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Immunology and Infection

Um protocolo para infectar Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans tem emergido como um novo modelo genético para estudar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui nós descrevemos um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, juntamente com a técnica de interferência dupla vertente RNAi para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella.

Abstract

Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar interações entre hospedeiros e patógenos, incluindo a defesa do hospedeiro contra bactérias gram-negativas bactéria Salmonella typhimurium. Salmonella estabelece infecção persistente no intestino de C. elegans e resulta na morte prematura dos animais infectados. Um número de mecanismos de imunidade foram identificados em C. elegans para se defender contra infecções por Salmonella. Autophagy, uma via de degradação lisossomal evolutivamente conservadas, foi mostrado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e nos mamíferos. Aqui, é descrito um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, em que os vermes são expostos a Salmonella por um tempo limitado, semelhante à infecção por Salmonella em humanos. infecção por Salmonella encurta significativamente o tempo de vida de C. elegans </ Em>. Usando o gene essencial autofagia bec-1 como exemplo, que combinado este método de infecção com C. elegans ARNi alimentação abordagem e mostraram que este protocolo pode ser utilizado para examinar a função de C. genes do hospedeiro elegans em defesa contra a infecção por Salmonella. Desde C. elegans genoma bibliotecas inteiras RNAi estão disponíveis, este protocolo torna possível para a tela de forma abrangente para C. elegans genes que protegem contra Salmonella e outros patógenos intestinais usando bibliotecas RNAi genômicos.

Introduction

O solo de vida livre Caenorhabditis elegans nematóide é um organismo modelo simples e geneticamente tratável usada para estudar muitas questões biológicas. C. elegans dominantemente existe como hermafroditas auto-fertilização. Os machos são gerados de forma espontânea por não-disjunção do cromossomo X durante a gametogênese 1,2. Na presença de alimento abundante, C. elegans desenvolver continuamente através de quatro fases larval ao adulto. A temperatura também influencia C. desenvolvimento elegans; desenvolvimento mais rápido é observada a temperaturas mais elevadas. No laboratório, C. elegans é cultivada a uma temperatura normal de 20 ° C em placas de agar com semeado bactéria Escherichia coli (estirpe OP50) como alimento de 1,2.

Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar as interações patógeno-hospedeiro 3-5. Na natureza, C. elegans come bactérias como nutrient 1,2 fonte. Sua comida laboratório bacteriana normal, OP50, pode ser facilmente substituído por outros agentes patogénicos para examinar as interações entre C. elegans e qualquer agente patogénico escolhido. Sob estas condições, o intestino é o principal local da infecção. De facto, uma grande variedade de agentes patogénicos bacterianos tem sido mostrado para infectar letalmente C. elegans 3-5.

A bactéria Salmonella gram-negativo é um patógeno gastrointestinal que causa doenças de origem alimentar humana em todo o mundo 6,7. C. elegans é um bom anfitrião modelo para Salmonella typhimurium como esta bactéria replica e apresenta infecções intestinais persistentes 8-10. C. elegans foi utilizado para identificar novas e anteriormente conhecida virulência de Salmonella factores 11. Curiosamente, a C. sistema imunitário elegans limita com sucesso a replicação de Salmonella. Foi relatado anteriormente que inibidoition de genes autofagia torna o aumento da replicação Salmonella em C. elegans, resultando em morte precoce de vermes infectados 10. Macroautofagia (aqui referido como autofagia) é um processo dinâmico, que envolve o rearranjo de membranas intracelulares para sequestrar citoplasma e organelas para entrega do lisossoma para degradação 12. Autophagy foi reportado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e em mamíferos 10,13.

O C. elegans genoma foi o primeiro genoma eucarionte multicelular seqüenciado; ele é sensível ao tratamento 14-16 RNAi. Além disso, o RNAi pode ser administrado de forma eficaz, sujeitando vermes ingerir bactérias contendo o ARN de cadeia dupla do gene alvo, conhecido como RNAi alimentação 16,17. Genoma bibliotecas inteiras de alimentação RNAi foram gerados por RNAi do genoma triagem 16,18. Nisto, uma infecção pro Salmonellatocolo está acoplado com o RNAi alimentação para permitir o teste C. elegans genes de interesse para a sua capacidade de proteger contra infecção por Salmonella.

