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Artículo de método

Recuperación Quirúrgica, aislamiento y

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DOI:

10.3791/51597

⸱

30 de abril de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

En este artículo

Resumen

Para aplicaciones futuras como un parche para reparar desgarros parciales del ligamento cruzado anterior (ACL), las células derivadas de ACL humana fueron aisladas de tejido obtenido durante los procedimientos reconstructivos, expandidas in vitro y cultivados en los andamios de ingeniería tisular. A continuación, se realizó la adhesión celular y la morfología para confirmar la biocompatibilidad de la superficie del andamio.

Resumen

La lesión del ligamento cruzado anterior es un problema comúnmente encontrado en los individuos activos. Incluso los desgarros parciales de este intra-articular del ligamento de la rodilla conducir a deficiencias biomecánicas que la función y la estabilidad deterioran. Las opciones actuales para el tratamiento de los desgarros del LCA parciales van desde no quirúrgico, el tratamiento conservador con múltiples opciones quirúrgicas, tales como: la modificación térmica, la reparación de un solo paquete, la reconstrucción completa, y la reconstrucción de la parte dañada del ligamento nativo. Pocos estudios, si los hay, han demostrado un método único para la gestión de ser siempre superior, y en muchos casos los pacientes seguir demostrando la inestabilidad persistente y otras comorbilidades.

El objetivo de este estudio es identificar una fuente de células para la utilización potencial en el desarrollo de un parche de ingeniería tisular que podría implementarse en la reparación de un LCA desgarrado parcialmente. Un nuevo protocolo fue desarrollado para la expansión de las células derivadas de patients sometidos a la reconstrucción del LCA. Para aislar las células, tejido HACL picada obtenida durante la reconstrucción del ACL se digirió en una solución de colagenasa. La expansión se realizó usando medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Las células entonces se almacenaron a -80 º C o en nitrógeno líquido en un medio de congelación que consiste de DMSO, de FBS y el medio de expansión. Después de la descongelación, las células HACL derivados fueron luego sembradas en un andamio de ingeniería tisular, de PLAGA (ácido láctico-co-glicólico Poli) y el control de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS). Después de 7 días, SEM se realizó para comparar la adhesión celular a la PLAGA contra el TCPS de control. La morfología celular se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia. SEM (microscopio electrónico de barrido) micrografías demostraron que las células crecieron y se adhirieron sobre ambas superficies de PLAGA y TCPS y fueron confluentes sobre las superficies enteras por día 7. La tinción de inmunofluorescencia mostró morfológica normal, no estresadoAL patrones en ambas superficies. Esta técnica es prometedor para aplicaciones en la regeneración y la reconstrucción de ACL.

Introducción

El ligamento cruzado anterior (LCA) es un ligamento intraarticular comúnmente lesionado de la rodilla. Aproximadamente 200.000 (LCA) se reportan anualmente en los Estados Unidos. Más del 75% de los pacientes que sufren una lesión del LCA opt para la cirugía reconstructiva ortopédica 1,2,3,4. La intervención quirúrgica está indicada a menudo debido a un inherentemente pobre potencial curativo 3. La reconstrucción del ACL se realiza típicamente por medio de un autoinjerto o aloinjerto de tendón. Autoinjerto y aloinjerto representan el estándar de oro para la reconstrucción, ya que cuentan con altas tasas de éxito, y la reparación con sutura primaria, la otra opción de tratamiento, ha mostrado tasas de fracaso de hasta el 94% 5,6,7.

Desgarros parciales del ligamento cruzado anterior representan el 10% y el 28% de todas las rupturas del LCA 8. En un estudio prospectivo, Noyes et al. Estima que el 50% de los pacientes con desgarros parciales que afectan a más de la mitad de la ACL ACL progresó hasta completar insuficiencia después notratamiento quirúrgico 9. Otros estudios reportan persistente inestabilidad y disminución de la función con menos de 30% de los pacientes capaces de volver a su pre-lesión 9,10,11,12,13 nivel de actividad. Las opciones de tratamiento son limitadas e incluyen modalidades conservadoras, la contracción térmica de permanecer ACL, o la reconstrucción del LCA. Recientemente, ha habido un creciente interés en la reparación primaria aumentada. Estas técnicas utilizan productos biológicos para mejorar la reparación de sutura primarios 14. La investigación reciente ha intentado cosechar-mesenquimales como HACL deriva células madre para eludir limitaciones de injerto, 31,32 pero la validez y la eficacia de estas células es todavía desconocido. La fuente de células ideal para aplicaciones de ingeniería de tejidos parece ser no mesechymal HACL deriva células de fibroblastos.

