La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de Escherichia coli

Resumen

Polipéptidos elastina-como son biopolímeros de estímulo sensible con aplicaciones que van desde la purificación de proteínas recombinantes para la administración de fármacos. Este protocolo describe la purificación y caracterización de polipéptidos tipo elastina y sus péptidos o proteínas fusiones a partir de Escherichia coli utilizando su comportamiento de transición de fase la temperatura de solución crítica inferior como una alternativa simple a cromatografía.

Resumen

Polipéptidos elastina-como son biopolímeros repetitivas que exhiben un comportamiento de transición de fases temperatura de solución crítica inferior, unimers solubles existente por debajo de una temperatura de transición característica y la agregación en coacervados escala de micras por encima de su temperatura de transición. El diseño de polipéptidos-elastina como a nivel genético permite un control preciso de su secuencia y longitud, que determina sus propiedades térmicas. Polipéptidos Elastina-como se utilizan en una variedad de aplicaciones, incluyendo biosensores, la ingeniería de tejidos, y la administración de fármacos, donde la temperatura de transición y la arquitectura biopolímero de la ELP se pueden sintonizar para la aplicación específica de interés. Además, el comportamiento de transición de fase la temperatura de solución crítica inferior de polipéptidos tipo elastina permite su purificación por su respuesta térmica, de tal manera que su coacervación selectivo y resolubilización permite la eliminación de tanto contaminante soluble e insolubles siguiente expresión en Escherichia coli. Este enfoque puede ser utilizado para la purificación de polipéptidos tipo elastina solos o como una herramienta para la purificación de péptidos o proteínas fusiones donde péptidos recombinantes o proteínas adjuntas genéticamente para etiquetas de polipéptidos tipo elastina se pueden purificar sin cromatografía. Este protocolo describe la purificación de polipéptidos tipo elastina y sus péptidos o proteínas fusiones y discute técnicas básicas de caracterización para evaluar el comportamiento térmico de productos de polipéptidos tipo elastina puros.

Introducción

Polipéptidos elastina-como (ELPS) son biopolímeros formados por la repetición VPGXG pentapéptido donde X, el residuo de invitados, es cualquier aminoácido excepto prolina. ELPs exhibición temperatura de solución crítica inferior (LCST) comportamiento de transición de fase, de tal manera que una solución homogénea ELP se separará en dos fases con el calentamiento a su LCST, que comúnmente se llama la temperatura de transición inversa (T _t) en la literatura ELP ^1. Las dos fases se componen de una fase muy diluida glóbulo ELP y una fase rica en sedimentos ELP. Los ricos sedimentos ELP se forma en un corto plazo de tiempo tras la agregación de las cadenas de ELP en partículas de tamaño micrométrico que posteriormente se unen. Este comportamiento se produce en un intervalo de pocos grados Celsius y es normalmente reversible, como se recupera una solución homogénea al regresar a una temperatura por debajo de la T _t.

ELPs se sintetizan típicamente en Escherichia coli (E. coli) lado a otrom un gen artificial que se ligó en un plásmido de expresión. Este plásmido se transforma entonces en una E. línea celular coli que es óptimo para la expresión de proteínas. Hemos utilizado exclusivamente el sistema de vector T7-lac pET para la expresión de una gran variedad de ELPs en E. coli, aunque otros sistemas de expresión en levadura ^{2-4, 5} hongos, plantas y ^6-8 también han sido utilizadas por otros investigadores. Una serie de enfoques que existen para construir genéticamente genes repetitivos ELP, incluyendo ligadura recursiva direccional (RDL) ^9, la ligadura direccional recursiva por la reconstrucción plásmido (Pre-RDL) ^10, y la superposición de extensión amplificación por círculo rodante (OERCA) ^11. La capacidad para diseñar ELPs a nivel genético brinda la oportunidad de utilizar técnicas de ADN recombinante para crear ELPs con una variedad de arquitecturas (por ejemplo, monobloques, dibloques, tribloques, etc), que se puede añadir adicionalmente con funcionalespéptidos y proteínas. De control a nivel genético también se asegura de que cada ELP se expresa con la longitud y la composición dictados por su plantilla plásmido genética exacta, proporcionando productos de biopolímeros perfectamente monodispersas.

