarsi che permane una porzione di sezione conica che ha un diametro esterno di circa 0,7-1,0 mm. Rompere l'estremità sigillato circa 4 cm dal cono.
- Attaccare circa 2 ft (60 cm) di tubo in gomma al largo (aperto) fine della pipetta. Soffiare sull'altra estremità del tubo in gomma per assicurare che l'aria può passare attraverso la sezione conica della pipetta Pasteur.
- Utilizzando un cilindro combustibile propano con una torcia matita fiamma divisoria, riscaldare una superficie ovale su un lato della pipetta appena sotto l'inizio del cono. Soffiare aria molto delicatamente e costantemente attraverso il tubo di gomma con una leggera pressione (circa la quantità di pressione necessaria per dire all'inizio del letter "P" a livello di conversazione). Quando il vetro diventa morbido su un lato e comincia a deformarsi verso l'esterno, rimuovere rapidamente la pipetta dalla fiamma e soffiare forte e costante attraverso il tubo di gomma. Questo farà sì che la parte riscaldata del vetro per formare una bolla a forma di salsiccia che possono pop, che va bene. Se la bolla è troppo piccola, prova fusione e soffiando di nuovo il bicchiere. La finestra aperta finale del bicchiere dovrebbe essere di circa 0,25 (6,35 mm) di larghezza per 0,5 in (12,7 mm) lungo.
- Indicare l'estremità rastremata verso l'alto, raschiare la bolla in un contenitore di rifiuti di vetro mentre delicatamente soffia attraverso il tubo per evitare che frammenti di vetro di entrare nella pipetta.
- Utilizzando la fiamma propano, bruciare le restanti bordi della bolla e fuoco-lucidi i lati della finestra aperta. Fare attenzione a non sciogliere l'albero della pipetta.
- Con una matita punta di diamante, segnare l'estremità conica della pipetta circa 1,25 in (30 mm) dalla finestra e rompere la puntacon una pinza in modo che l'apertura pipetta è tagliato in modo pulito (pipette di rigetto con punte rotte o irregolari).
- Utilizzando pinze e il bordo di una fiamma di un bruciatore ad alcol, piegare la parte stretta della pipetta 0,375 in (9,5 mm) dalla punta di un angolo di circa 60 ° in modo che la porzione piegata è in un piano verticale quando l'apertura della finestra è nella posizione 1:00 per l'utilizzo mano destra e le 11:00 per l'utilizzo con la mano sinistra. Questo passaggio è meglio condotto in un recinto privo di correnti.
- Fuoco lucidare la punta con la fiamma di alcool sotto un microscopio da dissezione. Assicuratevi di non chiudere la punta, ma piuttosto mantenere l'apertura rotonda e liscia, senza alcuna costrizione.
- Tagliare un 1 (25 mm) pezzo di tubo di gomma, spruzzare il pezzo di tubo con il 70% di etanolo, e far scorrere il tubo sull'albero della pipetta fino all'apertura della finestra è completamente coperto. Questo funziona come il "diaframma" della pipetta Spemann.
- Posizionare una lampadina lattice di gomma 2 mlsopra il fondo aperto della pipetta. La lampadina mantiene la pressione negativa nella pipetta Spemann.
- Per pratica utilizzando una pipetta Spemann, perle trasferimento cromatografia di circa 100-200 micron di diametro da una marcata posto in una capsula di Petri a un marcato posto in un'altra sotto un microscopio.
- Per pulire la pipetta Spemann, rimuovere il gommino e pipetta, punta verso il basso, in un bicchiere alto foderato con cotone o garza sul fondo e riempito con acqua distillata e detergente cristalleria.
3. Sterilizzare e incubare uova
- Pulire le uova con il 70% di etanolo e mettere le uova su vassoi di uova di plastica.
- Impostare uova in una incubatrice riscaldata a 37,5 ° C e 85-87%.
- Incubare le uova fino a raggiungere HH9.5, circa 26 ore per le quaglie e 48 ore per l'anatra.
4. Uova Finestra
- Rimuovere un piccolo pezzo di guscio esterno dalla parte superiore dell'uovo con una pinza, facendo attenzione a non forare la calotta interna membrane.
- Usando una siringa con un 18 G da ago da 1 pollice, fare un buco sulla punta stretta dell'uovo e prelevare circa 1-2 ml di albume.