La investigación actual se centra en la identificación de un material de matriz adecuado y fuente de células para el andamiaje de ingeniería. Es un procedimiento estándar para una rotura de ligamentos que ser descartado como doresiduos rgical durante la cirugía de reconstrucción, sin embargo, este ligamento dañado puede ser una fuente de calidad para la adquisición de células necesarias para desarrollar y mejorar un tejido ideal de ingeniería reemplazo ACL. Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo para la expansión in vitro de estas células derivadas HACL cosechados. El uso de una matriz 2D diseñado infundido con células HACL derivados, hemos diseñado un parche que podrían aumentar la reparación del LCA parcial y fortalecer los ligamentos desgarrados.

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Protocolo

1. Recuperación Quirúrgica

Nota: La aprobación IRB se obtuvo para recoger el muñón ACL durante la cirugía de reconstrucción del LCA. Exención IRB fue dado como el muñón ACL utilizados han sido generalmente descartada como desecho quirúrgico. 20 pacientes se utilizaron para recoger el muñón ACL.

  1. Administrar anestesia general y antibióticos preoperatorios según el protocolo de la institución para el paciente.
  2. Aplicar el torniquete e inflar 100 mg por encima de la presión arterial sistólica.
  3. Situar el paciente en posición supina. Haga una incisión anterolateral horizontal con la rodilla en flexión de 30 a 45 ° para un portal de 5 mm e insertar el trocar artroscópica y la cámara en la bolsa suprarrotuliano a 30 °.
  4. Lleve a cabo una artroscopia diagnóstica de rutina.
  5. Escriba una muesca y desbridar la sinovial membranosa sobre el LCA roto.
  6. Use una máquina de afeitar 4,5 mm y ablador para identificar el muñón ACL.
  7. Utilice un pico de pato recta amarga para recoger múltiples especimens del muñón ACL restante.
  8. Mantener la muestra en solución salina normal en un recipiente estéril.
  9. Enviar las muestras a la patología para la decodificación y la entrega final a las instalaciones del laboratorio.
  10. Recuperar paciente y realizar el cuidado postoperatorio según el protocolo de la institución.

2. Digestión de los tejidos y HACL Aislamiento

  1. Transferir el tejido del LCA humano recibido de la patología a una placa de Petri con solución salina estéril / PBS (tampón fosfato salino).
  2. Picar el tejido con tijeras estériles en 1-2 mm de 3 piezas y lavar el tejido picado con solución salina al menos 3 veces.
  3. Se digiere el tejido picado con 0,4% de colagenasa en DMEM/F-12 (50/50, 1x) medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina durante 4-6 horas a 37 ° C.
  4. Centrifugar las células a 1000 xg durante 5 minutos y luego volver a suspender las células en el medio.
  5. Lavar las células con el medio durante 2-3 veces y luego seed / cultura en matraces T-25 durante 2-3 días.

