Se presenta un método para medir la velocidad del flujo sanguíneo microcirculatorio en metástasis de cáncer pulmonar de la superficie pleural en ratas de forma automatizada, utilizando microscopía intravital pulmonar a tórax cerrado. Este modelo tiene potencial para ser utilizado como una herramienta generalizada para realizar investigaciones fisiológicas sobre metástasis pulmonares en roedores.
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Artículo de método
Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas
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Resumen
Resumen
Debido a que el pulmón es un órgano objetivo importante de la enfermedad metastásica, los modelos animales para estudiar la fisiología de las metástasis pulmonares son de gran importancia. Sin embargo, hasta la fecha existen muy pocos métodos para investigar las metástasis pulmonares de forma dinámica a nivel microcirculatorio, debido a la dificultad de acceder al pulmón con un microscopio. Aquí, se presenta un método de microscopía intravital para obtener imágenes funcionales y cuantificar la microcirculación de metástasis pulmonares superficiales en ratas, utilizando una ventana pulmonar de tórax cerrado y un análisis automatizado de la velocidad y dirección del flujo sanguíneo. Se demuestra la utilidad de este método para medir los aumentos en la velocidad del flujo sanguíneo en respuesta a la intervención farmacológica y para obtener imágenes de la conocida vasculatura tortuosa de los tumores sólidos. Esta es la primera demostración de microscopía intravital en metástasis pulmonares en un modelo de tórax cerrado. Debido a su minimización de la invasión, así como a su relativa facilidad y practicidad, esta tecnología tiene el potencial de experimentar un uso generalizado en los laboratorios que se especializan en la investigación de tumores pulmonares.
Introducción
El pulmón es uno de los órganos diana más importantes de la enfermedad metastásica, y debido a que esta afección es difícil de tratar con éxito con quimioterapia y radioterapia, la cura sigue siendo rara1,2. Las características fisiopatológicas y microcirculatorias específicas de los tumores sólidos primarios y metastásicos, como la hipoxia microrregional, la limitación de la difusión y la vasculatura tumoral ineficiente, contribuyen en gran medida a su resistencia al tratamiento anticanceroso3,4. Debido a la escala microscópica y a la naturaleza dinámica de parámetros como el flujo sanguíneo microvascular, la microscopía intravital del tumor en el animal vivo se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante en el campo5. Si bien los modelos de microscopía intravital se han aplicado a tumores en diferentes sitios de órganos, incluido el pulmón metastásico dentro de una caja torácica abierta, aún no se ha desarrollado un protocolo para la investigación de metástasis pulmonares en un ambiente de tórax cerrado fisiológicamente preservado6,7. Tal esfuerzo se ve particularmente obstaculizado por la necesidad de acceder quirúrgicamente a la caja torácica sin afectar la función general del pulmón7-9. Recientemente, se introdujo un método para obtener imágenes del flujo sanguíneo microcirculatorio pulmonar en un entorno de tórax cerrado en ratas vivas, utilizando microscopía intravital de fluorescencia10. Este protocolo permite la cuantificación sistemática de la velocidad del flujo sanguíneo de los glóbulos rojos inyectados y marcados con fluorescencia, utilizando análisis computarizados, manteniendo al animal fisiológicamente estable y preservando la integridad del pulmón11. En el presente estudio, se muestra cómo esta tecnología puede ser modificada para visualizar y cuantificar el flujo sanguíneo microcirculatorio en metástasis pulmonares inoculadas por venas de cola en la superficie pleural en la rata inmunocomprometida. Este modelo también es el primero en estudiar los tumores pulmonares metastásicos en un entorno de microscopía intravital de tórax cerrado.
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos relacionados con los animales descritos en este protocolo han sido previamente aprobado por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Duke (DUIACUC).
Cultivo Celular y Inyección 1. Cáncer
- Cultivar las células cancerígenas metastásicas marcados con fluorescencia (por ejemplo, células de cáncer de mama MDAMB231-GFP humanos, regalo del doctor Patricia Steeg, NCI, y las células del sarcoma de ratón marcado con YFP, regalo del doctor David Kirsch, Duke University Medical Center, Departamento de Oncología Radioterápica) en medio de cultivo adecuado (por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptavidina) a 37 ° C hasta aproximadamente 90% de confluencia.