Las propiedades térmicas de cada ELP dependen de parámetros intrínsecos a la biopolímero tal como su peso molecular (MW) y la secuencia, así como los factores extrínsecos incluyendo su concentración en la solución y la presencia de otros cosolutos, tales como sales. La longitud de la ELP ¹² y su composición residuo huésped ^{1, 13, 14} son dos parámetros ortogonales en el diseño de ELP que se pueden utilizar para controlar la T _t, donde los residuos hidrofóbicos de los huéspedes y longitudes de cadena más larga da como resultado menor T _t s, mientras que hidrófilo residuos de huéspedes y longitudes de cadena más corta resultan en una mayor T _t s. Concentración ELP está inversamente relacionada con la T _t, donde las soluciones de GRconcentración ELP comedor tiene menor T _t s ^12. El tipo y la concentración de sales también influyen en la ELP T _t, donde el efecto de las sales sigue la serie de Hofmeister ^15. Aniones Kosmotropic (Cl ^- y más alto en la serie de Hofmeister) bajan el ELP T _t y aumentando la concentración de sal aumenta este efecto. Estos parámetros intrínsecos y extrínsecos pueden ajustarse para obtener comportamiento térmico dentro de un rango de temperatura objetivo que se requiere para una aplicación específica de un ELP.

El comportamiento de respuesta de estímulo-PEL es útil para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo biosensores ^{16, 17,} la ingeniería de tejidos ^18, y de suministro de medicamento ^{19, 20.} Además, cuando ELPs se fusionan a péptidos o proteínas a nivel genético, el ELP puede servir como una simple etiqueta de purificación para proporcionar un método por lotes de bajo costo para la purificación de Pep recombinantemareas o proteínas que no requiere de cromatografía ^21. Modificación del proceso de purificación asegura que se mantiene la actividad del péptido o proteína fusionada a la ELP. Péptido o proteína ELP fusiones pueden ser purificados para aplicaciones en las que la etiqueta ELP es útil ^{22, 23} o, alternativamente, cuando se requiere el péptido o la proteína libre, un sitio de reconocimiento de la proteasa puede ser insertado entre el péptido o proteína y ELP. La eliminación de la etiqueta ELP puede entonces lograrse mediante la digestión con proteasa libre o una fusión ELP proteasa, donde este último ofrece la facilidad adicional de procesamiento como una ronda final de purificación ELP puede separar la etiqueta y la proteasa ELP ELP fusión del péptido diana o proteína en un solo paso ^{24, 25.} El siguiente protocolo describe el procedimiento de purificación para ELPs y péptidos o proteínas ELP fusiones por medio de sus propiedades térmicas y se analizan las técnicas básicas para la caracterizaciónla respuesta térmica de productos ELP.

Protocolo

1. ELP Expresión

1. Inocular 3 ml de medio Terrific Broth estériles con una madre de DMSO o colonia placa de agar de E. coli adecuado para la expresión de proteínas que contiene el plásmido ELP-codificación deseada bajo el control del promotor lac de T7. Añadir el antibiótico apropiado e incubar a 37 ° C durante la noche (O / N) con agitación continua a 200 rpm.
2. Añadir 1 ml del cultivo O / N para 1 l de caldo Terrific Broth medio estéril en un matraz de 4-L. Añadir el antibiótico apropiado e incubar a 37 ° C durante 24 h con agitación continua a 200 rpm. NOTA: El "fugas" expresión basal visto con el promotor T7-lac es suficiente para la expresión de alto nivel de muchos ELPs si el cultivo se incuba durante 24 horas. Sin embargo, un enfoque más convencional se puede utilizar, en el que la expresión de proteínas es inducida por la adición de 0,2-1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) cuando la densidad óptica del cultivo alcanza 0,6.
3. Transferir el cultivo del matraz de 4-L a una botella de centrifugación de 1 l y se centrifuga a 4 ° C durante 15 min a 2000 x g.
4. Eliminar el sobrenadante. NOTA: Si se cultiva más de 1 litro de la cultura que se pueden condensar añadiendo otro litro de cultivo al sedimento y el paso 1.3 repitiendo. Hasta 2 l de cultivo se puede condensar en una sola sedimento celular.
5. Resuspender el sedimento en tampón fosfato salino (PBS), agua, u otro tampón deseado para llegar a 45 ml de suspensión de células y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml.

2 de purificación: ELP. Pasos preliminares y Primera Ronda de Inverse Transición Ciclismo