- Posizionare il nastro trasparente sopra il foro e segnare puntura nel guscio.
- Tagliare una "finestra" lungo la superficie superiore dell'uovo (attraverso il nastro trasparente) usando forbici curve.
5. Visualizza embrioni e preparare per la chirurgia
- Utilizzando una bacchetta di vetro, spazzolare delicatamente una piccola quantità di rosso neutro (0,02 g / ml in BSS di Hank) sopra l'embrione.
- Tagliare la membrana vitellina e tirarlo sopra l'embrione utilizzando un ago di tungsteno-affilata fiamma.
- Ri-sigillare l'uovo posizionando il nastro trasparente sulla finestra.
6. Separare il tessuto dei donatori dall'embrione Donor
- Rimuovere il nastro dalla finestra sull'uovo dell'embrione donatore.
- Per tagliare la piega neurale dall'ectoderma adiacente dell'embrione donatore, fare tagli su entrambi i sides del tubo neurale, utilizzando un ago di tungsteno affilate fiamma (fabbricato come descritto sopra).
- Poi, tutto il taglio del tubo neurale anteriore e posteriore livelli dell'innesto desiderate e separare l'innesto dal resto del tubo neurale.
- Rimuovere la piega neurale dall'embrione donatore utilizzando una pipetta Spemann o altro tipo di micropipetta.
- Poi, rimuovere il nastro dalla finestra sull'uovo host e utilizzare la pipetta Spemann per posizionare il donatore neurale piega lungo l'embrione ospite adiacente alla regione del tubo neurale che riceverà il trapianto.
7. Separare il tessuto ospite e Trapianti tessuto del donatore
- Separare la piega neurale dal tubo neurale dell'embrione ospitante, come fatto con il donatore. Fate attenzione a rimuovere un innesto di pari dimensioni come il tessuto del donatore.
- Spingere delicatamente questo tessuto ospite lontano dal embrione.
- Poi, con un ago di tungsteno smussato o la punta arrotondata di un micropipette, spostare delicatamente il neurale donatore piega nel tubo neurale ospitante, mantenendo gli orientamenti antero-posteriore e dorso-ventrale corretta. Assicurarsi che l'innesto è nascosto in lungo i lati, ma essere sicuri di non colpire o danneggiare i tessuti sottostanti. Per tenere traccia della nota orientamento originale qualsiasi asimmetria nel tessuto donatore o colorazione differenziale dal rosso neutro. Abbiamo anche foto-documento l'embrione donatore con il tessuto asportato accompagnamento, nonché la chimera immediatamente dopo l'intervento.
- Salina sterile deve essere aggiunto l'uovo se l'embrione host mostra segni di disseccamento.
- Ora, accuratamente ri-tenuta ed etichettare l'uovo, e delicatamente ritorno ad un incubatore alto tasso di umidità (70-80%), dove l'embrione chimerico può sviluppare alla fase desiderata per l'analisi.
8. Insieme di Chimere
- Assicuratevi di raccogliere embrioni chimerici in appena fatta fissativo freddo di Serra e subito metterli su un rocker a 4 ° C per una fissazione O / N. Ciò consentirà di rilevamento più sensibile di cellule quaglia con l'anticorpo anti-quaglia.
- Per analisi dell'espressione genica mediante RT-qPCR, congelare embrioni direttamente in azoto liquido prima estrazione di RNA.
Representative Results
Prima di ulteriori analisi, l'efficienza del trapianto deve essere dosati. Per istologico, espressione morfologica, o gene analisi su campioni di tessuto, cellule quaglia devono essere rilevati mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi Q ¢ PN come descritto 36. Per RNA analisi, i contributi specie-specifiche per i tessuti di interesse possono essere calcolati utilizzando una strategia basata sulla PCR 58. Dopo l'efficacia del trapianto è stata convalidata, altre misure di esito morfologici o molecolari possono essere valutati in chimere. Le interazioni tra i donatori cellule della cresta neurale e tessuti dell'ospite-derivati e dintorni che sono alla base corretta istogenesi e la morfogenesi del complesso cranio-facciale hanno già stati ampiamente studiati. In particolare, neural crest mesenchima dirige specie-specifica morfologia del viso 7, 13, 51, 59, piuma modello 52, modello muscolare 56 up>, e la cartilagine 53, 57 attraverso la regolazione dell'espressione genica host. Ad esempio, neural crest mesenchima determina quando le forme osso nella mandibola da temporalmente regolazione dell'espressione Bmp4 55.