- Tripsinizar las células, lavar 2 veces con PBS, contar, y luego inyectarlos en las venas de la cola de 10 semanas de edad ratas hembra desnudos anestesiados con isoflurano a los 5 millones de células por animal, usando una jeringa con una aguja 27 G. Anesthes nivel quirúrgicosia es verificada por la falta de reacción ante pizca dedo del pie.
2. El seguimiento de las metástasis Usando MicroCT
- Examinar las ratas una vez a la semana utilizando un micro-CT / micro-irradiador, para detectar la presencia de metástasis por encima de aproximadamente 2 mm de diámetro de diámetro. El micro-CT es comisionado como se describió anteriormente 12.
- Ratas sujetas a 3% anestesia con isoflurano antes de la imagen. Confirmar profunda anestesia por pellizco dedo del pie.
- Después de inicio de la anestesia, las ratas transferir rápidamente a la base de formación de imágenes en la cámara de formación de imágenes y conectarse a través de una nariz de cono a una mezcla de isoflurano al aire a 2,5-3%. Ajustar la posición de la rata en la cuna de una manera que el tórax se coloca en el haz de fotones del escáner MicroCT, usando los controles de posición externos y delimitador de láser en la base de formación de imágenes. Asegúrese de que la puerta de la cámara de formación de imágenes está cerrada, para proteger el investigador de los rayos gamma.
- Controlar la posición del animal usando de nuevola cámara de vídeo en color. Realizar una baja resolución prueba de imagen de TC, y utilizar la imagen resultante para ajustar el campo de visión a las dimensiones xyz de la cavidad torácica.
- Imagen del tórax rata utilizando un filtro Al 2 mm a 40 kVp, 2,5 mA, y 0.008 voxel a las 7 FPS y devolver el animal a su jaula. Obtención de imágenes de un animal debe tener no más de 15 o 20 min. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
- Confirme metástasis por la aparición de objetos relativamente de radio-opaco que no puede ser explicado por los vasos sanguíneos intratorácicos (Figura 1)
Cirugía 3. Cámara Ventana
- Anestesia, signos vitales y cateterización de la vena de la cola
- Seleccione animales con presencia de enfermedad metastásica. Inyectar animal con un d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia nivel quirúrgico por pizca dedo del pie antes de proceder.
Nota: Los protocolos de anestesia deben ser adaptadas a la respectiva configuración experimental. Pentobarbital fue elegido aquí como un anestésico de acción prolongada, con el fin de inducir la anestesia profunda para largos procedimientos, al tiempo que ofrece la opción de re-facile de dosificación. Sin embargo, la pérdida de animales para la sobredosificación es un problema común con anestesia con pentobarbital. Otra opción que conserva reflejos autonómicos en un grado mayor que pentobarbital es la ketamina en combinación con sedantes tales como xilazina o medetomidina, que sin embargo permite sólo para un único ciclo de re-dosificación. - Afeitado animales en el lado del cuerpo que tiene la enfermedad metastásica, y en la zona del cuello, usando una maquinilla. Limpie todo el pelo suelto que queda de la piel. Después se elimina el pelo suelto, aplique ungüento veterinario para los ojos, para evitar que se sequen.
NOTA: ratas desnudas Athymic pueden tener el pelo residual que REQUIeliminación res antes de proceder con los procedimientos quirúrgicos. Es muy importante eliminar todo el pelo a fondo, ya que puede interferir con los procedimientos quirúrgicos y de formación de imágenes. - Fijar el animal en posición supina sobre una placa de metal que se coloca en una almohadilla de calefacción 37 ° C el agua recirculada. Las extremidades delanteras y traseras son fijos en el plato con cinta.
NOTA: Es útil para controlar y registrar los signos vitales, tales como la frecuencia cardíaca y la oxigenación de la sangre arterial mediante el uso de un oxímetro de pulso, a través de procedimientos quirúrgicos y experimentales.