3. Expansión Celular, congelación y descongelación

  1. Utilice un microscopio de luz para visualizar las células cultivadas durante 2-3 días en un matraz T-25.
  2. Mantener las células a 37 ° C en la DMEM/F-12 (50/50, 1x) medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
    Nota: Cambiar los medios de comunicación cuando las células muestran la adhesión y la morfología normal. Utilice un microscopio de luz para observar las células.
  3. Lavar las células confluentes con PBS en el día 7 (~ 1,3 X 10 6 células / frasco). Añadir tripsina (0,5 g / L) e incubar las células a 37 ° C durante 5 min. Añadir los medios de comunicación a las células en suspensión para neutralizar la tripsina. Divida la mezcla de células de medios entre tres matraces T-25.
  4. Lavar las células confluentes con PBS, añadir tripsina (0,5 g / L), y volver a suspender en medio de congelación que contiene DMSO, de FBS y el medio completo (medio DMEM/F-12 + 10% de FBS + 1% P / S) en el proporción 01:02:07.
  5. Tiendalos viales criogénicos a -80 ° C si se utilizan las células dentro de un mes, y en nitrógeno líquido si las células se almacenarán durante un período prolongado.
  6. Descongele los viales en un 37 ° C baño de agua para su reutilización.
    Nota: Típicamente 90-95% de células sobreviven.

4. Fabricación de ingeniería tisular 2-D poli láctico-co-glicólico (PLAGA) Andamios

  1. Disolver 1 g de PLAGA en 12 ml de diclorometano en un vial de centelleo de 20 ml y agitar la solución durante 8 horas a una velocidad constante (800 rpm).
    Nota: Descripción detallada en Gupta et al 15.
  2. Transferir la solución disuelta a una placa de Petri de vidrio forrado con papel de protección fluorado.
  3. Coloque la placa de Petri bajo una campana de vacío durante 30 min. Agregar la placa de Petri a -20 ° C durante la noche y luego a temperatura ambiente. Colocar las cápsulas de Petri en liofilizador para asegurar la completa evaporación del disolvente para obtener películas delgadas de polímero.
  4. Coloque la fi polímerolms en un desecador durante 24 horas.
  5. Cortar las películas de polímero en 12 discos circulares mm de diámetro y almacenarlos en un desecador hasta que se necesite.

5. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)

  1. Lavar las células (50000 células / disco) se sembraron en la TCPS control y el andamio PLAGA con PBS 7 días después de la siembra.
  2. Use 1,5% glutaraldehído en tampón cacodilato 0,1 M para fijar las células y 2,5% OSO 4 en 0,1 M de tampón cacodilato de post-fijación.
  3. Lavar las células fijadas con tampón cacodilato 0,1 M. Secar las células fijadas usando deshidratación serie de etanol (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 15 min cada uno, y más seco en hexametildisilazano (HMDS) durante la noche.
  4. Purgar la cámara del sistema de recubrimiento por pulverización catódica SEM con válvula de botón y levante la placa superior.
  5. Coloque las muestras secas en la cámara. Baje la placa superior.
  6. Cambie la perilla de control a la bomba para comenzar a evacuar la cámara.
  7. Válvula de escape abierto argón. Esperarpara el vacío caiga a 0,05 mbar.
  8. Cubrir las muestras secas con una capa delgada (0,13 nm) de oro / paladio.
  9. Devuelva la válvula de escape de argón a su posición cerrada.
  10. Cambie la perilla de control en off.
  11. Purgar la cámara con válvula de botón y levante la placa superior.
  12. Retire las muestras y almacenarlas en un desecador durante 24 horas.
  13. Tenga en cuenta las muestras en un microscopio electrónico de barrido.

6. Inmunofluorescencia La tinción

  1. Lavar las células (50000 células / disco) se sembraron en la TCPS control y el andamio PLAGA con PBS 7 días después de la siembra.
  2. Fijar las células utilizando etanol al 70% (en frío) durante 10 min.
  3. Se incuban las células fijadas a temperatura ambiente con 1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS que tenía un 0,05% de Triton X-100 durante 20 min.
  4. Sumergir las muestras en 1% de Tween a temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Añadir el anticuerpo anti-β-actina monoclonal de ratón (1:400) y se incuban las células overnight a 4 ° C.
  6. Lavar las células con 0,05% de Tween. Añadir anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón F (ab ') 2 fragmento de IgG conjugado con una sonda de fluorescencia, 1:400) a las células y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
  7. Se lavan las células con PBS. Teñir las células con tinción nuclear y montar utilizando 80% de glicerol.
  8. Observar las células bajo un microscopio confocal.

