Artículo de método

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

DOI:

10.3791/51581

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4 de febrero de 2014

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

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Este estudio describe un método detallado para el aislamiento y caracterización de células de cáncer de ovario primarios de muestras clínicas sólidos. Especímenes clínicos sobre el cáncer de ovario son sometidas a digestión enzimática para obtener, fibroblastos-epitelial libre de cáncer de ovario de células viables (EOC) muy adecuada para aplicaciones posteriores.

Resumen

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Se necesitan con urgencia herramientas fiables para la investigación de cáncer de ovario iniciación y progresión. Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de ovario sigue siendo una herramienta valiosa para comprender el cáncer de ovario, su uso tiene muchas limitaciones. Estos incluyen la falta de heterogeneidad y la plétora de alteraciones genéticas asociadas con pases prolongado in vitro. Aquí se describe un método que permite la rápida creación de células de cáncer de ovario primarios forman especímenes clínicos sólidos recogidos en el momento de la cirugía. El método consiste en someter las muestras clínicas a la digestión enzimática durante 30 min. Se deja que la suspensión de células aisladas a crecer y se puede utilizar para la aplicación aguas abajo incluyendo la detección de drogas. La ventaja de líneas celulares de cáncer de ovario primarios más de líneas celulares de cáncer de ovario establecidas es que son representativas de las muestras clínicas originales específicas que se derivan de y pueden ser derivados de diferentes sitios si a simplecáncer de ovario RY o metastásico.

Introducción

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A pesar de su relativamente baja incidencia, el cáncer de ovario es el más mortal de las enfermedades ginecológicas y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas fiables y modelos que recapitulan fielmente la iniciación y progresión de la enfermedad 3. La mayor parte de nuestro conocimiento hoy en día sobre el cáncer de ovario ha sido posible mediante el uso de células inmortalizadas de ovario epiteliales superficiales (IOSes), líneas celulares de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario primarios recuperados de fluido ascítico 4-7. Desafortunadamente, su uso tiene varias limitaciones, incluyendo un número de cambios genéticos y fenotípicos asociados con proceso de inmortalización o en pasajes in vitro y la heterogeneidad de la población resultante de la preparación de fluido ascítico.

Por lo tanto, las células de cáncer de ovario primarios derivados de muestras sólidas identificables y específicos de cáncer de ovario representan una unique herramienta para el estudio de la progresión del cáncer de ovario.

Las principales dificultades de las que obtienen estas células malignas se deben a un crecimiento excesivo de las células del estroma o fibroblastos junto con la pérdida de la viabilidad y la falta prematura de la capacidad proliferativa en el cultivo de estas células EOC. Actualmente, existen diversos métodos para crear suspensiones de una sola célula de tumores sólidos, a través de medios mecánicos o disociación enzimática, sin embargo ciertas técnicas producen una mayor cantidad de la solución preferida 8. Aquí, mostramos que la digestión enzimática con dispasa II resulta en una recuperación efectiva de células EOC-fibroblastos libre viables. Los cultivos de EOC así obtenidos son altamente susceptibles a la manipulación genética y también son útiles en pruebas de detección de drogas, lo que indica que estos cultivos EOC son adecuados para muchas aplicaciones posteriores.

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Protocolo

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Declaración de Ética
Muestras sólidas de cáncer de ovario se obtuvieron del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota (TPF), después de Comité de la Junta de Revisión Institucional: Sujeto Humano Board (IRB).

1. Configuración Reactivo

  1. Preparar medio DMEM completo completándolo DMEM con FBS al 10%, y 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Almacenar el medio a 4 º C y se calienta a 37 ° C antes de su uso.
  2. Alícuota dispasa II en volúmenes separados de 5-10 ml para evitar la congelación múltiple se descongela y se almacenan a -20 ° C en un congelador-nonfrost libre.

2. Tissue Collection

  1. Obtener muestras de sólidos de cáncer de ovario (~ 5 g de tamaño) en el momento de la cirugía de las zonas macroscópicamente identificados como cáncer por un patólogo. Las muestras clínicas son de-identificados y registrados de acuerdo con protocolos institucionales.
  2. Coloque las muestras en un recipiente estéril, sctapa Rew, polipropileno especímenes recipiente lleno con 30 ml de PBS enfriado en hielo. Transportar las muestras del laboratorio de patología quirúrgica para el laboratorio de investigación para el procesamiento en el hielo, y en 30 minutos desde la recogida de muestras (Figura 1).

