Summary
Pålideligheden af resultater i metabolomics eksperimenter afhænger af effektiviteten og reproducerbarheden af prøveforberedelse. Beskrevet er en streng og grundig metode, der gør det muligt for udvinding af metabolitter fra biologiske væsker med mulighed for efterfølgende at analysere op til tusindvis af forbindelser, eller kun de sammensatte klasser af interesse.
Abstract
Metabolomics er en spirende felt, som muliggør profilering af prøver fra levende organismer for at opnå indsigt i biologiske processer. Et vigtigt aspekt af metabolomics er prøveforberedelse hvorved inkonsistente teknikker generere upålidelige resultater. Denne teknik omfatter proteinudfældning, væske-væske-ekstraktion, og fastfase-ekstraktion som et middel til at fraktionere metabolitter i fire forskellige klasser. Forbedret berigelse af lav hyppighed molekyler med en deraf følgende stigning i følsomhed er opnået, og i sidste ende resulterer i mere sikker identifikation af molekyler. Denne teknik er blevet anvendt til plasma, bronkoalveolærvaskevæsken og cerebrospinalvæske prøver med mængder så lave som 50 pi. Prøverne kan bruges til flere efterfølgende anvendelser; for eksempel, kan pelleten som følge af proteinudfældning lagres til senere analyse. Supernatanten fra trin undergår væske-væske-ekstraktion under anvendelse afvand og stærk organisk opløsningsmiddel for at adskille de hydrofile og hydrofobe forbindelser. Når fraktioneret, kan det hydrofile lag behandles til senere analyse eller kasseres, hvis ikke nødvendig. Den hydrofobe fraktion behandles yderligere med en række af opløsningsmidler i tre fastfase-ekstraktionstrin til at adskille den i fedtsyrer, neutrale lipider og phospholipider. Dette giver teknikeren mulighed for at vælge, hvilken klasse af forbindelser foretrækkes til analyse. Det hjælper også mere pålidelig metabolit identifikation da nogle viden om kemiske klasse eksisterer.
Introduction
Biologiske reaktioner generere metabolitter som slutprodukter af cellulære processer. Metabolomics er en samling af alle de forbindelser, der findes i en organisme som et resultat af disse processer. Det giver et billede af fysiologi af celler og afspejler en organismes reaktion på eksterne eller interne stimuli 1, 2. Sådanne stimuli kan være miljømæssige, toksikologiske, farmakologiske, kosten, hormonale, eller relateret til sygdommen. Mange Metabolomic programmer har og er i øjeblikket ved at blive undersøgt af forskere og omfatter biomarkør opdagelse 3, ernæring undersøgelser 4, fødevarevidenskab 5, og drug test 6. Uanset ansøgningen, har brug for variationer i data, kontaminering og tilstedeværelsen af falske positiver skal reduceres eller fjernes fortrinsvis. I biomarkør opdagelse eller i tilfælde af at bestemme forskelle mellem en kontrol og en sygdomsgruppe, eller efterforske virkninger af narkotika om emner, en biologisk fLUID er valgt på grundlag af de spørgsmål bliver stillet, og de typer af metabolitter, der undersøges 7. For eksempel vil, hvis studere de umiddelbare virkninger af inhaleret lægemiddel til lungerne hos astmatikere, og dernæst at udforske metabolitter i bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) prøver før og efter indgivelse være præferentielle. At sikre, at observerede forskelle skyldes faktiske biologiske variation snarere end forkert prøveforberedelse teknik, standardiseret og sammenhængende laboratorieprotokol er afgørende 8. Prøve oplysninger skal dokumenteres omhyggeligt for at sikre, at variabler som biologisk væske, dyr stamme, sampling tid, emne alder, køn, for at nævne et par stykker, er alle betragtes og indregnet i undersøgelsen 9. Ud over at reducere muligheden for forurening eller falske positiver, anbefales det, at opløsningsmidler blanke og blanketterne skal analyseres 10.
Til denne protokol, udtrykket "metabolitter "blive anvendt til at henvise til de faktiske forbindelser identificeret. Ved hjælp af software fra leverandører, er en indledende spidsdetektering algoritme bruges til at detektere massespektrale toppe. Disse toppe er afstemt baseret på masse og ladning (m / z)-forholdet og opholdstid. En anden algoritme anvendes derefter til at kombinere flere funktioner i en enkelt forbindelse. Dette omfatter funktioner såsom natrium, kalium eller ammonium-addukter i positiv ioniseringsmode og chlorid i negativ ion-mode. Yderligere muligheder i software omfatter funktioner såsom dimerer og andre addukter. Brug af glucose som et eksempel, med toppe ved 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4) + og 203,05261 m / z (M + Na), der ville være tre toppe svarende til den samme sammensatte anvendelse af den første algoritme. Men når den anden algoritme, som er baseret på molekylformel, anvendes disse tre addukter blevet grupperet sammen resulterer i en forbindelse.
Metabolitter kan forårsage interferens i Samples på grund af kompleksiteten af forbindelser til stede. Tilstedeværelsen af tusindvis af metabolitter i en prøve årsager signalerer undertrykkelse især af de lavere overflod metabolitter. Prøve oprydning for at fjerne forstyrrende proteiner og efterfølgende adskillelse i flere fraktioner reducerer kompleksiteten af prøven og derved forbedre topadskillelse, øge opløsning og reducere metabolit coelution. Derfor er prøve oprydning og forbedret adskillelse af forbindelserne kræves. Det er blevet vist, at proteinudfældning alene, selv med brug af forskellige polaritet opløsningsmidler kan ikke løse dette problem 11, 12. Men ved at kombinere en stærk organisk opløsningsmiddel såsom MTBE med efterfølgende fraktionering trin metabolitten dækningen øges. Yang et al. 12 rapporteret en stigning i metabolitter fra 1.851 eller 2.073 med methanol eller methanol-ethanol udfældning alene henholdsvis 3.806 metabolitter ved kombineret MTBE solventekstraktionefterfulgt af fast-fase-ekstraktion (SPE) trin. Reducerede metabolit overlapning forbedret topadskillelse og øget metabolit overflod blev observeret med denne metode.