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Resultados

El modelo de trabajo para la recuperación quirúrgica, la digestión del tejido y aislamiento de la humana ligamento cruzado anterior (HACL) células derivadas se muestra en la Figura 1. Las células que migraron a partir de los explantes y se adhirieron a los matraces T-25. Estas células se cultivaron durante 3 días y luego se visualizaron bajo un microscopio de luz (Figura 2). Una monocapa confluente se obtuvo por día 7. La presencia de células sanas, viables indica la recuperación exitos...

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Discusión

El objetivo principal de este estudio andamio hACL/2D era utilizar las células obtenidas en un parche para aumentar la reparación primaria del LCA se desgarra parciales. El tratamiento no quirúrgico de las rupturas del LCA parciales puede incluir un breve período de inmovilización, refuerzos, un programa de rehabilitación progresiva, y las evaluaciones de seguimiento regulares 13,16,17. Sin embargo, muchos estudios demuestran que el tratamiento conservador en los atletas se ha asociado con malos resultados y ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el fondo inicial y el departamento de cirugía de la beca de investigación de la Universidad del Sur de Illinois, Facultad de Medicina; y la beca de la Fundación Memorial Medical.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de PetriFisher Scientific08-757-103C
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP3994
ColagenasaGibco17018-029Tienda en 4 ° C
DMEM/F-12Cellgro10-092-CVTienda en 4 °C. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Suero fetal bovino (FBS)Gibco10082Tienda en -80 ° C
Penicilina/EstreptomicinaLonza17-602E Tiendaen 4 °
C Tubos de centrífuga- 15 mlCorning430790
T-25 frascosBD Falcon3013
Mezcla de tripsina-VerseneLonza17-161EAlmacenar en 4 °C. Calentar en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
DMSOFisher ScientificBP231-100Líquido combustible. Puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias.
Viales criogénicosCorning430489
PLAGAPurac Biomaterials PurasorbPLG8523Tienda en -80 ° C
Discos TCPSFisher Scientific12-545-82
DiclorometanoFisher ScientificAC36423-0010Posible riesgo de cáncer. Almacenar en un lugar seco y fresco.
Papel BytacSaint gobin Performance Plastics1420652
Frasco de centelleoFisher Scientific03-339-21G
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma AldrichA7906Tienda en 4 ° C
TweenFisher ScientificBP337-500
anticuerpo anti-β-actina para ratones (1° Ab)Tienda Sigma AldrichA5441en -20 ° Anticuerpo C
cabra-anti-ratón (2° Ab)Cell Signaling4408Store en -20 ° C
Tinte HoechstSigma Aldrich14530Tienda en -20 ° C
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlutaraldehídoFisher ScientificBP2547-1Tóxico por inhalación y si se ingiere. Provoca quemaduras por todas las vías de exposición.
HexametildisilazanoFisher ScientificAC43085-1000Líquido y vapor inflamables. Provoca quemaduras por todas las vías de exposición.
Tijeras estérilesMcKesson25-716
CentrífugaEppendorf5804R
Microscopioóptico OlympusCK40
Baño de aguaThermo scientific2845
VortexLabnetVX-200
Placas de Petri de vidriofisher ScientificS31473
Acu-PunchAcuderm Inc.P1225Acu-Punch se utilizó para cortar discos de 12 mm Tampón de
cacodilatoSigma Aldrich97068Líquido inflamable, cancerígeno e irritante.
Tetraóxido de osmioSigma Aldrich201030Altamente tóxico
Triton X-100Sigma AldrichT8787Nocivo si se ingiere
EtanolDecon Labs2705Mantener alejado del calor, chispas, llamas y otras formas de ignición.
Anestesia general/regionalAmphastar farmacéuticos1% Lidocaína, 0,25% Bupivacaína,Agentes anestésicos para inducción y mantenimiento
AntibióticosHospira0409-0805-01Ancef 1 g i.v.
Trocar de artroscopiaSmith and Nephew
Cámara de artroscopiaSmith and Nephew
Pinza artroscópica y bitter AfeitadoraArthrex
de 4,5 mmArthrex
Tornillos de acero inoxidableArthrex
por pulverización catódicaPolaronE5400
Tornillos de interferencia Recubrimiento

Referencias

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