- Seleccione animales con presencia de enfermedad metastásica. Inyectar animal con un d intraperitonealose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirme anestesia nivel quirúrgico por pizca dedo del pie antes de proceder.
- La intubación traqueal
- Para colocar un catéter para la ventilación del animal, primero hacer una incisión transversal de la piel cervical, seguido por la separación mediana de la musculatura longitudinal ventral a la tráquea.
- Utilice acción repetida-apertura al cierre con un afilados fórceps para crear un paso para la sutura a través de la cara dorsal de la tráquea.
- Hacer una pequeña incisión en la tráquea en tél lado ventral, no más de semi-circular, aproximadamente entre el segundo y el tercer anillo traqueal. Deja un parte suficientemente larga de la tráquea expuesta en la superficie dorsal, para permitir la fijación del catéter traqueal.
- Inserte un 2,5 a 3,0 mm "Y" cánula traqueal en la tráquea, y apriete con una sutura monofilamento 4-0. Asegúrese de que la cánula está conectado a un ventilador ciclado de presión con una botella conectada al conducto de caducidad que se llena de 6 cm de agua, para mantener la presión pulmonar positivo. Corriente de llenado de gas debe ser de 100% de oxígeno, a menos experimentalmente deseado lo contrario.
- Insertar un catéter con una aguja G 25-27, y llena con solución salina heparinizada en una de las venas de la cola de la rata, y fijar en su lugar con cinta adhesiva.
NOTA: Asegúrese de que la permeabilidad del catéter vena de la cola durante todo el procedimiento mediante inyecciones repetidas de una pequeña cantidad de solución salina heparinizada en la vena de la cola. Además, la intubación oro-traqueal, es decir, la orientación de un traquealtubo a través de la boca del animal anestesiado y más allá de la laringe dentro de la tráquea, es una posible alternativa al procedimiento de traqueotomía que se describe aquí. Sin embargo, este método requiere entrenamiento y experiencia especial, para evitar daños a la tráquea, y también para evitar la canulación accidental del esófago.
- Aplicación de ventana pulmonar
- Quitar la piel desde el lado del pecho donde se encuentra la enfermedad metastásica, mediante la creación de una incisión y, a continuación, separando la piel mediante disección roma.
Nota: La piel puede ser extirpado y se retira posterior al desprendimiento - Proceder mediante la disección de las dos capas de la superposición de la musculatura (pectoral, serrato, y dorsal ancho), pero dejando los músculos intercostales intacto. Crear una perforación en la cavidad del pecho de aproximadamente 1,5 cm de diámetro, mediante la eliminación de porciones de típicamente dos costillas adyacentes. Lo ideal es ubicar la perforación de la región de la sexta y séptima ribs.
- Osteotomía:
- Para minimizar el sangrado y el daño a la superficie del pulmón, sujeta fuertemente la costilla que se corta con un fórceps quirúrgico dentadas durante el corte. Usando tijeras quirúrgicas, corte el lado medial de la primera costilla, en un ángulo de aproximadamente 45 °, dejando el lado puntiagudo del hueso de la costilla restante apuntando hacia el exterior.
- Posteriormente, cortar el lado lateral de la costilla de una manera similar, dejando de nuevo el lado puntiagudo del hueso de la costilla apunta hacia afuera, para evitar daños en la superficie del pulmón.
- Repita el procedimiento para la costilla adyacente, a continuación, cortar los músculos intercostales y retire la pieza extirpada. Durante este procedimiento, mantener la presión pulmonar de una manera que la interacción mecánica entre la superficie del pulmón y la caja torácica se reduce al mínimo. Para ello, la regulación apropiada de presión inspiración en el ventilador.
- La inserción de la ventana:
- Inserte una ventana de pulmón por encargo, que consta de un cubreobjetos que esunido a una toma de Plexiglas (Figura 1B). Coloque la ventana a la toma por encolado, o mediante la aplicación de una cantidad muy pequeña de grasa de vacío. Inserte la ventana de manera que las metástasis de superficie se encuentran cerca del centro de la ventana. Si es necesario, ajustar el agujero insertado para llevar la micrometástasis en el centro de la ventana mediante la ampliación del agujero ligeramente hacia el lado respectivo.