Recentemente, le indagini si sono concentrate sulle interazioni dei tessuti che si verificano molto presto nello sviluppo craniofacciale. A questo proposito, gli esperimenti che utilizzano chimere quaglia-anatra hanno dimostrato embrioni di accoglienza influenzano la migrazione cresta neurale, determinando i limiti morfologici. Cioè, in embrioni chimerici quck, cellule della cresta neurale quaglia donatore migrano nell'ospite arco anatra mandibolare in un modello duck-like (Figura 1D). Nonostante questo contributo ospitante alla dimensione della popolazione cresta neurale, il donatore cresta neurale continua a generare uno scheletro mandibolare che è quaglie simile per forma e dimensioni (Figura 1E).
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Figura 1. Quaglia-Anatra chimerico sistema. (A) Quaglia e (B) crani anatra mostrano notevoli differenze di forma e dimensione, e, quindi, sono ideali per l'utilizzo di un sistema chimerico per studiare lo sviluppo craniofacciale (modificato da Tokia et al. 56). (C) progettazione sperimentale per la generazione di unilaterali embrioni chimerici quck dal palco corrispondenza HH9.5 quaglia ed embrioni di anatra. La piega neurale viene rimosso da un lato di embrioni di quaglia e trapiantate in embrioni di anatra dopo un pezzo della piega neurale equivalente è stato rimosso. (D) cellule Quail donatore (verde) può essere seguita in chimere usando un anticorpo anti-quaglia (Q ¢ PN) come mostrato in vista ventrale di HH12 embrioni chimerici. (F) In mandibole quck al HH38, la quaglia donatore-derivati Meckel7; s cartilagine è più corto e più dritto di quella osservata per l'anatra cartilagine controlaterale ospitante derivato di Meckel, che è più grande e curvo. Ristampato Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007), con il permesso di Elsevier.
Discussion
La cresta neurale è una popolazione di cellule embrionali transitoria che migra estesamente durante l'embrione e differenzia in tipi cellulari diversi, compresi condrociti e osteoblasti, che contribuiscono allo scheletro craniofacciale. Trapianto cresta neurale nel sistema chimerico quaglia-duck ha contribuito notevolmente alla nostra comprensione delle interazioni dei tessuti e vie di segnalazione che regolano lo sviluppo dello scheletro cranio-facciale. Tuttavia, dato il vasto potenziale della cresta neurale di generare anche le cellule muscolari lisce, adipociti, melanociti, cellule di Schwann e neuroni, il sistema chimera quaglia, anatra ha un enorme potenziale per le applicazioni future, in particolare in concomitanza con il rapido avanzamento della biologia delle cellule staminali e la medicina rigenerativa. Poiché quaglia e anatra sono entrambe le specie allevate in commercio, una pronta fornitura di uova fecondate relativamente poco costoso è disponibile da una varietà di aziende. Così, questa tecnica dovrebbe essere accessibile a Researcil suo operare all'interno di una vasta gamma di budget e spazio struttura.
Sebbene questa tecnica è molto potente, rimangono diverse limitazioni. Come altre tecniche chirurgiche, la qualità e la vitalità delle chimere quaglia, anatra contare sulle abilità chirurgica del ricercatore, e, quindi, non ci saranno più variazioni inter-e intra-individuale tra esperimenti, rispetto ad altri modelli, come quelli che utilizzano il mouse genetica. Inoltre, vi è anche una variazione nel tasso di sviluppo e modulazione di singoli embrioni che contribuisce alla riproducibilità e il successo di ogni trapianto. Embrioni di uccelli sono molto sensibili alla disidratazione e quindi passaggi critici durante la chirurgia includono mantenere i livelli di luce bassa, il tempo sotto il microscopio al minimo, le uova chiuse con nastro, per quanto possibile, e alta umidità nell'incubatrice post-operatorio per evitare l'essiccamento.