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Protocol

1. Placas XLD (xilose lisina desoxicolato) Agar

Ágar XLD é um meio de crescimento seletivo para Salmonella, que aparece como colônias pretas nas placas de ágar XLD. No entanto, se não existem preocupações de contaminação, uma placa LB regular pode ser substituído.

  1. Pesar 5,5 g de ágar XLD e ressuspender em 5 ml de água deionizada.
  2. Misture bem até que todo o agar é molhado. Adicionar 95 ml de água deionizada até que todos os pedaços se foram e o meio é completamente em suspensão.
  3. Ferva o meio para dissolver completamente (não autoclave).
  4. Arrefece-se o meio à temperatura ambiente e 50 ° C.
  5. Verter 25 mL de agar em cada um 95 x 15 mm (diâmetro x altura) da placa (placas seladas com Parafilm pode ser armazenado a 4 ° C durante até 1 mês).

2. Nematode Crescimento Médio (NGM) RNAi Alimentando Plates

Preparação de C. elegans placas NGM foi descrito anteriormente 19. Aqui um procedimento é descrito resumidamente a adicionar o antibiótico ampicilina e a RNAi indutor químico isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para o meio de NGM para fazer as placas de alimentação de RNAi.

  1. Dissolve-se 3 g de NaCl e 2,5 g de Bacto peptona em 1 L de água desionizada.
  2. Adicione 17 g de ágar Bacto na mídia.
  3. Autoclave a media durante 45 min e arrefecer a mídia para 50 ° C em um banho de água.
  4. Adicionar as seguintes soluções: 1 ml de colesterol (5 mg / ml em etanol a 95%), 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, e tampão de fosfato de potássio 25 ml 1 M (pH 6,0). Misture bem.
  5. Adicionar 1 ml de 1 M de IPTG e 500 ul de ampicilina (100 mg / ml em água esterilizada).
  6. Misturar a solução bem e despeje em 60 x 15 mm (diâmetro x altura) placas de Petri usando uma pipeta Aid e 25 ml de pipeta sorológica seguintes procedimentos estéreis. Encha cada placa com 12 ml de ágar. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até 1 mês.

O gene essencial autofagia bec-1 é utilizado como um exemplo para examinar a função de um gene hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. Os procedimentos experimentais são ilustradas na Figura 1 e Tabela 1. O protocolo para a preparação de animais tratados em RNAi para infecção segue, com o dia de cada passo experimental dado entre parênteses.

  1. Inocular bec-1 RNAi alimentação e controlar o vector vazio L4440 RNAi bactérias alimentação pela colocação de um floco de -80 ° C bactérias congeladas em 2 ml de meio LB suplementado com 100 mg / ml de ampicilina (Dia 1). Repita este passo uma vez por semana, durante todo o experimento ter bactérias RNAi frescos. Armazenar a cultura no frigorífico a 4 ° C quando não usado.
  2. Semente 100 ml de cultura bacteriana durante a noite RNAi em placas de RNAi. Prepare três bec-1 RNAi e três controle vazio vEctor placas de RNAi. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite (dia 2).
  3. Remova as placas de RNAi da 37 ° C incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente no banco. Pegue bem alimentados L4 tipo selvagem hermafroditas N2 e transferi-los para bec-1 RNAi e controlar placas RNAi vetores vazios. Coloque três vermes por placa, em placas triplicadas. No mesmo dia, para preparar as placas de RNAi, como descrito no passo 3.2 (Dia 3).
  4. Incubar as placas de RNAi com vermes na incubadora a 20 ° C durante 36-40 hr e de transferência de vermes para placas frescas de RNAi correspondentes preparados no passo 3.3. Depois de vermes são transferidos, incubar as placas no 20 ° C incubadora por 64 horas (dia 4).

4. Prepare Salmonella para a Infecção

  1. Streak Salmonella -80 ° C lote congelado em 1 placa de ágar XLD e incubar a placa a 37 ° C durante a noite (dia 5
  2. Escolha bem isolado preto colónia de Salmonella e inocula-lo em 2 ml de meio LB a 37 ° C com agitação durante a noite (dia 6).
  3. Semente de 80 ml ​​de cultura de uma noite de Salmonella em 1 de C. elegans 60 x 15 mm (diâmetro x altura) placa de ágar NGM e preparar 6 pratos no total. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 6 horas. A cultura bacteriana deve secar e formar um relvado sobre a placa (dia 7).