1. Sonicar el sedimento celular se resuspendió por un total de 9 minutos en ciclos de 10 seg 'ON' y 20 seg "off" en una potencia de salida de 85 W, mientras se mantiene la muestra en hielo. Brevemente dejar que la muestra se enfríe sobre hielo y luego repetir el ciclo de 9 min, una vez más. NOTA: Si se ha previsto la ELP tener una T muy baja _t el intervalo de "off" se puede aumentar hasta 40 seg para evitar el calentamiento de la solución por encima de la T _t.
2. Transferir el lisado a un redondo de 50 ml tubo de centrífuga de fondo.
3. Añadir 2 ml de 10% (w / v) de polietilenimina (PEI) para cada litro de cultivo y agitar para mezclar. NOTA: PEI es un polímero cargado positivamente que ayuda en la condensación de contaminantes genéticos cargados negativamente. No realice este paso si el ELP está cargado negativamente, ya que el PEI también puede condensar y eliminar el producto ELP.
4. Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g.
5. Transferir el sobrenadante a un limpio redondo de 50 ml tubo de centrífuga inferior y desechar el sedimento.
6. Opcional "bake out" paso: Se incuba la muestra a 60 ° C durante 10 min para desnaturalizar proteínas contaminantes y luego se transfieren a 4 ° C o en hielo hasta que el ELP está completamente resolubilizó. Centrifugar la muestra a 4 º C durante 10 min a 16.000 x g. Transferir el sobrenadante a un clean redondo de 50 ml tubo de centrífuga inferior y desechar el sedimento. NOTA: No realice este paso si un péptido o proteína se fusiona a la ELP y se espera que para desnaturalizar en la condición de calor elevada. Esto puede causar la transición ELP se convierta en calor irreversibles o pueden destruir la actividad de la fracción de condensado.
7. Inducir la transición ELP con la adición de NaCl cristalino (no superior a 3 M). Alternativamente, citrato de sodio (no superior a 0,3 M) se puede utilizar para ELPs que tienen una mayor T _t s o bajos rendimientos. NOTA: La solución debe girar nublado una vez que la sal se haya disuelto, lo que indica la separación de fases de ELP de la solución. ELPs Muy hidrófilos con alta T _t s pueden requerir algún grado de calefacción, en combinación con la adición de sal, para inducir la separación de fases de la ELP en esta inducción preliminar de la transición ELP.
8. Centrifugar a temperatue ambiente (TA) durante 10 minutos a 16.000 xg (spin caliente). NOTA: Un pellet ELP debería se observado, cuyo tamaño depende de la rendimiento de expresión de la ELP. Este pellet ELP puede parecer a primera vista opaca, pero después de enfriarlo aparecerá translúcido y puede ser de color marrón. El pellet ELP será más incoloro como se quitan los ingresos de purificación y contaminantes.
9. Eliminar el sobrenadante y añadir 1-5 ml de tampón deseado a la pastilla. Resuspender el precipitado mediante pipeteado o establecer el tubo para girar a 4 ° C. NOTA: El volumen requerido de tampón dependerá del tamaño de la pastilla ELP, y por lo tanto el rendimiento de la expresión de ELP, donde se debe añadir una cantidad suficiente de tampón para permitir la resolubilización de la pastilla ELP. ELPs con alto contenido de cisteína beneficio de la purificación en agua con 10 mM Tris clorhidrato de (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) a un pH de 7 a eliminar las interacciones disulfuro con proteínas contaminantes. ELPs con alto contenido de carga en beneficio de la purificación a un pH ajustado para neutralizar su carga y reducir los elementosinteracciones ctrostatic con proteínas contaminantes.
10. Transferir la solución ELP resuspendido en alícuotas de 1 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml limpio.
11. Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 xg (centrifugado en frío). Se debería observar un pequeño gránulo de contaminantes insolubles.
12. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el sedimento.

. 3 ELP Purificación: las siguientes rondas de Inverse Transición Ciclismo

1. Inducir la transición ELP con calor y / o la adición de NaCl. Las muestras pueden incubarse en un bloque de calor o en un baño de agua durante 15 min a una temperatura por encima de la T _t. Si, sin embargo, el ELP está fusionado a una proteína (que impide el uso de calor) o si el PDA tiene una alta T _T que no se puede llegar con calor solo, una solución 5 M de NaCl puede ser añadido gota a gota para inducir la transición ELP. NOTA: La solución debe girar nublado, lo que indica la separación de fases del ELP de la solución.
2. Se centrifuga durante 10 min a 16.000 xg (spin caliente). Si se utiliza el calor en el paso 3.1, realizar esta etapa de centrifugación a una temperatura superior que la que se requiere para inducir la transición ELP. Si solo de NaCl se utilizó en el paso 3.1, realizar esta etapa de centrifugación a TA. NOTA: debe observarse un sedimento de ELP.
3. Descartar el sobrenadante, añadir 500-750 l de tampón deseado, y resuspender el precipitado mediante pipeteado o establecer el tubo para girar a 4 ° C.
4. Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 xg (centrifugado en frío). Se debería observar un pequeño gránulo de contaminantes insolubles.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el sedimento.
6. Repita los pasos 3.1 a 3.5 hasta que desaparezca la pelotilla contaminante durante el paso 3.4.