NOTA: La enfermedad metastásica en la superficie pleural se puede identificar como puntos blancos claramente reconocibles o áreas dentro de las partes sanas de color rosa de lo contrario-a-salmón de la superficie pulmonar que aparecen predominantemente a lo largo de las fisuras. Mientras micrometástasis pueden ocurrir en otras áreas del exterior pleural, las líneas celulares investigadas casi siempre muestran la superficie micrometástasis en el área perforada, una vez que la enfermedad metastásica puede ser detectada radiológicamente. - Después de insertar el enchufe en la perforación, y la creación de un contacto directo con la pleura visceral de la lung, la sutura de los bordes del marco de la ventana en el músculo intercostal circundante, utilizando 4,0 sutura de monofilamento (Figura 1C). Utilice un ligero aumento de la presión de inspiración en el ventilador para ayudar a aire residual escapar y para crear un sello.
Nota: La tasa de respiración de ratas puede variar mucho, dependiendo del estado de la anestesia, el estado de excitación o la ansiedad, la concentración de oxígeno en el aire inspirado (FiO 2), etc. Es recomendable ajustar la tasa de respiración de 70 a 90 latidos por minuto. La presión de inspiración se debe ajustar con precaución y no se puede ajustar a más de aprox. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), para evitar daños en la superficie del pulmón.
- Inserte una ventana de pulmón por encargo, que consta de un cubreobjetos que esunido a una toma de Plexiglas (Figura 1B). Coloque la ventana a la toma por encolado, o mediante la aplicación de una cantidad muy pequeña de grasa de vacío. Inserte la ventana de manera que las metástasis de superficie se encuentran cerca del centro de la ventana. Si es necesario, ajustar el agujero insertado para llevar la micrometástasis en el centro de la ventana mediante la ampliación del agujero ligeramente hacia el lado respectivo.
- Coloque el animal en un limitador de diseño personalizado que está diseñado para eliminar la dirección Z movimiento (Figura 1D) en una placa de acero que se coloca en un termostática (eléctrica) manta de calefacción, bajo un microscopio de fluorescencia. Controlar el cuerpo del animalla temperatura usando un termistor rectal. Ajuste los tornillos de la inmovilización de los animales, y la presión de inspiración en el ventilador para lograr un control óptimo de movimiento lateral.
Nota: la respiración natural en mamíferos involucra a los tres sentidos de circulación pulmonar y la extensión del pecho:, dorso-ventral, y cráneo-caudal bilateral. Con el fin de preservar el movimiento de la respiración natural tanto como sea posible, es importante para reducir al mínimo la compresión de la dirección Z en la medida necesaria. Debido a la restricción-Z dimensiones tiene el potencial de introducir artefactos que puedan afectar el flujo de sangre y otros parámetros, es aconsejable mantener condiciones constantes durante la serie de mediciones repetidas en el mismo animal.
- Quitar la piel desde el lado del pecho donde se encuentra la enfermedad metastásica, mediante la creación de una incisión y, a continuación, separando la piel mediante disección roma.
4. Imaging y medición de flujo sanguíneo en la microcirculación
- Recoger las células rojas de la sangre a través de punción cardíaca y etiquetarlos con DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocianina), como se describió anteriormente 10.
- Inyectar 300 l de glóbulos rojos marcados en la vena de la cola de la rata antes de realizar la cirugía de la cámara de ventana, para evitar efectos de adhesión pase primero a la ventana de cristal. Eliminar cualquier burbuja de aire en la jeringa o un catéter, como la introducción de aire en la vena inhibirá cualquier inyecciones adicionales.
- Image flujo de sangre con una cámara CCD microscopio a -40 ° C chip de temperatura de enfriamiento, y aproximadamente 100X resolución global (es decir, con un objetivo de microscopio 10X, 10X y pre-cámara ocular). Utilice conjuntos de filtros Rodamina / TRITC estándar (450-490 nm de excitación, emisión> 515 nm). Registre la resolución real de las secuencias de imágenes resultantes velocidad de fotogramas y pixel. Consigue al menos 200 (idealmente alrededor de 300) imágenes por pila, para garantizar el éxito del análisis de la velocidad del flujo.