Forurening fra ikke-metabolitter, såsom polymerer, kan resultere fra prøvetagning, opløsningsmidler eller instrument støj, og kan resultere i signal undertrykkelse af potentielt signifikante metabolitter. Det anbefales, at teknikeren (r), og dem, der indsamler prøverne forud for prøveforberedelse konsekvent bruger det samme mærke, type og størrelse af prøvetagningsrør hætteglas, pipettespidser og andre rør, der bruges under indsamling og forberedelse af prøver. Dette gør det muligt for data analytiker at have fuld tillid til, at de observerede ændringer er reelle og ikke på grund af baggrunden forskelle fra andre kilder. Behandlingens effektivitet, kan variationer mellem sygdoms-og kontrolgrupper, eller nogen andre metaboliske analyser derefter undersøges med øget tillid.
Den method diskuteret her fokuserer på kombineret prøveforberedelsesmetoder 13-15, som kan anvendes til plasma, BALF eller cerebrospinalvæske (CSF) prøver til ikke-målrettet metabolomiske profilering til væskekromatografi-massespektrometri (LCMS) baseret analyse. Både væskekromatografi (LC) og ultra-væskechromatografi (UPLC) separationsteknikker kan kobles til MS efter denne procedure. Mange forskere udfører Metabolomic undersøgelser bruge enten et protein fældning og / eller en væske-væske-ekstraktion teknik 16, 17. I vores undersøgelser resulterede dette i færre metabolitter blive opdaget. Den her 12 beskrevne metode muliggør påvisning og identifikation af et større antal metabolitter, der dækker en bredere vifte af metabolomet. Denne stigning skyldes den højere renhed af prøverne og reducerede matrix virkninger ved forudgående separation af metabolitten klasser.
En indledende protEin nedbør trin udføres med kold methanol (MeOH) til at fjerne protein fra prøven. Væske-væske-ekstraktion (LLE) under anvendelse af methyl-tert-butylether (MTBE) og vand anvendes til at adskille de hydrofile og hydrofobe forbindelser. Derefter fast-fase-ekstraktion (SPE) udføres på det hydrofobe lag for at adskille de hydrofobe forbindelser i tre klasser - fedtsyrer, neutrale lipider og phospholipider. De hydrofobe fraktioner rekonstitueret i 100% methanol, mens den hydrofile fraktion rekonstitueres i 5% acetonitril i vand. Det fast-fase ekstraktion (SPE) trin giver en ekstra grad af tillid til resultaterne ved at reducere antallet af co-eluerende forbindelser, som ellers ville være til stede havde en adskillelse skridt ikke udført.
Protocol
1.. Indledende overvejelser, Udarbejdelse af instrumenter og standarder
- Bruger altid glas til opbevaring (glas podningsrør, glas Autosamplerglas) eller overføre (glaspipetter) lipider og organiske opløsningsmidler.
- Minimer eksponering af alle lipid prøver og standarder til luften. Seal polytetrafluorethylen (PFTE) hætter stramt for at undgå luft eksponering og fordampning. Umiddelbart resuspender tørrede lipider i næste opløsningsmiddel eller holde dem i en lind strøm af nitrogen.
- Brug 100 ul prøve. I tilfælde, hvor mere (eller mindre) prøven er tilgængelig, justere volumen tilsvarende. Men under lipid fraktionering på NH2 SPE kolonne, udtalte volumener skal forblive som angivet.
- Tænd centrifuge og sat til 0 ° C før start til forberedelse af prøven.
- Denne teknik bruger mange flygtige opløsningsmidler så holde alle opløsningsmidler udjævnet under forberedelsen.
- Forbered to typer standarder pr anbefaling.
- Forbered en negativ kontrol bestående af spidse-in standarder alle ved konstant koncentration. Dette er tilsat i alle prøver samt en samleprøve, der bruges som en batch QC (spiked samleprøve bruges til at overvåge prøveforberedelse reproducerbarhed på forskellige dage) og instrument QC (spiked samleprøver tidligere fremstillede, sub-alikvoteres, og bruges til at overvåge instrument betingelser / udsving under analyse og på forskellige dage).
- Forbered positive kontroller på 1x, 2x og 4x standard spikes. De positive kontroller føjes til alle prøver samt en poolet plasma prøve og anvendes som forbindelser til både prøveforberedelse trin og instrumentel analyse trin at analysere og identificere de gange ændring forskelle i data analyse for at sikre kvalitetskontrol, at alle aspekter af forberedelse og instrumentel analyse blev udført korrekt.
- Opbevar standarder ved -20 ° C og opbevar prøver ved -80 ° C. Visse interne stativstandarder, som er tilbøjelige til nedbrydning efter langtidsopbevaring bør opbevares ved -80 ° C.
- Denne procedure kræver brug af farlige, brændbare eller flygtige opløsningsmidler, såsom MTBE. Udfør alle trin i et stinkskab.
2. Standarder for intern
- Vælg interne standarder (ISTD) baseret på individuelle projekter og deres specifikke eksperimenterende design. For biofluids såsom plasma, BALF eller urin, isotopmærkede ISTDs som er af samme karakter som dem, der findes biologisk i disse prøver ville være ideelt. Disse ville indbefatte, men er ikke begrænset til, aminosyrer, hormoner eller lipider. For vegetabilske metabolomisk prøver kunne mærkede standarder såsom flavonoider, carotenoider eller anvendes. Det samme gælder andre Metabolomic undersøgelser, hvor undersøgeren skal vælge en intern standard, som er repræsentativ for den prøvetype blive analyseret.
