Multivelocidad Técnica Preparación recuperar múltiples clases de compuestos de metabolitos para en profundidad y análisis de Metabolómica Informativo

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un medio eficaz de fraccionar metabolitos en fluidos biológicos complejos con el fin de obtener muestras simplificadas para una mejor cobertura del metaboloma. Esto se logra primero colocando estándares internos en cada muestra para monitorear la reproducibilidad de la preparación de la muestra y las condiciones del instrumento. El segundo paso es añadir metanol helado a cada muestra para precipitar las proteínas que, de otro modo, podrían interferir con la cromatografía posterior y el análisis por espectrometría de masas.

A continuación, el paso de extracción líquido líquido separa los metabolitos hidrófilos de los hidrofóbicos. El paso final es la extracción en fase sólida para fraccionar aún más los metabolitos lipídicos en fosfolípidos, ácidos grasos y lípidos neutros. En última instancia, este método combinado de varios pasos se utiliza para mostrar una separación efectiva, una excelente reproducibilidad y una mejor cobertura del metaboloma plasmático.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la simple extracción con metanol, es que se obtiene una mejor cobertura de metabolitos, especialmente de lípidos, lo que es importante cuando se realizan estudios de perfiles metabolómicos o cuando los lípidos son de especial interés. Antes de la precipitación de proteínas, prepare primero las muestras y descongele las muestras a temperatura ambiente. A continuación, agregue las muestras con patrones internos ISTD que se prepararon de antemano.

Todas las concentraciones patrón se han ajustado según sea necesario en función de la sensibilidad de la instrumentación de MS y HPLC utilizada. Para el análisis, agregue 10 microlitros a cada muestra. Cada una de las soluciones estándar hidrofílicas e hidrofóbicas enriquece cada muestra con 10 microlitros de una solución de control positivo x dos x o cuatro x.

Después de que todas las muestras se hayan enriquecido con patrones internos y soluciones de control positivo, agite cada muestra durante 10 segundos. Para comenzar la precipitación de proteínas, agregue 400 microlitros de metanol helado a cada muestra. Vórtice durante 10 segundos por centrífuga de tubo a cero grados centígrados durante 15 minutos a 18.000 veces.

G, se debe formar una bolita de proteína en la parte inferior del tubo. Después de la centrifugación, transfiera todo el sobrenadante a un nuevo tubo de cultivo de vidrio y luego seque con nitrógeno. Este residuo seco se someterá a una extracción líquida posterior.

Para el análisis de la fracción de gránulos de proteína, agregue un mililitro de éter de escarabajo de métilo turt o MTBE al vórtice de gránulos de proteína blanco o blanquecino durante 30 segundos por tubo y centrifugar a cero grados Celsius durante 15 minutos a 18.000 veces. G decanta la capa de MTBE a un nuevo tubo de cultivo de vidrio. Dado que el tamaño del gránulo variará entre las muestras, es importante aspirar constantemente la misma cantidad de MTBE para todas las muestras.

Por ejemplo, si solo se pueden decantar 900 microlitros para la muestra con la menor cantidad de sobrenadante, entonces decanta 900 microlitros. Para todas las muestras, agregue otro mililitro de MTBE al vórtice de gránulos de proteína durante 30 segundos y luego centrifugue a cero grados Celsius o 15 minutos. Añadir 18.000 veces G como antes aspirar la capa de MTBE y añadir a los tubos de cultivo de vidrio preparados anteriormente.

Secar las muestras por flujo de nitrógeno y resuspender en 200 microlitros de metanol cloroformo uno a uno. Transfiera cada muestra a un tubo de centrífuga y centrifuga a cero grados centígrados durante 15 minutos a 18, 000 veces G. Después de eso, use pipetas de vidrio para transferir el sobrenadante a los viales con tapón de rosca del muestreador automático. Para comenzar este procedimiento, use una pipeta de vidrio para agregar tres mililitros de MTBE al residuo de metanol seco preparado anteriormente y agite durante 30 segundos.

Después de eso, agregue 750 microlitros de agua a cada tubo y vórtice durante 10 segundos. Centrifugar a aproximadamente 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente, se ven dos capas distintas Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente 2,5 mililitros de la capa superior de MTBE sin pipetear la capa acuosa inferior y transfiérala a un cultivo de vidrio limpio. Dos. Agregue tres mililitros de MTBE a la parte de agua restante de cada muestra.

Y vórtice de 10 segundos por centrífuga de tubo a aproximadamente 200 veces G durante 10 minutos. A temperatura ambiente, aspirar tres mililitros de MTBE sin obtener agua y combinar con el tubo de MTBE anterior. Esta fracción de MTBE se someterá posteriormente a una extracción en fase sólida.