4. Tratamiento Post-purificación (opcional)

1. Si se desea, la muestra se dializa frente a un tampón adecuado para eliminar el exceso de sal de la solución purificada ELP. NOTA: ELPs a liofilizar deben serdializados contra ddH ₂ OO / N a 4 ° C.
2. Si se desea, liofilizar la ELP para el almacenamiento a largo plazo mediante la congelación de la solución a -80 º C durante 30 min antes de la liofilización de O / N. NOTA: La liofilización no se debe utilizar para ELPs con proteínas adjuntas.
3. Si se desea, recuperar el péptido o proteína libre de un péptido o proteína de fusión ELP mediante la eliminación de la etiqueta ELP:
   1. Se digiere el péptido o proteína de fusión con la proteasa ELP biotinilado (según lo recomendado por el proveedor de la proteasa) o con una fusión ELP proteasa correspondiente al sitio de proteasa diseñado genéticamente entre el péptido o proteína y ELP.
   2. Si procede, extraiga la proteasa biotinilado utilizando perlas modificada con estreptavidina (según lo recomendado por el proveedor de la proteasa).
   3. Inducir la transición de la ELP escindido y / o ELP de fusión de la proteasa mediante la adición gota a gota de una solución 5 M de NaCl.
   4. Centrifugar a TA durante 10 min a 16.000 x g. NOTA: debe observarse un sedimento de ELP.
   5. Recoger el sobrenadante y desechar el sedimento de ELP. Se dializa el sobrenadante frente a un tampón deseado o utilizar un filtro centrífugo para llevar a cabo un intercambio de tampón con el fin de eliminar la alta concentración de sal a partir del péptido puro o solución de proteína.
   6. Confirmar la escisión completa de péptido libre o la proteína de la etiqueta ELP por dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

5 Caracterización:. SDS-PAGE

1. Preparar muestras ELP para SDS-PAGE al mezclar 10 l de ELP diluidas en agua con 10 l de tampón de muestra que contenía 2-mercaptoetanol. NOTA: 40 g de ELP es a menudo suficiente para evaluar el tamaño y la pureza del producto ELP.
2. Incubar la muestra a 100 ° C durante 2 min y luego cargar en un gel de poliacrilamida, junto con una escalera de proteína de tamaño adecuado.
3. Correr el gel a 180 V hasta que el colorante se aproxima a la parte inferior del gel (aproximadamente 45 min).
4. Tiña elgel con una solución 0,5 M de CuCl ₂ durante 5 min, mientras se balancea. NOTA: ELPs normalmente no se visualizaron por tinción Coomassie Brilliant Azul, ya que algunas secuencias de ELP no interactúan con este colorante. Azul Brillante de Coomassie interactúa principalmente con los residuos de arginina e interactúa débilmente con otros residuos de histidina-básico y de lisina-y aromáticos residuos de triptófano, tirosina, fenilalanina y ^26. Por lo tanto ELPs y el péptido o proteína ELP fusiones pueden ser teñidas con Azul Brillante de Coomassie sólo si su secuencia primaria incluye un número suficiente de estos residuos específicos.
5. Compruebe que el MW de la banda ELP corresponde a la de la MW teórico esperado a partir del gen ELP y que no hay bandas de contaminantes extraños están presentes. NOTA: Algunos ELPs migran con una aparente MW hasta un 20% más alto que su MW esperado ^{9, 27.}

6 Caracterización:. Desorción por láser asistida por matriz /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS)

1. Preparar una solución ELP en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene ácido trifluoroacético al 0,1% para lograr una concentración de ELP de aproximadamente 25 mM. NOTA: Esta solución debe estar libre de sal, para ELP debe dializa contra _H2O después de la purificación.
2. Preparar una solución de matriz de ácido sinapínico saturado en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene ácido trifluoroacético al 0,1%.
3. Añadir 1 l de la solución ELP a 9 l de la disolución de matriz para lograr una concentración de ELP de aproximadamente 2,5 pmol / l. NOTA: Esta mezcla puede diluirse adicionalmente con una solución de matriz para optimizar la señal de MALDI-TOF.
4. Depósito 1-2 l de mezcla ELP-matriz sobre una placa de MALDI de metal y dejó el lugar se seque por completo.
5. Obtener 5-10 espectros con MALDI-TOF para determinar la masa a carga (m / z) de la ELP y deducir su MW medido.

