Los trastornos metabólicos se encuentran entre una de las enfermedades más comunes en los seres humanos. El modelo de organismo genéticamente manejable D. melanogaster se puede utilizar para identificar nuevos genes que regulan el metabolismo. Este artículo describe un método relativamente sencillo que permite el estudio de la tasa metabólica en las moscas de la medición de su producción de CO 2.
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Artículo de método
La medición de la tasa metabólica en
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Resumen
Resumen
Trastornos metabólicos son un problema frecuente que afecta a la salud humana. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan el metabolismo es una tarea científica fundamental. Muchos de los genes que causan enfermedades en los seres humanos tienen un homólogo mosca, haciendo Drosophila un buen modelo para estudiar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de diferentes trastornos. Además, la maleabilidad de Drosophila simplifica pantallas genéticos para ayudar en la identificación de nuevas dianas terapéuticas que puedan regular el metabolismo. Con el fin de realizar una pantalla de este tipo es necesario un método sencillo y rápido para identificar los cambios en el estado metabólico de las moscas. En general, la producción de dióxido de carbono es un buen indicador de los gastos de oxidación del sustrato y la energía que proporciona información sobre el estado metabólico. En este protocolo se introduce un método simple para medir el CO 2 de salida de las moscas. Esta técnica potencialmente puede ayudar en la identificación de las perturbaciones genéticos que afectan la tasa metabólica.
Introducción
El ciclo bioquímico de Krebs genera ATP a través de la oxidación de acetato derivado de los carbohidratos, las grasas y las proteínas que producen CO 2. En Drosophila, O 2 de entrada está directamente relacionada con la producción de CO 2 y refleja el nivel de metabolismo 1. Por lo tanto, la medición de CO 2 de salida ha utilizado con éxito en los estudios relacionados con el envejecimiento y el metabolismo de 2-5. Aquí nuestro laboratorio ha modificado montajes experimentales previamente diseñados, lo que permite la medición de la producción de CO 2 en un máximo de dieciocho muestras sin necesidad de equipo especializado. Otros y hemos utilizado anteriormente este método para mostrar las diferencias en las tasas metabólicas en las moscas que son deficientes en la proteína de la distrofia muscular asociada, Distroglicano (Dg) 6-8.
O 2 utilizado para el metabolismo oxidativo se convierte en CO 2, que es expulsado como residuos respiratoria. La construcciónción de respirómetros hechas a mano se describe que permite la determinación de la tasa de O 2 consumido. Las moscas se colocan en un recipiente sellado con una sustancia que absorbe CO 2 expulsado, eliminando de manera eficiente desde la fase gaseosa. El cambio en el volumen de gas (disminución de la presión) se mide por el desplazamiento de fluido en un capilar de vidrio unido a la respirómetro cerrado.
La principal ventaja de esta técnica sobre otros es el costo. Estudios previos han medido la producción de CO2 por Drosophila utilizando analizadores de gases y sistemas de respirometría técnicamente avanzados 1,9. A pesar de el equipo más complejo, la sensibilidad del método descrito aquí es similar a los valores reportados (Tabla 1). Además, varios otros grupos han utilizado variaciones de esta técnica para determinar las tasas metabólicas relativas en Drosophila 4-6. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para generar reliable, datos reproducibles relevantes para el metabolismo de Drosophila sin la compra de equipo especializado que puede ser configurado en cualquier laboratorio y se puede utilizar con fines educativos.
En general, las técnicas aceptadas para determinar el metabolismo de un organismo es medir el CO 2 producido, el O 2 consumido, o ambos 3,4,9. Aunque, se puede suponer que un equivalente de O 2 genera un equivalente de CO 2, la relación precisa de CO 2 generado es dependiente sobre el sustrato metabólico utilizado 10. Por lo tanto, para determinar con precisión la tasa metabólica en unidades de energía que es necesario medir ambos O 2 consumido y CO 2 producido. Debido a esto, el método descrito aquí es específicamente relevante para la comparación de las diferencias en la producción de CO 2 entre los animales y no el valor absoluto. Nuestra técnica se integra animales CO producción múltiple 2 durante un período de timE (1-2 horas) y por lo tanto devuelve un promedio de la actividad de los animales. Si hay razones para creer que los animales de experimentación son menos activos que los animales de control de la medición podría reflejar diferentes niveles de actividad y no necesariamente el metabolismo.
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Protocolo
1. Preparación de respirómetros
- Corte la punta de la pipeta 1.000 l con una hoja de afeitar para permitir la inserción de los capilares de la micropipeta 50 l, tratar de conseguir la punta de la pipeta lo más recto posible.