- Reponer la pérdida de líquidos en el animal mediante la inyección de aproximadamente 1 ml de solución salina IP cada hr.
NOTA: Los valores experimentales que implican una intervención, por ejemplo,un fármaco que modifica la velocidad del flujo sanguíneo en una metástasis del cáncer pulmonar, requiere mediciones repetidas de la velocidad del flujo de sangre en el cáncer metastásico pulmonar. Para estos experimentos prolongados, es importante para reponer el animal con suficiente líquido. - La eutanasia a los animales por infusión de 3 ml de 3N KCl en la vena de la cola
- Evaluar las pilas de imágenes utilizando un publicada, disponible públicamente algoritmo informático basado en Matlab que va a crear el flujo de escala de grises de velocidad y mapas de color codificado para todo el flujo de sangre rastros 10,11. Posteriormente evaluar las imágenes en escala de grises resultantes por el uso de software de análisis de imagen comercial o de acceso público, tales como la imagen J, después de thresholding de valores que indican ningún movimiento de las células de la sangre, es decir, sin vasculatura activo.
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Resultados
La vasculatura en tumores sólidos se sabe que difieren significativamente de suministro normal de sangre, mostrando un mayor grado de tortuosidad y mayores distancias intervasculares 13. En consecuencia, las pistas del flujo sanguíneo en metástasis de cáncer de mama y el sarcoma pulmonar experimental tienen formas irregulares y grandes lagunas intervasculares (Figura 2A, dos paneles inferiores) cuando se compara con la microcirculación pulmonar normal (Figura 2A, panel superi...
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Discusión
Se presenta un modelo que es factible cambios de imagen en el flujo sanguíneo en la microcirculación y otros procesos dinámicos en las metástasis pulmonares de ratas, usando microscopía intravital y análisis de flujo de sangre computacional. Si bien existen otros métodos para llevar a cabo la microscopía en pulmones expuestos en ribcages abiertos de los roedores, este modelo también es la primera imagen de metástasis pulmonares a través de una perforación de la pared del pecho en un entorno de pecho cerrado. Usando este...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Se agradece el consejo científico de los Dres. Timothy McMahon y Siqing Shan. Los presentadores agradecen a los Dres. David Kirsch y Patricia Steeg por el generoso regalo de las células de sarcoma de ratón y MDAMB-231 metastásicos marcadas con fluorescencia, respectivamente. Este trabajo fue financiado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa de los Estados Unidos (DARPA, por sus siglas en inglés) con el número de premio N66001-10-C-2134, y en parte por el Departamento de Oncología Radioterápica del Centro Médico de la Universidad de Duke.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratas desnudas atímicas | Charles | River Código de cepa 316 | Ratas desnudas atímicas hembras de 10 semanas de edad |
| micro-CT/micro-Irradiador | Rayos X de precisión Inc. | Xrad 225Cx | Utilice MicroCT para detectar metástasis |
| DiI (1,1 = -dioctadecil-3,3,3 = ,3 = perclorato de tetrametil-indocarbocianina) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mezcle 100 μl de glóbulos rojos empaquetados con 100 ul de 0,5 mg/ml de DiI en etanol de 200 grados, 2 ml de solución de dextrosa al 5% en agua y llene hasta un volumen final de 10 ml con solución salina |
| Ventilador para roedores | Kent Scientific | TOPO Ventilador | para animales pequeñosEl dispositivo es importante para mantener la presión pulmonar positiva después de la aplicación de neumotórax |
| Microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop vertical | Microscopio Zeiss | Axioskop | para imágenes intravitales |
| Cámara CCD Andor Cámara CCD | Andor | iXonEM 885 | para imágenes en vivo del flujo sanguíneo |
| Oxímetro de pulso | StarrLife | MouseOx | Oxímetro de pulso |
| Microscopio | de fluorescenciaMicroscopio de fluorescencia Zeiss | Axioskop |
Referencias
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
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