7. Characterization: La temperatura programada turbidimétrico y dispersión de luz dinámica

1. Determine la camiseta _t del PEL por turbidimetría a temperatura programada:
   1. Preparar una serie de diluciones (por ejemplo, de 5-100 mM) de soluciones de ELP en el tampón deseado.
   2. El uso de un espectrofotómetro UV-Vis de temperatura controlada, medir la densidad óptica (DO) a 350 nm en una gama de temperaturas (por ejemplo, 20-80 ° C) a una velocidad de calentamiento de 1 º C / min. NOTA: Si no se observa incremento en la OD T _t puede superar el límite superior de temperatura del instrumento. La aparente T _t puede ser reducida por la adición de NaCl. Empiece en 1 M de NaCl y aumentar en pasos de 0,5 M hasta que se detecta la transición ELP dentro de un rango de temperatura mensurable.
   3. Verificar la reversibilidad de la transición ELP midiendo la disminución en la OD en el mismo rango de temperatura a una velocidad de enfriamiento de 1 º C / min.
   4. Determine la camiseta _t del homopolímero ELP identificando el punto del perfil de turbidez de inflexión (OD representa gráficamente frente a la temperatura). NOTA: Esta temperatura puede ser fácilmente definido a partir de la derivada de la curva de OD, donde la temperatura correspondiente al máximo de la derivada se define como el T _T. Arquitecturas ELP más complejos se mostrarán los perfiles de turbidez más complicados y deben ser analizados adicionalmente como se describe en la sección 7.2.
2. Caracterización adicional de ELPs que muestran propiedades térmicas más complejos (por ejemplo, copolímeros de bloque doble ELP que la auto-ensamblan para formar micelas esféricas) se logra mediante dispersión de luz dinámica (DLS):
   1. Preparar una solución ELP en el tampón deseado y pasar la muestra a través de un filtro con un tamaño de poro 20-450 nm. NOTA: La elección de filtro de tamaño de poro dependerá de la presencia, el tamaño, y la estabilidad de los ensamblados ELP en solución. Se prefiere el tamaño de poro del filtro más pequeño posible para eliminar contaminantes, tales comopolvo, que disminuyen la calidad de las mediciones DLS. Un filtro de tamaño de poro más grande debe ser utilizada cuando se experimenta una resistencia significativa al pasar a través de una solución ELP pequeños tamaños de poro del filtro.
   2. Medir el radio hidrodinámico (C _H) en un rango de temperaturas que corresponde a una región de interés identificada en el perfil de turbidez. NOTA: unimers ELP tienen típicamente un C _H <10 nm, las asambleas de nanopartículas tienen un R _H ~ 20-100 nm, y los agregados tienen un R _H> 500 nm. Cada aumento en C _H debe corresponder a un aumento en la DO a 350 nm medido por espectrofotometría UV-Vis como una función de la temperatura, que es proporcional al tamaño de la partícula.

Resultados

Aquí se describen los resultados representativos para la purificación y caracterización de un homopolímero de ELP y un copolímero de dos bloques ELP. Después de 24 h de expresión en E. coli, las células se recogieron por centrifugación y se lisaron por sonicación. Típicamente, un cambio sutil en color se produce después de la sonicación, confirmando la lisis celular suficiente (Figura 1A). Después de la adición de PEI, componentes genómicos y los restos celulares se recogieron por centrifugación, la separación de una gran pastilla de contaminantes insolubles de la ELP soluble en el sobrenadante (Figura 1B). ELP se purifica aún más por el ciclismo transición inversa (ITC), que explota el comportamiento LCST para separar la ELP de contaminantes solubles e insolubles (Figura 2) ^28. La transición de fase de la ELP se desencadena por la adición de calor y / o sal. Resultados de centrifugación en la formación de un sedimento en la parte inferior del tubo que consta de un ELPnd algunos contaminantes insolubles (Figura 1C). Este paso-denomina un spin-descartes calientes contaminantes solubles en el sobrenadante mientras que el pellet ELP se retiene y se resuspendió en tampón frío. El resolubilizado ELP se centrifugó de nuevo a 4 ° C. Este paso-denomina un resfriado spin-descartes la pelotilla de contaminantes insolubles, mientras se mantiene el sobrenadante que contiene ELP soluble. Repitiendo el ciclo de alternancia de giros calientes y frías aumenta la pureza de la ELP, pero a costa de disminuir ligeramente el rendimiento, como se pierde ELP residual durante cada ronda CCI en tubos de centrífuga y en puntas de pipeta.

Purificación con éxito de los PEL y el péptido o proteína fusiones ELP se confirmó por SDS-PAGE. Pequeñas alícuotas tomadas durante todo el proceso de purificación demuestran la purificación progresiva de ELP de la E. lisado coli. ELP se sobreexpresa en el crudo E. coli lisado y contaminantes disminuyen ingenioh sucesivas rondas de ITC (Figura 3). ELP purificada aparece como una única banda cerca de la PM teórico predicho.