- Sørg for, at den valgte ISTD dækker en bred vifte af kromatogrammet; for eksempel hvis than erhvervelse tid er 20 min, standarder, der eluerer hver 5 min kunne anvendes.
- Opret hydrofile stamopløsninger på 2 mg / ml ved anvendelse af forskellige isotopmærkede standarder og / eller andre polære forbindelser, der er eksogent til den prøve, der analyseres. Fra hver stamopløsning oprette en opløsning i 1:1 methanol: vand med alle standarder til en slutkoncentration på 25 ug / ml kreatinin-D 3, 100 ug / ml lysin-D 4, og 200 ug / ml valin-D 8 .
- Opret hydrofobe stamopløsninger hjælp af en række isotopmærkede standarder og / eller andre ikke-polære forbindelser, der er eksogent til prøven analyseres; Omgående koncentrationer af 17:0 fedtsyre (4 mg / ml), 19:1 fedtsyre (4 mg / ml), 17:0 ceramid (2 mg / ml), 17:0 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), og testosteron-D2 (1 mg / ml). Fra hver bestand, skal du oprette én løsning i 1:1 chloroform: methanol med alle standarder til en endelig koncentration på 50ug / ml 17:00 ceramid, 100 ug / ml 15:00 PC, 100 ug / ml testosteron-D2, 200 ug / ml 17:00 fedtsyre, 200 ug / ml 19:01 fedtsyre og 200 ug / ml 17:00 PE i standard mix.
- Test graden af ionisering af hver standard forud for tid under anvendelse af mindst fem forskellige koncentrationer for hver standard for at bestemme detektionsgrænse og linearitet af instrumentet, for disse forbindelser. Koncentrationen af stamopløsningen for hver enkelt standard vil variere afhængigt af eksperimentelle design, og koncentrationen af hver standard i den kombinerede spidse standard kan variere fra 20 pg / ml til 2 mg / ml, afhængigt af, hvor godt de ionisere.
- Opret et spyd blanding af positive kontroller og tilføje dem til prøverne ved 1x, 2x eller 4x koncentrationsniveauer kvantitativt at overvåge styrken af prøveforberedelse og nøjagtigheden af de instrumentelle data. Endelig koncentration af positive kontroller kanvære: 2 mg / ml D-glucose, 100 ug / ml alanin-D 3, 200 ug / ml methylmalonsyre-D3, 20 ug / ml triglycerid-D 5, og / eller andre hydrofobe og hydrofile standarder. Juster faste koncentrationer baseret på følsomheden af MS og HPLC-instrumenter, der anvendes til analyse.
3.. Protein Precipitation
- Tø prøver til RT og spike 10 ul ISTD til hver prøve som beskrevet nedenfor.
- Spike 10 ul af både hydrofile og hydrofobe standardløsninger (oprettet fra bestanden i trin 2.3 og 2.4) til hver prøve. Juster faste koncentrationer, som er nødvendige baseret på følsomheden af MS og HPLC-instrumenter anvendt til analyse
- Spike 10 ul af enten 1x, 2x eller 4x positiv kontrolopløsning (oprettet fra bestanden i trin 2.6) til hver prøve. Juster standard koncentrationer, som er nødvendige baseret på følsomheden af MS og HPLC instrumentering anvendt til analyse
- Vortex hver prøve i 10 sek forud for proteinet udfældningstrinnet
- Tilsæt 400 pi iskold methanol (lagres ved -20 ° C) til hver prøve.
- Vortex for 10 sek pr rør.
- Der centrifugeres ved 0 ° C i 15 minutter ved 18.000 x g.
- Overfør alle supernatanten til et nyt glas kultur rør, og derefter tørre under N2.
- Hvis analysere fraktionen proteinpellet, gå videre til trin 3,8-3,11. Hvis det ikke er at analysere proteinpellet, springe til afsnit 4.
Bemærk: Den proteinpellet kan indeholde forbindelser med høj hydrofobicitet, som ville være nyttigt, når der udføres undersøgelser narkotika 18, mad analyser involverer hydrofobe flavonoider 19 eller Metabolomic undersøgelser vedrørende sygdomme, hvor meget hydrofobe forbindelser ophobes, såsom neuronale ceroid-lipofuscinoses 20 og lysosomale lipid opbevaring sygdomme 21. - Der tilsættes 1 ml MTBE til than hvid (eller offwhite) proteinpellet, vortex for 30 sec per rør, centrifugeres ved 0 ° C i 15 minutter ved 18.000 x g. Dekanteres MTBE lag til et nyt glas kultur rør.
Dette er et afgørende skridt, da fejl her drastisk vil påvirke resultaterne (se figur 5 i repræsentative resultater).- Konsekvent aspirere den samme mængde af MTBE for alle prøver, idet størrelsen af pillen vil variere blandt prøverne. Derfor, hvis kun 900 ul kan dekanteres for prøven med den mindste mængde af supernatanten, så dekanteres 900 pi for alle prøver.
- Gentag trin 3.9, og kombinere det organiske lag til det samme glas kultur rør forberedt i trin 3.7.
- Tørre prøver ved N2-strøm og resuspender i 200 pi 1:1 chloroform: methanol. Vortex kortvarigt.
- Overførsel til et centrifugerør. Der centrifugeres ved 0 ° C i 15 minutter ved 18.000 xg, og derefter overføre supernatanten til autosampler skruelåg hætteglas af glaspipetter.