Concentrar la capa acuosa restante mediante el secado bajo nitrógeno. Vuelva a suspender el residuo en 100 microlitros de uno, y agregue 400 microlitros de metanol helado a cada vórtice de tubo, y luego transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Déjelo a menos 80 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para permitir que cualquier proteína restante se precipite en el metanol.

A continuación, centrifugar a cero grados centígrados durante 15 minutos a 18, 000 veces G, debe haber un precipitado a lo largo del costado del tubo después de la centrifugación, aspirar 450 microlitros de sobrenadante sin aspirar el precipitado y transferirlo a un tubo de microcentrífuga limpio. Secar completamente en un concentrador centrífugo al vacío a no más de 45 grados centígrados durante aproximadamente una o dos horas. Vuelva a suspender el sobrenadante seco en 200 microlitros de agua de nitrilo acetil al 5% y vórtice.

Transfiera brevemente las muestras a automóviles, muestreador, viales y congele a menos 80 grados centígrados. Para iniciar el procedimiento de extracción en fase sólida, seque la fracción de MTBE obtenida previamente bajo un buen flujo de nitrógeno a 35 a grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Cuando las fracciones de MTBE estén completamente secas, detenga el flujo de nitrógeno y vuelva a suspender rápidamente cada muestra en un mililitro de cloroformo utilizando un vórtice de pipeta de vidrio.

Lave y acondiciona brevemente el cartucho de extracción en fase sólida o SPE dos veces con 400 microlitros de hexano. Deseche los residuos y reemplácelos con un nuevo tubo de recolección de vidrio. Agregue la muestra a la columna SPE, aplique vacío y recoja el flujo.

Con una pipeta de vidrio, agregue un mililitro de alcohol isopropílico de cloroformo de dos a un a la columna SPE y recoja el flujo en los mismos tubos de vidrio. Esta es la fracción neutra. Seque la fracción neutra bajo nitrógeno durante 10 a 15 minutos.

Para minimizar la oxidación con una pipeta de vidrio, agregue un mililitro de ácido acético al 5% en éter etílico a la columna SPE y recoja el flujo. Esta es la fracción de ácidos grasos. Seque la fracción de ácidos grasos bajo nitrógeno durante 10 a 15 minutos para minimizar la oxidación con puntas de plástico.

Agregue 800 microlitros de metanol al cartucho SPE y recoja el flujo a través de tubos cónicos de plástico de 15 mililitros, esta es la fracción de fosfolípidos. Transfiera la fracción de fosfolípidos a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, seque las muestras con un concentrador centrífugo al vacío a 45 grados centígrados durante aproximadamente una a 1,5 horas. Por último, suspende cada una de las muestras de las tres fracciones en 200 microlitros de transferencia 100% de metanol a autos, muestreador, viales y almacena en el congelador a 80 grados centígrados negativos.

La efectividad del método M-T-B-E-S-P-E en la extracción tanto de patrones lipídicos como de metabolitos endógenos se demuestra en general se obtuvo una mejor extracción y cobertura de los metabolitos en comparación con otros métodos, como la extracción con metanol o la extracción solo con MTBE, cuando se comparó el número de características utilizando software cualitativo y cuantitativo. Después del análisis lc MS, la comparación de las fracciones M-T-B-E-S-P-E mostró una superposición mínima entre las tres fracciones después de SPE, lo que demuestra la eficiencia en la separación de los metabolitos hidrofóbicos en sus respectivas clases químicas para una identificación más segura de los metabolitos. Además, la recuperación de los patrones internos en fracciones utilizando el método M-T-B-E-S-P-E, NR 12 demostró que los patrones internos fueron aludidos en la fracción relacionada con su clase química.

Para evaluar la reproducibilidad cromatográfica de los datos, la preparación de la muestra se realizó en tres muestras de control de calidad de plasma agrupadas por separado, y cada muestra se inyectó por triplicado en el instrumento LCM MSS. La superposición constante demuestra la reproducibilidad de la preparación del instrumento y de la muestra. El aumento del ruido químico observado para el modo de ionización negativa de la fracción de ácidos grasos puede deberse a los contaminantes de los disolventes LCM S.

Por lo tanto, solo se analizaron los metabolitos aludidos antes de los nueve minutos. No olvide que trabajar con cloroformo, MTBE, éter etílico e incluso los reactivos más comunes utilizados en este método puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos y realizar la preparación de muestras en una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.