El ELP T _t se caracteriza por turbidimetría a temperatura programada. El perfil de la turbidez de un homopolímero ELP exhibe una fuerte aumento en la DO a 350 nm (aproximadamente 2,0 unidades por encima de la línea de base para una concentración de ELP de 25 M) (Figura 4). Enfriamiento exploraciones de turbidez confirman la naturaleza reversible de la transición PEL como la DO regresa a la línea base cuando la temperatura se reduce por debajo de la T _T (Figura 4B). Copolímeros de dos bloques ELP exhiben un perfil de turbidez más complejo, en comparación con el homopolímero ELPs. El OD aumenta típicamente primero en 0,1-0,5 unidades por encima de la línea de base, después de lo cual los OD aumenta bruscamente a 2,0 unidades por encima de la línea de base (Figura 5A). DLS mediciones proporcionan información sobre el cambio en C _H con respecto a la temperatura, CO rroborating la información obtenida a partir del perfil de turbidez (Figura 5B).

Figura 1. Purificación preliminar ELP. Después de 24 horas de expresión, E. coli células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PBS.) Las células A se lisaron por sonicación, que se acompaña de un cambio sutil en el color de tal manera que el lisado se oscurece después de la sonicación. B) Después de la adición de PEI para condensar contaminantes de ADN, el lisado se centrifugó y un gran residuo de restos insolubles se separa de ELP soluble en el sobrenadante. C) La transición ELP se induce con la adición de calor y / o formas de sal y un pellet de centrifugación ELP translúcido.ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Ciclismo transición inversa. ELP se purifica por medio de su comportamiento LCST de los contaminantes solubles e insolubles. A partir de la ELP-rica lisado (1) la transición ELP se induce con la adición de calor y / o sal y el ELP se separa por centrifugación (spin caliente) (2). El sedimento de ELP se retiene (3a), mientras que el sobrenadante que contiene contaminantes solubles se descarta (3b). El ELP se resuspende en tampón frío (4) y se centrifugó de nuevo a 4 º C (centrifugado en frío) (5). El sedimento que contiene los contaminantes insolubles se descarta (6a), mientras que se conserva el sobrenadante que contiene ELP soluble en (6b). Los ciclos de alternancia giros fríos y calientes se repiten hasta que se alcanza la pureza deseada, tal como se determina conSDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Análisis de SDS-PAGE de productos de purificación de ELP. Purificación con éxito de un ELP se confirmó por SDS-PAGE. Overexpressed ELP es evidente en el crudo E. lisado coli después de la sonicación (2). Después de la adición de PEI y de la centrifugación el ELP solubles se retiene en gran medida en el sobrenadante (3), aunque algunos ELP se pierde en el sedimento descartado de contaminantes insolubles (4). El sobrenadante después de la primera vuelta caliente contiene niveles significativos de contaminantes solubles (5). El sobrenadante después de la primera vuelta fría indica una buena separación de ELP de contaminantes insolubles (6). Ciclos adicionales de calor (7) y cviejo gira (8) eliminar los contaminantes solubles e insolubles residuales, respectivamente, hasta que esté caliente (9) y centrifugado en frío (10) sobrenadantes finales no presentan bandas de contaminantes extraños, lo que confirma la pureza satisfactoria del producto ELP. Este homopolímero ELP, con una secuencia de SKGPG-(VGVPG) _80-Y, tiene un peso molecular esperado de 33,37 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Caracterización de ELP homopolímero por turbidimetría a temperatura programada. El ELP T _t se determina mediante el control de la DO a 350 nm, mientras que el aumento de la temperatura a una velocidad de 1 º C / min. Un) homopolímeros ELP exhiben una sola aumento agudo en OD que defInes su T _T a una concentración dada. B) La reversibilidad de la transición ELP se verifica mediante el control de la DO a 350 nm de una solución de 25 μ M, mientras que la disminución de la temperatura, donde la reversibilidad se confirma por el retorno de la DO a la línea de base. Este homopolímero ELP tiene la secuencia SKGPG-(VGVPG) _80-Y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Caracterización de ELP copolímero de dos bloques por turbidimetría a temperatura programada y la dispersión de luz dinámica. ELPs que sufren de auto-ensamblaje nano-escala, como ELP copolímeros de dos bloques que la auto-ensamblan para formar micelas esféricas, presentan perfiles de turbidez más complejos. B) DLS mediciones confirman el comportamiento inferido a partir del perfil de turbidez para un solución a 25 M, proporcionando información sobre el cambio en C _H con respecto a la temperatura. Aquí el Unimer ELP tiene un R _H ~ 8 nm y la micela tiene un R _H ~ 25 nm. Este copolímero dibloque ELP tiene la secuencia GCGWPG-(VGVPG) ₆₀ - (AGVPGGGVPG) _30-PGGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

ELPs ofrecen un medio económico y de cromatografía-libre de la purificación mediante la explotación de su comportamiento de fase de estímulo sensible. Este enfoque se aprovecha de el comportamiento LCST de PEL y péptido o proteína ELP fusiones para eliminar ambos contaminantes solubles e insolubles después de la expresión de ELPs codificados genéticamente en E. coli. Esta facilidad de purificación puede ser utilizado para producir ELPs para una variedad de aplicaciones, o se puede explotar para la purificación de péptidos o proteínas recombinantes en la que el ELP puede actuar como una etiqueta de purificación que se puede eliminar con el procesamiento post-purificación.