4.. Væske-væske ekstraktion
- Ved hjælp af et glas pipette tilsættes 3 ml MTBE til den tørrede methanol resterende (fra afsnit 3, trin 6), vortex 30 sek, tilsættes 750 ul vand, derefter vortex 10 sek pr rør.
- Spin ~ 200 xg i 10 minutter i en centrifuge ved stuetemperatur.
- Aspirer 2,5 ml MTBE lag (uden at få vand) og overføres til et rent glas kultur rør.
Bemærk: Dette er et afgørende skridt, da forskellene her vil påvirke resultatet. 2,5 ml MTBE bør omhyggeligt dekanteret fra det øverste lag, fordi det giver en fast mængde, der skal dekanteres uden pipettering det vandige lag nedenfor. Hvis rumfanget af prøven ved starten af eksperimentet var mindre end de angivne 100 pi til denne metode, skalere mængden af MTBE proportionalt afspejle dette udgangspunkt prøvevolumen. - Tilsæt 3 ml MTBE til det resterende vand del af prøven, og vortex 10 sek pr rør.
- Spin ~ 200xg i 10 minutter i centrifugen ved stuetemperatur.
- Aspirer 3 ml MTBE (uden at få vand) og kombinere med MTBE rør.
- Koncentrer den resterende vandige lag af tørring under N2.
- Re-suspendere rest i 100 ul vand.
- Tilsæt 400 pi iskold MeOH til glasset kultur rør, vortex kortvarigt, og derefter overføre til mikrocentrifugerør.
- Efterlad ved -80 ° C i 20-30 minutter. Spin ved 0 ° C i 15 minutter ved 18.000 x g.
Bemærk: Det anbefales at placere hele prøven rack i en -80 ° C fryseren, da dette vil gøre det muligt for enhver resterende protein udfældes i methanol. Hvis en -80 ° C fryseren ikke er tilgængelig, andre muligheder er: opbevaring ved -20 ° C, hvilket placerer prøverne på tøris, eller holde dem i en isspand. Det er vigtigt at konsekvent opbevare prøverne i et koldt miljø, og ved den samme temperatur for at tillade udfældning. - Aspirer 450 pi supernatant og overførsel tilet rent mikrocentrifugerør. Tørre helt i et vakuum centrifugal-koncentrator ved højst 45 ° C. (Tager omkring 1-2 timer).
- Resuspender tørret supernatant i 200 pi af 5% acetonitril / vand. Vortex kortvarigt. Fryse ved -80 ° C.
5. Fastfaseekstraktion
- Tør MTBE fraktion under nitrogen ved 35 ° C med en god strøm af nitrogen (tager omkring 10-15 min.)
- Når helt tørre, stoppe strømmen af kvælstof og hurtigt resuspender i 1 ml chloroform (CHCI3) ved hjælp af et glas pipette. Vortex kortvarigt.
Bemærk: Opløsningsmidler, såsom CHCl3 har lav viskositet. Under pipettering, lav overfladespænding forårsager solvent tab fra pipette. Det anbefales, at pipettespidsen skal prewet mindst to gange for at der opnås ligevægt mellem opløsningsmidlet blive pipetteret og rummet i pipetten. En sprøjte gastæt kan også anvendes hvis de er tilgængelige. - Oprette en SPE vakuummanifold og NH2
- Varm prøver til RT og altid holde suspenderet i henhold til en lind strøm af N2. Opvarmning til RT vil tillade lipid resuspension og nitrogen vil forhindre oxidation og polymerisation af lipider.
- Vask og tilstand SPE indsats 2x med 400 ul hexan. Kassér affald og erstatte med nye kollektion glasrør.
- Læg prøven SPE-søjle, indsamle strømme gennem i glasrør.
- Med glaspipette tilsættes 1 ml 2:1 CHCl3: IPA, indsamle flyde igennem i samme glasrør (dette er neutral fraktion).
- Tør neutral fraktion under N2 for at minimere oxidation (tager omkring 10-15 min.)
- Med glaspipette tilsættes 1 ml af 5% eddikesyre i diethylether, indsamle strømme gennem nye glasrør (dette er Fatty Acid fraktion).
- Tør fedtsyrefraktion under N2 for at minimere oxidation (tager omkring 10-15 min.)
- Brug plastik tips til at tilføje 800 &# 181; l methanol til SPE-patronen, og indsamle gennemstrømning på 15 ml plastik koniske rør (dette er Phospholipidfraktionen).
- Overførsel Phospholipidfraktionen til 1,5 ml centrifugerør. Tør prøverne med et vakuum centrifugal-koncentrator ved 45 ° C (tager ca 1-1,5 time).
- Resuspendere hver af prøverne fra de tre fraktioner i 200 pi 100% methanol, vortex, og overførsel til Autosamplerglas skruelåg til opbevaring.
6.. Prøveopbevaring Betingelser
- Opbevar alle prøver ved -80 ° C indtil den er klar til instrument analyse.
Bemærk: Ekstraherede prøver rekonstitueres i et organisk opløsningsmiddel kan opbevares ved -20 ° C. Men dette kan ikke anbefales som mulige metabolitter af interesse vil nedbrydes ved denne temperatur. Flydende nitrogen opbevaring er heller ikke anbefales som efterforskere har rapporteret problemer forurening, der er nødvendige særlige opbevaring hætteglas, og der er mangel på homogenitet i kammeret causynge store temperaturudsving. - Hvis prøvevolumener er små (<100 ul), brug indsætter i glassene for at forhindre fordampning af opløsningsmidlet i headspace under opbevaring.
- Undgå fryse-tø af prøverne. Optø prøverne kun én gang, lige før instrument analyse. Gentagne fryse-tøs resultere i prøven nedbrydning.
7.. Væskekromatografi Betingelser
- Brug en C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 um) analytisk søjle med en C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 um) forkolonne at analysere hydrofobe fraktion.