- Coloque un pedazo de espuma en la pipeta y presione hacia abajo en la punta de la pipeta.
- Agregue una pequeña cantidad de absorbente de CO 2 y de contenerlo por una segunda pieza de espuma.
- Aplicar el pegamento en el lugar donde se inserta la micropipeta en la punta de la pipeta.
- Deje el respirómetro durante la noche para permitir que el pegamento se seque.
Un diagrama esquemático de un respirómetro se muestra en la Figura 1A.
2. Preparación de la cámara de medición
- Preparar la solución de cámara de mezclando agua con eosina en una relación que se traducirá en la coloración visible.
- Verter la solución de eosina / agua en la cámara.
- Etiqueta de uno de los lados de la cámara con una escala de centímetros.
3. La colocación de las moscas en respirómetros
- Etiquetar los respirómetros individuales con un marcador.
- Anestesie moscas utilizando un método alternativo a CO 2 y colocar 3-5 moscas del genotipo deseado dentro de cada respirómetro.
- Selle las respirómetros firmemente en la parte superior el uso de masilla de plastilina.
- Permitir que las moscas se recuperen de la anestesia durante aproximadamente 15 min.
- Preparar una respirómetro sin moscas, que se utilizó como control atmosférica.
4. Realización del experimento
- Cuelgue las respirómetros en la cámara uniendo un soporte de tubo Eppendorf de 1,5 ml que está abierto en la parte superior y la parte inferior en la parte superior de la cámara.
- Inserte respirómetros con la punta de la micropipeta hacia la cámara que permite que la punta se sumerja en la solución de color.
- Añadir vaselina entre la cubierta de la tapa y la cámara para proporcionar aislamiento más fuerte de temperatura y presión fluctluaciones.
- Cierre la tapa y deje que el sistema se equilibre durante 15 min.
- Tome una fotografía de la cámara de asegurarse de que el nivel de líquido dentro de cada micropipeta es visible y también lo es la escala (véase el ejemplo mostrado en la Figura 1B).
- Después de 1-2 horas, tomar otra foto.
- Cuando se termina el experimento, eliminar las moscas de respirómetros y sopesar si se desea o transferirlos de nuevo al frasco si es necesario más.
5. Análisis de los resultados
- Abrir las imágenes adquiridas utilizando el software ImageJ 11.
- Utilizando la escala en cada imagen, ajuste la escala de píxeles en el software.
- Medir la distancia (Dd) que el líquido viajó desde un punto de referencia determinado en las imágenes tomadas al principio (d1) y al final del experimento (d2). Un ejemplo de esquema se muestra en la figura 1C.
- Calcular la cantidad de CO2 producido (l / h / mosca) con la fórmula:
R = radio del tubo micropipeta en centímetros
Dd = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de muestras de ensayo se mide en centímetros
? C = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de la muestra de control negativo (sin moscas)
n = número de moscas utilizadas
h = horas
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Resultados
Con el fin de demostrar que el método es sensible que mide la producción de CO 2 de tipo salvaje (Oregon R) macho vuela a 18, 25 y 29 ° C y las moscas mutantes para Dg. Las moscas se elevaron a 25 ° C y luego se desplazan a la temperatura experimental durante 5 días antes de la medición. Como era de esperar para esta especie ectotérmico, la cantidad de CO 2 producido aumentó con la temperatura (Figura 2). Hemos en el pasado muestran que una dieta libre de azúcar r...
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Discusión
En este protocolo, se describe un método de bajo costo y confiable para medir la producción de CO 2 en las moscas. Hemos encontrado que este experimento es fácil, rápido de realizar y genera datos reproducible que está de acuerdo con otros estudios 1, 6, 9. El protocolo descrito aquí se puede modificar fácilmente para adaptarse a presupuesto y materiales disponibles de cualquier laboratorio. La construcción de cada respirómetro individuo puede adaptarse, siempre y cuando la cámara permanece herméti...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a la Sociedad Max-Planck para la financiación de nuestra investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BlauBrand IntraMark 50 y micro; l micropipetas | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lima | Wako CDN6847 | ||
| Eosina | Sigma | 031M4359 | Se puede utilizar cualquier tinte que pueda crear una coloración visible del líquido Cámara de |
| revelado de cromatografía en capa fina (TLC) | VWR | 21432-761 | Cualquier cámara de vidrio transparente que se pueda cerrar con la tapa |
| Anestesiante, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml puntas de pipeta | Cualquiera | ||
| Espuma | cualquier | ||
| plaesticina masilla | cualquier | ||
| bisturí | cualquier | ||
Referencias
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
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- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
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- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
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