Purificación ELP implica pasos preliminares para la lisis de la E. coli y eliminar los residuos celulares genómico e insoluble del lisado de cultivo bruto (Figura 1), seguido de la eliminación de los contaminantes solubles e insolubles residuales por el CCI (Figura 2). La centrifugación después de la activación de la transición ELP por la adiciónción de calor o sal se separa el PEL de los contaminantes solubles en el sobrenadante, en un paso denomina un giro caliente. Después de resolubilizing la ELP, la solución se centrifugó de nuevo a una temperatura por debajo de la T _t para eliminar el sedimento contaminante insoluble, en un paso denomina un giro frío. Alterna giros calientes y frías mejora la pureza de la solución ELP con cada ciclo, en un pequeño coste para producir. Rendimientos de purificación varían dependiendo de la ELP T _t, longitud y péptidos o proteínas fusionadas. Por lo general, este protocolo se obtiene 100 mg de ELP purificado por litro de E. cultivo de E. coli, sin embargo los rendimientos puede alcanzar hasta 500 mg / L. La pureza final del producto ELP se confirmó por SDS-PAGE (Figura 3). El MW de la purificado ELP debe coincidir estrechamente con el MW teórico codificada por el gen ELP. Sin embargo, algunos ELPs migran en SDS-PAGE con un peso molecular aparente de hasta 20% más alto que su MW esperado ^{9, 27.} Un análisis más preciso de la ELPMW se puede lograr mediante MALDI-TOF-MS, que también puede proporcionar información adicional sobre la pureza del producto ELP junto con las técnicas analíticas ortogonales tales como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Después de la purificación, el ELP T _t se mide por turbidimetría a temperatura programada. Esta técnica monitoriza la OD de una solución ELP mientras que la temperatura se incrementa. El T _t es dependiente de la concentración por lo que es recomendable para caracterizar una serie de concentración correspondiente a la aplicación prevista del ELP. Para ELP homopolímeros del perfil de turbidez exhibe un único incremento brusco que corresponde a la transición ELP de Unimer agregados a escala micrométrica (Figura 4A). El T _t se define como la temperatura correspondiente al punto de inflexión en el perfil de turbidez, determinado con precisión como el máximo de la primera derivada de la OD con respecto a la temperatura. La reversibilidad de laTransición de fase ELP se confirmó por una disminución en la OD a la línea base como se baja la temperatura por debajo de la T _T (Figura 4B). El perfil de la turbiedad con el aumento y la disminución de rampas de temperatura será diferente en magnitud y la cinética debido a la sedimentación de coacervados ELP e histéresis variable del ELP resolubilización. Péptido o proteína ELP fusiones exhiben de manera similar comportamiento LCST de esta manera, donde el péptido o proteína fusionada a la ELP afecta a la T _t. Para la proteína ELP fusiona la transición es reversible por debajo de la temperatura de fusión de la proteína. Mientras turbidimetría a temperatura programada es un método excelente para la caracterización térmica inicial de productos ELP, técnicas alternativas, tales como calorimetría diferencial de barrido (DSC), también se puede utilizar para medir la ELP T _t.

ELPs con más complejas arquitecturas de exposiciones más complicados comportamientos térmicos que también se pueden caracterizar por la temperatura progra-turbidimetría nmed. Copolímeros de dos bloques ELP, por ejemplo, exhiben un perfil de turbidez característica correspondiente a su temperatura de auto-ensamblaje-desencadenado en micelas esféricas a su temperatura crítica de formación de micelas. Para este tipo de copolímeros de dos bloques ELP la OD típicamente primero aumenta 0,1-0,5 unidades por encima de la línea de base que indican la transición de la unimers a las micelas, después de que un fuerte aumento de la OD (hasta 2,0 unidades por encima de la línea de base) a una temperatura más alta indica la formación de escala micrométrica agregados (Figura 5a). Información adicional sobre los auto-ensambladas estructuras ELP temperatura provocado se obtiene con DLS, una técnica que mide la R _H de las asambleas de ELP en solución. Los cambios en C _H están de acuerdo estrechamente con los cambios en la DO medidos con turbidimetría (Figura 5B). Unimers ELP exhiben típicamente un C _H <10 nm, mientras que conjuntos de nanopartículas presentan un C _H ~ 20-100 nm y agregados exhibir un C _H > 500 nm. Información adicional sobre las nanopartículas ELP auto-ensambladas, como el número de agregación y la morfología, se puede obtener mediante dispersión de luz estática o la microscopía electrónica de transmisión criogénica ^{17, 23, 29.}