- Indstil autosampleren temperaturen til 4 ° C, søjletemperaturen til 60 ° C, injektionsvolumen til 2 pi og strømningshastigheden til 0,25 ml / min.
- Brug 0,1% myresyre i vand mobil fase A, og 0,1% myresyre i isopropanol: acetonitril: vand (60:36:4) for mobile fase B.
- Kør følgende gradienteluering profil: Start ent 30% B, og en stigning på 70% B fra 0 til 1 min, derefter stige til 100% B fra 1 til 15 min og hold i 5 min, efterfulgt af 5 min 10% B vask og 5 minutter efter løb.
- Brug en HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 um) analytisk søjle med en forkolonne at analysere den hydrofile fraktion.
- Indstil autosampleren temperaturen til 4 ° C, søjletemperaturen til 20 ° C, injektionsvolumen til 2 pi og strømningshastigheden til 0,5 ml / min.
- Brug 50% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat, pH 5,8 til mobil fase A, og 90% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat pH 5,8 til mobil fase B.
- Kør følgende gradient elueringsprofil: Start ved 100% B fra 0 til 2 min, derefter falde til 50% B fra 2 til 15 min, efterfulgt af 5 min 0% B vask og 10 minutter efter løb.
Representative Results
Hele prøveforberedelse teknik blev udført som beskrevet ovenfor, og de vigtigste og / eller mest relevante aspekter er præsenteret nedenfor. Hydrofile og hydrofobe interne standarder blev tilsat til pooled plasma prøver at udføre direkte sammenligninger af de interne standarder og endogene metabolit mængderne ved hjælp af forskellige udvindingsmetoder. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) data blev analyseret ved hjælp af kvalitativ og kvantitativ software og resulterede i fremragende genvinding og separation af både de endogene forbindelser og interne standarder. Figur 1 viser effektiviteten af MTBE-SPE metode til at udvinde både lipid standarder (A) og endogene forbindelser (B).
Samlet set blev bedre ekstraktion og dækningen af de metabolitter, opnåede i forhold til andre metoder såsom methanol udvinding, eller "MTBE kun» udtræk når antallet of træk blev sammenlignet ved hjælp af kvalitative og kvantitative software efter LC-MS-analyse. For eksempel ved hjælp af kun methanolekstraktion variationen for kreatinin-D3 var 15,2%. Men med MTBE LLE, var reduceret til 1,04% CV. Brug MTBE reproducerbarheden af lipider og vandige forbindelser var <8% og <5%, i forhold til en enklere methanolekstraktion hvilket resulterede i større variation på 29% og 15% lipider og vandige forbindelser. De interne standarder, der anvendes til at overvåge lipid inddrivelser - testosteron-D 2, C17 ceramid, 15:00 PC og 17:00 PE steget med 26%, 200%, 100%, 400% i forhold til anvendelse af methanol alene. Blev konstateret tilsvarende stigninger for fedtsyrer interne standarder og phosphotidylcholin og phosphotidylethanolamine endogene metabolitter. Andre endogene metabolitter såsom sphingosines, ceramider, diacylglyceroler, triglycerider, kolesterol og sphingomyelin blev enten ikke fundetanvendelse af methanol eller blev påvist på et ubetydeligt niveau. Men disse endogene lipider blev let detekteret ved anvendelse af MTBE ekstraktion.
I vores analyse sammenligner standardprotokoller, blev følgende resultater opnået: Methanol udfældning alene resulterede i 1.851 metabolitter, methanol-ethanolfældning gav 2.073 metabolitter, MTBE med væske-væske-ekstraktion gav 3.125, og MTBE med væske-væske og fast-fase ekstraktion genvundet 3.806 metabolitter. Derfor er denne fremgangsmåde resulterer i et større antal metabolitter bliver udtrukket, sandsynligvis på grund af reduceret ion undertrykkelse og renere prøver forud for LC-MS.
Figur 2 viser effektiviteten i at adskille de hydrofobe metabolitter i deres respektive kemiske klasser for mere sikker metabolit identifikation. Der er minimal overlapning af de forbindelser, der er identificeret i de tre lipidfraktioner efter SPE. Til støtte viser figur 3inddrivelse af interne standarder påviser, at ISTD s blev elueret i fraktionen relateret til deres kemiske klasse.
Kvalitetskontrol prøver anvendes til at vurdere kvaliteten af den forberedende prøve at bestemme eventuelle batch effekter når flere dage af analysen er nødvendige for en stor stikprøve sæt, og til at overvåge instrument reproducerbarhed. Chromatogrammer undersøges for at sikre, at spidse-in standarder er større end 90% genvundet med masse fejl på mindre end ± 3 ppm og fastholdelse tidsvindue på mindre end ± 5%. Hvis disse kriterier ikke er opfyldt, er resultaterne kasseres og prøverne analyseres igen. I tilfælde af en batch effekter, hvorved et skift i tilbageholdelse er observeret for et parti, kan de data analyse software korrigere for dette. En tidligere fremstillet batch af puljede plasmaprøver undergik prøveforberedelse. Fraktionerne blev derefter sub-alikvoter i autosampler og opbevaret ved -80 ° C til brug i overvågningsinstrument betingelsertioner hele hver analyseprøve. Tabel 1 viser resultaterne fra disse spike-i standarder. Fedtsyre negativ ionisering tilstand fraktion (data ikke vist i table) ikke blev anvendt til analyse, fordi% CV spike-i standarder for QC prøven var større end 10%. Datasættet for denne andel blev derfor kasseret, og det instrument, efterses og vedligeholdes. Tabel 2 viser resultaterne fra endogene metabolitter i prøverne følgende tre forskellige dage i prøveforberedelse og tredobbelte instrument injektioner. De endogene metabolitter i de prøveforberedelse QC prøver er alle reproducerbare, der betyder styrken af prøveforberedelse samt instrumentets indsprøjtning reproducerbarhed.