In termini di redditività delle chimere, usually tra il 50-75% sopravvive, anche se queste percentuali possono diminuire il più vecchio fase di raccolta. In una tipica sessione di 4-6 ore di intervento chirurgico, un chirurgo esperto in grado di generare 10-15 chimere. Il successo dei trapianti dipende anche molto dalla qualità degli strumenti. Buoni strumenti portano a più coerenti, risultati riproducibili. Utilizzando un cannello a gas propano per fare gli aghi di tungsteno permette aghi estremamente nitide da effettuare. Il tipo di torcia utilizzato fa una grande differenza perché controlla la dimensione della fiamma. Affilatura elettrolitica può essere utilizzato anche, ma questo approccio non si avvicina nemmeno alla produzione di aghi taglienti. Utilizzare aste tungsteno invece di filo avvolta in modo che gli aghi possono essere fatte direttamente.
La micropipetta Spemann, mentre in termini di tempo e difficile da fare, è uno strumento ideale per il trasferimento dei tessuti. La pipetta può essere personalizzato con aperture di dimensioni diverse, e può essere usato ripetutamente. Un fattore critico per usinga Spemann micropipetta è avere qualche liquido nella pipetta prima di toccare la punta alla superficie dell'embrione. Alcuni del fluido sarà sempre fuoriuscire quando entra in contatto con il menisco sopra l'embrione. Premendo sulla membrana permette tessuto fluido e innesto di essere espulso con estrema precisione, mentre leggermente cedimento sul diaframma succhia delicatamente il trapianto di tessuto donatore nella pipetta. Il mantenimento di un po 'di pressione positiva sul diaframma mantiene l'innesto di tessuto donatore sulla punta della pipetta durante il trasferimento, e un po' la pressione sulla membrana permette l'innesto di tessuto donatore essere posto deliberatamente nell'ospite.
Per la protezione della pipetta Spemann durante lo stoccaggio e la sterilizzazione, togliere la lampadina dalla estremità larga e con attenzione inserire la punta affusolata nel bulbo. Posizionare la pipetta Spemann in una provetta di vetro, coprire la parte superiore con un foglio di alluminio, e sterilizzare in autoclave prima dell'intervento. Dopo più pipette sono ready essere sterilizzato di nuovo per la chirurgia, invertire le pipette, riscaldarle quasi a ebollizione nella stessa soluzione di acqua distillata e detergente vetro, e quindi risciacquare più volte con acqua distillata. Pipette Autoclave nei loro singoli tubi. Il tubo di gomma che forma il diaframma e il gommino deve essere sostituito dopo diverse sterilizzazioni o quando diventano oscurata e rigida.
Molti dei componenti di questo protocollo coinvolgono attrezzature pericolose. Ad esempio, la procedura per fare un Spemann Micropipetta prevede tre tipi di fiamme, così come il riscaldamento, tirando, soffiando, piegatura, taglio e lucidatura del vetro. Pertanto, indossando un equipaggiamento di protezione individuale (DPI), che aumenta la sicurezza come occhiali e un camice da laboratorio è critica. Inoltre, poiché molte persone soffrono, o che hanno il potenziale per sviluppare, allergie uovo, usare sempre i guanti quando si maneggiano le uova. Con queste precauzioni in mente, il sistema chimerico quaglia, anatra iSA metodo sicuro, efficace, e relativamente accessibile che ha molte applicazioni future.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da un Istituto Nazionale di Ricerca dentale e craniofacciale (NIDCR) F32 concessione (DE021929) per JLF e una borsa di DE016402 NIDCR R01 per RAS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| Hank’s BSS w/o phenol red | Invitrogen | 14025-092 | |
| Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | 0.22 µm filter-sterilized |
| 18 G Needles | BD | 305195 | |
| 5 ml syringe | BD | 309646 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Spemann Pipette | Hand-made in lab | ||
| Egg Holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
| Alcohol Burner | Fisher | 04-245-1 | |
| Transparent Tape | 3M Scotch | 600 | |
| Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
| Tungston wire (0.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
| Bunsun Burner | Fisher Scientific | S49117 | |
| Pasteur Pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
| Rubber Tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 in/1.6 mm; O.D.: 0.375 in/9.5 mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm |
| Propane Fuel Cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
| Diamond Point Pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
| Rubber Bulbs | Fisherbrand | S32325 |
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