Debido a la capacidad de ajuste de las propiedades térmicas de ELP, una gama de T _t s se obtiene mediante varios diseños ELP. Es importante tener en cuenta que la inherente T _t influirá la optimización del protocolo de purificación para cada ELP, donde extremadamente alta o baja T _t s requerirá más modificaciones a este protocolo estándar. ELPs con temperaturas extremadamente altas de transición pueden ser inadecuados para la purificación con este enfoque. Si el diseño de nuevos ELPs y péptidos o proteínas ELP fusiones puede comprometer la respuesta térmica de la ELP, una simple etiqueta de histidina puede ser incluido para la purificación alternativa mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado. Además,características de la secuencia ELP pueden requerir la modificación de este protocolo si el resto de huéspedes está cargada. La manipulación de la solución tampón de pH se puede utilizar como un método para cambiar la carga total de la ELP en un esfuerzo para eliminar interacciones electrostáticas con los contaminantes ^17. Además, este protocolo es apropiado para la circunstancia especial de las fusiones ELP con péptidos y proteínas cuando se toman las medidas apropiadas para garantizar que el proceso de purificación no perturba la actividad de la fracción fundida. Notas de todo el protocolo sobre las modificaciones sirven para dirigir la purificación de ELPs que pueden presentar estos retos con respecto a T _t, cargo o preocupaciones de fusión.

La purificación de ELPs por medio de su comportamiento LCST presenta un enfoque sencillo y cromatografía de libre para purificar la mayoría de los PEL y péptido o proteína ELP fusiones expresado en E. coli. El protocolo que aquí se resume permite la purificación of ELPs en un solo día utilizando el equipo que es común a la mayoría de los laboratorios de biología. La facilidad de purificación de ELPs y sus fusiones será, esperamos, fomentar una diversidad cada vez mayor de diseños ELP para nuevas aplicaciones en la ciencia de materiales, la biotecnología y la medicina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pET-24a(+) pET-25b(+)	Novagen	69749-3 69753-3	T7-lac vectores de expresión con resistencia a kanamicina (pET-24) o ampicilina (pET-25).
Células competentes Ultra BL21 (DE3)	Edge BioSystems	45363	Competentes E. coli para la expresión de proteínas recombinantes.
Los medios de crecimiento de polvo seco Terrific Broth (TB)	MO BIO Laboratories	12105	se reconstituyen en DI H2O y se esterilizan en autoclave antes de su uso.
Isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	IPTG se reconstituye en DI H2O, se filtra estérilmente y se añade a los cultivos para inducir una expresión mejorada.
Comprimido de solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Calbiochem	524650	Estos comprimidos de PBS, cuando se disuelven en 1 L de DI H2O, producen un tampón de fosfato de 10 mM con 140 mM de NaCl y 3 mM de KCl con un pH de 7,4 a 25 °C.
Solución de polietileno (PEI) (~50% p/v)	MP Biomedicals	195444	PEI se prepara como una solución al 10% (p/v) en H2O desionizado.
Tubos de centrífuga de alta velocidad Nalgene Oak Ridge, 50 ml	Thermo Scientific	3138-0050	Estos tubos de fondo redondo soportan una centrifugación de alta velocidad de 30-50 ml.
Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491	Se prepara una solución madre de TCEP-HCl a 100 mM en DI H2O y se ajusta a pH 7,0. En el caso de los ELP con un alto contenido de cisteína, la solución madre de este agente reductor se añade al pellet de ELP para alcanzar los 10 mM en H2O.
Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% gel de poliacrilamida de gradiente lineal, 10 pocillos, 30 μ l	Bio-Rad Laboratories	161-1105	Estos geles de gradiente lineal ofrecen una buena visualización de ELP con un rango de MW.
Cloruro cúprico dihidratado (CuCl2· 2H2O)	Fisher Scientific	C454-500	Una solución filtrada de 0,5 M está preparada para la tinción negativa de geles de poliacrilamida Tris-HCl.
Filtro de jeringa Anotop 10: 0.02 μ m 0,1 μ m 0,2 y mu; m	Whatman	6809-1002 6809-1012 6809-1022	Estos filtros de jeringa de 10 mm de diámetro permiten la preparación de pequeños volúmenes para mediciones DLS.
Filtro Millex-HV: 0.45 μ m	EMD Millipore	SLHVX13NK	Estos filtros de jeringa de 13 mm de diámetro permiten la preparación de pequeños volúmenes de soluciones con grandes conjuntos de nanopartículas para mediciones de DLS.