Når prøveforberedelse trin ikke fulgt korrekt, er imidlertid upålidelige og inkonsistente resultater opnået. Figur 4 viser resultaterne, når proteinet udfældningstrin af fremgangsmådenfølges ikke som beskrevet. Tre operatører, A, B og C udførte den samme prøve forberedelse procedure på puljede plasmaprøver. Operatør A snarere end pipettering den nødvendige mængde supernatant pr forsøgsprotokollen stedet pipetteret> 1 ml for begge vasker med nogle af bundfaldet. Dette er ikke kun resulteret i et højere antal falske positiver for denne andel, men øger variationen af data.
Den kromatografiske reproducerbarhed af data kan ses i fig. 7. Puljer plasmaprøver blev fremstillet i tre eksemplarer på separate dage ved hjælp af proteinudfældning, væske-væske-ekstraktion, og fastfase-ekstraktion som beskrevet i denne protokol. Hver fraktion blev analyseret ved hjælp af den kromatografiske separation beskrevet i afsnit 7 i protokollen. Prøver blev derefter injiceret i tre eksemplarer på LC-MS for at evaluere instrument og prøveforberedelse reproducerbarhed. Denne konsekvente overlapning demonstrerer både strength af reproducerbarheden af prøveforberedelse når de fremstilles på tre forskellige dage, samt styrken af den kromatografiske metode i fremstilling reproducerbare resultater. Observeres en stigning i kemisk støj for den negative ioniseringsmode af fedtsyren fraktion. Dette kan forekomme på grund af forurenende stoffer i LC-MS opløsningsmidler og kan resultere i inkonsistente kvantitative Metabolomic resultater. Derfor kan kun metabolitter, som elueres før 9 minutter blev analyseret.
Når du kører lange arbejdslister kan et tab af instrumentets følsomhed og forandring i bufferkoncentrationer ske over tid resulterer i nedsat signal intensitet og opholdstid skift. Hvis retentionstiden overlapning er variationen mindre end 5%, og signalintensiteten er variationen mindre end 10%, er dataene stadig inden standardlaboratoriemetoder grænser. Analysis-softwaren kan bruges til at tilpasse og normalisering af dataene for at korrigere for instrument og retentionstid afdrift. Men hvis variationen er LARge, så grund skal bestemmes. Når dette er udbedret, kan prøverne analyseres igen.
Figur 1.. Den overflod af lipid ISTDs (A) og endogene metabolitter (B) efter ekstraktion og modfasekromatografi (RPC) 12.. Ekstraktion blev udført, og resulterende prøver blev separeret ved hjælp af RPC og analyseret ved hjælp af LC-MS i positiv og negativ ionisering tilstand. Dette tal er blevet ændret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).
Figur 2.. En sammenligning af MTBE-SPE fraktioner 12. De identificerede metabolitter i hver frhandling blev sammenlignet for at identificere mængden af overlap i SPE del af prep. Tallene i Venn-diagrammet afspejler antallet af metabolitter detekteret i hver fraktion. Her mindre overlap er observeret blandt de tre fraktioner, der repræsenterer en succes sammensatte udvinding og metabolit klasse adskillelse under SPE trin. Dette tal er blevet ændret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).
Figur 3.. Genopretningen af ISTDs i fraktioner ved hjælp af MTBE-SPE-metoden 12. Ekstraktion blev udført, og resulterende prøver blev separeret ved hjælp af RPC og analyseret under anvendelse af LCMS i positiv og negativ modus som beskrevet i teksten. Dette tal er blevet ændret fra Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). </ P>
Figur 4.. Resultater fra pellet fraktion udarbejdet af tre operatører. Tre prøveforberedelse operatører A, B og C udføres det samme protein præparationstrin på puljede plasmaprøver. Tallene i Venn-diagrammet afspejler antallet af metabolitter detekteres af hver enkelt operatør. Erhvervsdrivende B og C pipetteredes den nødvendige volumen pr prøveforberedelse protokollen, mens operatør A pipetteres hele supernatant og nogle af pillen, hvilket resulterer i mere end 500 flere metabolitter, hvoraf de fleste falske positiver for den specifikke fraktion.
Fig. 5. Dannelse af proteinpellet under proteinfældning trin <. / Strong> (A) 100 ul humant plasma forud for prøveforberedelse, (B) plasma efter tilsætning af iskold methanol (C)-proteinet dannede pellet på bunden af røret efter centrifugering ved 0 ° C i 15 minutter ved 18.000 x g.
Fig. 6. Adskillelse af de hydrofile og hydrofobe lag under væske-væske-ekstraktion (LLE) trin. Det organiske opløsningsmiddel methyl-tert-butylether (MTBE) og vand blev anvendt til at separere de hydrofile og hydrofobe metabolitter. MTBE-lag er opløst ikke-polære forbindelser, og vandlaget er opløst polære forbindelser (A) plasma supernatant efter fjernelse af protein. (B) plasma efter tørring under nitrogen; (C) plasma efter tilsætning af MTBE;
Figur 7.. Kromatogrammer af fraktioner fra et valgt datasæt. Prøveforberedelse blev udført på tre separate pooled plasma QC prøver og hver prøve blev injiceret i tre eksemplarer på LC-MS instrument. Repræsenteret er total ion kromatogrammer af plasmaprøverne erhvervet ved hjælp af LC-MS-parametre, der er angivet i punkt 7 i metodeprotokollen. Den kromatografiske repræsentation af andre biologiske væsker vil variere på grund af forskelle i metabolit sammensætning.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fraktion | Ionisering tilstand | Intern standard | n | Gennemsnitlige topareal | Peak Area% CV |
| Vandig | Positiv | Kreatinin-D3 | 31 | 2217311 | 3,8% |
| Neutralt lipid | Positiv | Triglycerid-D 5 | 31 | 4837032 | 9,9% |
| C17 Ceramide | 31 | 12736707 | 7,9% | ||
| Phospholipid | Positiv | 15:0 PC | 32 | 1248929 | 9,3% |
| 17:00 PE | 32 | 517.234 | 7,9% |
Tabel 1.. Kvalitetskontrol resultater fra spidse interne standarder. Samlet plasma prøver fra en emfysem musemodel datasæt blev analyseret for at overvåge forholdene instrument på daglig basis for denne multi-ugers undersøgelse. Kvantitativ analyse software blev brugt til at bestemme peak områder af interne standarder (N = antal instrument QC injektioner).