3. Procesamiento de tejidos

  1. Trabajar en condiciones estériles, transferir las muestras en una placa de Petri (60 mm x 60 mm) que contenían 10 ml de fresca, helado de PBS y el uso de una hoja de afeitar estéril, más cortado en los pedazos más pequeños posibles (2 mm o menos) ( Las Figuras 2A y 2 B).
  2. Transferir los tejidos picados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de precalentado (37 ° C durante 30 min) dispasa II (2,4 U / ml) en DMEM y se incuba a 5% de CO 2 y 37 ° C durante 30 min. Para garantizar una digestión óptima de los especímenes, agitar manualmente la suspensión de células cada 5 min.
  3. Después de 30 min de incubación, la transferencia (utilizandouna pipeta serológica de 10 ml) de la suspensión de células en un filtro de células (70 micras de malla) colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y se aplica una presión suave contra la malla usando un émbolo de la jeringa. Descarte cualquier tejido no disociado (que queda en la parte superior de la malla) y recoger la suspensión de células obtenida en el tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 xg durante 7 min a 4 ° C (Figura 3).
  4. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS.
  5. Incubar la suspensión de células en una placa de Petri en 5% de CO 2 y 37 ° C (Figura 4).
  6. Cambie el medio después de 24 horas a partir de la placa inicial. Esto permite la eliminación de los desechos celulares y la mayoría de los eritrocitos presentes en la cultura.
  7. Cambie el medio cada tres días para las dos semanas siguientes, después de lo cual las culturas de EOC primaria están listos para aplicaciones posteriores.

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Resultados

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Muestras clínicas frescas de cáncer de ovario se recogen después de la cirugía (Figura 1) y se cortan en trozos pequeños (Figuras 2A y 2B) que constituyen la suspensión celular. Esto permite una exposición óptima de las muestras que el tratamiento enzimático. Suspensión de la célula se expone a la digestión enzimática y se incubó a 37 ° C durante 30 min. Durante el tiempo de incubación de la suspensión se vuelve cada vez más nublado (especialmente después de cada agitac...

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Discusión

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Una mejor comprensión de la etiología del cáncer de ovario y el desarrollo es crucial para mejorar el resultado de las mujeres afectadas por esta enfermedad devastadora. En este contexto, el uso de establecida y "comercialmente disponible" línea celular de cáncer de ovario, sin duda, ha sido tremendamente útil. Sin embargo, hoy sabemos que las líneas celulares de cáncer no son representativos del tumor humano se originaron en muchos aspectos, incluyendo la falta de heterogeneidad 9,10.

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias al personal del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota para obtener ayuda con la recolección de muestras de tejido de pacientes. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa de los Programa de Investigación de Cáncer de ovario (OCRP) OC093424 a MB, por la máquina de afeitar de la Investigación del Cáncer y el Fondo Randy Comunidad MB, por el ovario Cancer Alliance Minnesota para MB y por el fondo de Oncología Ginecológica Departamental de MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBS, estéril Invitrogen14190-144
Tapa de rosca, recipiente de polipropileno para muestras, estérilThermo Scientific02 1090
DMEM medio, estéril Invitrogen11995-065
Suero fetal bovino, estérilThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Penicilina-estreptomicina, líquidoInvitrogen15140-122
Dispasa II, estérilRoche04942 078 001
Pinza pequeña de punta fina y hoja de bisturí, estérilPinza Fisher Scientific: 08-953E, cuchillas: 08-927-5D
Tijeras de disección pequeñas, estérilesFisher Scientific08-945
15 ml Tubos con tapa cónica, estérilesBD Falcon352097
50 ml Tubos con tapa cónica, estérilesBD Falcon352027
10 ml Pipeta serológica, estéril Corning13-678-11E
6 ml Émbolo de jeringa, estéril Tyco Healthcare8881516911
Filtro de nylon (70 μ m ) colador de células, estérilBD Falcon352350
5 cm Placa de Petri, estéril Corning430166
placa de Petri de 10 cm, estéril Corning430167

Referencias

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  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

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