| Fraktion | Ionisering tilstand | Endogene metabolitter | Gennemsnitlige topareal | Peak Area% CV |
| Vandig | Positiv | Kreatinin | 2554574 | 2,3% |
| Valin | 3712151 | 3,3% | ||
| Glukose | 2669190 | 6,9% | ||
| Neutralt lipid | Positiv | 3-Dehydrosphinganine | 226.644 | 3,9% |
| 11301 | 8,2% | |||
| DG (P-14: 0/18: 1) | 364.119 | 1,9% | ||
| Phospholipid | Positiv | PC (24:0 / 0:0) | 27599 | 0,9% |
| PC16: 0/22: 6) | 2873326 | 4,5% | ||
| PI (16:0 / 18:1) | 112.998 | 4,4% | ||
| Fedtsyre | Positiv | 10-oxo-5 ,8-decadienoic syre | 1363284 | 2,3% |
| 16-oxo-heptadecansyre | 83700 | |||
| 2-methyl valerianesyre | 285782 | 5,7% | ||
| Fedtsyre | Negativ | 10-hydroxy-8-octadecensyre | 10042 | 4,9% |
| (R)-laballenic syre | 173.929 | 6,5% | ||
| 2-keto valerianesyre | 35488 | 6,0% |
Tabel 2.. Kvalitetskontrol resultater fra endogene metabolitter. Samlet plasma prøver fra en menneskelig sygdom datasæt blev analyseret for at overvåge prøveforberedelse reproducerbarhed på forskellige dage. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer over tre dage (n = 9 prep QC injektioner).
Discussion
Et mål af kliniske Metabolomic undersøgelser er at identificere ændringer i metabolomet relateret til sygdom eller behandlinger. Derfor prøveforberedelse teknikker nødt til at være robust, konsekvent, og overføres fra tekniker til tekniker og fra laboratorium til laboratorium 22. De resulterende data skal være repræsentativ for prøven, og identificerede ændringer skal afspejle prøve-sæt i stedet for prøveforberedelse fejl. Derfor præcis pipettering, korrekt temperatur, effektiv dekantering af blandbare lag, tørring under nitrogen, og anvendelsen af de samme mærker og størrelser af glasvarer og tips er nødvendige.
Under proteinudfældning skridt, er det afgørende, at den samme mængde opløsning dekanteres fra hver pellet. Dette reducerer variationen i volumen og som sådan reducerer variationen i eksempeldata. Dette protein udfældningstrin er nødvendig for Metabolomic undersøgelser og ikke kan udelades, eftersom det fjerner protein fraprøverne forud for lille molekyle profilanalyse på massespektrometer. Det eliminerer patogener og store makromolekyler, og frigiver bundne metabolitter fra proteiner 7. Mangel på protein akkumulering i prøverne udvider kolonnen levetid HPLC og forøger nøjagtigheden og kvaliteten af resultaterne Figur 5 er en afbildning af proteinet dannede pellet ved udførelse af denne teknik på plasmaprøver.. Dette muliggør påvisning af små molekyler, øger ion-indhold og reducerer matrixeffekter fra proteinerne i prøven. Desuden, da det antages, at alle proteiner fjernes i dette trin, ville aminosyrer, der konstateres under LC-MS-analyse stammer fra metaboliske ændringer snarere end fra protein opdeling.
Væske-væske-ekstraktion er kritisk, da den adskiller de hydrofile og hydrofobe metabolitter i to ikke-blandbare faser. Figur 6 viser LLE procedure og en reptation af LLE lag. En forkert adskillelse af de to lag resulterer i metabolitter enten går tabt eller blive elueret i begge fraktioner. Omhyggelig anvendelse af dette trin reducerer antallet af hydrofile forbindelser, der forekommer i den hydrofobe fraktion. Resultaterne for disse forbindelser blive upålidelig, da det ikke kan fastslås, hvilken fraktion indeholder de repræsentative resultater. Når det gøres korrekt, er metabolit overlapning reduceres.
For at forhindre oxidativ nedbrydning, især i lipider, men også i små molekyler, som kan indeholde thiolgrupper for eksempel udsættelse for oxygen skal holdes på et minimum. Derfor er denne procedure udføres altid under nitrogen for at reducere / forhindre oxidation af lipid-eller thiolholdige forbindelser. Desuden overførsel af prøve og / eller opløsning er hurtig (inden for det første minut) for at reducere udsættelse for oxygen, så prøver hurtigt anbringes under en stabil strøm af nitrogen til at tørre ned. Når tørret, er de straksbart resuspenderet i 100% methanol i de ovennævnte drøftede grunde.
Laboratorier kan drage fordel af denne omfattende metode i en række forskellige måder; Forskere søger at isolere én klasse af forbindelser kan vælge den del af den metode, der passer bedst til deres behov. Dem, der søger at kun udføre en proteinudfældning at få en pulje af metabolitter kan gøre det. Hvis der ønskes hydrofile metabolitter, såsom mange lægemidler, aminosyrer og sukker, eller, hvis der kun ønskes hydrofobe metabolitter, såsom triglycerider, epoxider, fedtopløselige vitaminer, og phospholipider, for eksempel, så kan forskerne udføre væske-væske-ekstraktion trin efter proteinudfældning og kassér den uønskede fraktion. Efterforskere, der kræver yderligere sub-klassificering af de hydrofobe forbindelser (neutrale lipider, fedtsyrer og fosfolipider), kan fortsætte til fraktionering trin.
Opbevaring overvejelser er vigtige i maintaining levedygtigheden af prøver til senere analyse. Hvis prøver opbevaret forkert, kan nedbrydning eller nedbrydning forekomme. Ideelt set bør prøverne opbevares i skruelåg ravfarvede hætteglas væk fra lys for at forhindre nedbrydning af lysfølsomme arter. Prøverne skal også holdes frossen ved -80 ° C for at forhindre metabolit nedbrydning 23-25. Selv om det ikke diskuteres i detaljer her, er prøverne altid holdes ved 4 ° C i autosampleren bakken under LC-MS-analyse. Dette sikrer, at alle prøver opbevares ved en konstant temperatur, og at ændringer i den omgivende temperatur påvirker ikke viskositet, opløselighed eller stabilitet af prøverne. Det anbefales, at de manuelle aspekter af denne procedure, såsom LLE og SPE, praktiseres for at vinde tillid og komfort med de skridt, der er involveret.
Der findes nogle få begrænsninger for denne teknik. Diskret adskillelse af de hydrofobe og hydrofile metabolitter er ikke garanteret som visse forbindelser vil inherladende fordeles i begge fraktioner på grund af deres kemiske sammensætning og opladning tilstand. Derudover, som vist i figur 4, forkert teknik under proteinpellet ekstraktionstrinnet kan resultere i dårlig metabolit reproducerbarhed i både prøver og kvalitetskontrol. Dette påvirker statistikken, især i små datasæt, fordi den statistiske effekt er ikke tilgængelig. Derfor er det afgørende, at dette skridt skal udføres nøjagtig det samme hver gang for hver prøve. En anden begrænsning er tid. Selv om der er stop-punkter i hele denne protokol, hvor prøverne kan fryses, og prep fortsatte den følgende dag, skal en hel dag blive afsat til at udføre denne procedure. For det tredje, ikke hver forbindelse i en biologisk prøve kan vurderes for ion-undertrykkelse. Da det ikke er muligt at identificere, hvordan matricen påvirker enkelte metabolit den aktuelle løsning er at evaluere de interne standarder, som teoretisk efterligner nogle klasser af endogenous metabolitter. Endelig absolutte identifikationer kan ikke udelukkende udføres med denne metode. Tandem MS i samarbejde med databasesøgninger og standarder er nødvendige for absolut metabolit identifikation.
En vigtig del af metabolomics er identifikation af forbindelser. Selv om det ikke diskuteres i detaljer her, blev kvalitet kontrolprøver analyseret ved hjælp af LC-MS. Flere prøveforberedelse blanke og blanketterne blev forberedt til brug som baggrund subtraktion at reducere antallet af falske positiver fra forureninger, hvilket resulterer i mere pålidelige metabolit hits. Efter dette trin, blev antallet af "molekylære funktioner" samlet baseret på m / z, opholdstid, isotopforhold, og addukter at producere en liste over konkrete forbindelser. Selv om listen over forbindelser i høj grad blev reduceret, var resultaterne mere pålidelige, da de ikke var baseret på flere addukter fra samme forbindelse. Den fulde metode er omfattende og giver isolation af hydrofobe metabolitter, såsom neutrale lipider, phospholipider, fedtsyrer, triglycerider, og steroider, samtidig isolere hydrofile klasser i den vandige fraktion, som eicosanoider er sukkerarter, flavonoider, og aminosyrer blevet identificeret 12 26.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Den præsenterede tutorial blev udført og udviklet inden for massespektrometri Core Facility på National Jewish Health. Den NJH MS anlægget er delvist understøttet af CCSTI UL1 TR000154. Støtte fra NIH tilskud P20 HL-113445 og R01 HL-095.432 støttede også dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | |
| Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | |
| Water | Honeywell Burdick Jackson | 365-4 | |
| OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C | |
| 12-position vacuum manifold | Phenomenex | ||
| Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | |
| Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
| Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
| Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
| Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | |
| Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | |
| Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
| Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
| Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
| Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |
References
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).
- Clarke, C. J., Haselden, J. N. Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity. Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).
- Wang, X., Zhang, A., Sun, H. Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).
- Collino, S., Martin, F. -P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics. Nutrients. 1, 101-110 (2009).
- Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. Metabolomic analysis in food science: a review. Trends in Food Scienc., & Technology. 20, 557-566 (2009).
- Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).
- Wishart, D., et al. Metabolome Analysis: An Introduction. , John Wile., & Sons, Inc. 253-288 (2006).
- Vuckovic, D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography–mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).
- Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition. NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).
- Dong, M. W. Modern HPLC for Practicing Scientists. , John Wile., & Sons, Inc. (2006).
- Want, E. J., et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).
- Yang, Y., et al. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).
- Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).
- Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction. Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).
- Kerns, E. H., Di, L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., Jiménez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).
- Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease. NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).
- Schulze, H., Sandhoff, K.
- Kuhn, E., et al. Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma. Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).
- Rist, M. J., et al. Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics. Metabolites. 3, 243-258 (2013).
- Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin‘t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine. Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).
- Wood, J. T., et al. Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters. Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).
- Bahr, T. M., et al. Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).