5. Worms tratados com RNAi Infect com Salmonella

  1. Transferir bec-1 e controle de vetores vazios tratados com RNAi hermafroditas L4 N2 (progênie de minhocas criadas no passo 3) para placas de Salmonella tratados com RNAi. Colocar 40 vermes por placa em 3 placas para cada grupo. Incubar as placas sem-fim, a 20 ° C durante 48 h (Dia 7).
  2. Prepare um conjunto de placas de RNAi frescos como descrito nos passos 3.1 e 3.2 (dia 7 e
  3. Após 48 horas de infecção, transferir vermes infectadas com Salmonella às placas correspondentes RNAi preparados na etapa 5.2 e incubar a 20 ° C (dia 9).

6. Ensaio de sobrevivência

  1. Marque a sobrevivência dos vermes diária e transferir worms para frescas correspondentes placas de RNAi durante o tempo de postura. Preparar um conjunto de novas placas de RNAi, antes de cada transferência de sem-fim, tal como descrito nas etapas 3.1 e 3.2. Toque o corpo verme (cabeça, parte intermediária e cauda) delicadamente com um fio de platina achatado-end. Um worm é marcado como morto se nenhum movimento do corpo verme é observada.
  2. Marque a sobrevivência dos vermes diárias ou em dias alternados, e transferir para vermes frescas correspondentes placas de RNAi duas vezes por semana depois de vermes parar de pôr ovos.
  3. Depois de todos os vermes morrem, reunir os dados de sobrevivência de placas triplicadas como um conjunto de dados. Introduza os dados de sobrevivência de cada grupo em software estatístico adequado, como GraphPad PRISM para gerar curvas de sobrevivência e para realizar a análise de sobrevida de Kaplan-Meier. Toda a experiência foi repetida pelo menos uma vez para confirmar a conclusão.

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Representative Results

A 20 ° C, o tempo de vida médio de tipo selvagem vermes N2 de 17 dias (Figura 2A e Tabela 2). Infecção por Salmonella diminui significativamente o tempo de vida médio de vermes N2 a 10,5 dias (p = 0,0002, teste de log-rank) (Figura 2A ).

Se um C. elegans gene desempenha um papel importante na defesa contra a infecção por Salmonella, prevê-se que a sua inibição irá conferir susceptibilidade à infecção por Salmonella. Na verdade, em relação ao controle tratado com RNAi animais N2 infectados com Salmonella, o tempo de vida médio de bec-1 tratados com RNAi vermes N2 infectadas por Salmonella é diminuída de 10,5 dias 9 dias (p <0,0001, teste log-rank) (Figura 2B e na Tabela 2). O tempo de vida máximo é reduzido drasticamente por 14 dias (de 24 dias a 10 dias, a figura 2B e Tabela 2). Além disso, a serc-1 RNAi não tem nenhum efeito óbvio sobre a vida útil dos vermes N2 que não estão infectadas com Salmonella (p = 0,2593, teste de log-rank) (Figura 2C e Tabela 2), indicando que a infecção por Salmonella, não bec-1 tratamento de RNAi, diminui o tempo de vida de Salmonella infectados bec-1 vermes tratados com RNAi. Além disso, bec-1 é um gene essencial em C. elegans defesa contra infecção por Salmonella.

Figura 1
Figura 1. Gráfico dos procedimentos experimentais de fluxo.

Figura 2
Figura 2. Inibição da bec-1 gene por RNAi confere sussuscetibilidade à infecção por Salmonella em C. elegans. curvas AC) de sobrevivência de animais selvagens N2 tratados com controle de vetor vazio RNAi ou bec-1 RNAi gene após uma exposição de 2 dias para Salmonella typhimurium ou não patogênicas Escherichia coli a 20 ° C. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Tabela 1
Protocolo prazo Tabela 1. Infecção por Salmonella.

Tabela 2
Tabela 2. Análise estatística delifespan dados apresentados na Figura 2.

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Discussion

C. elegans é um simples organismo modelo genético que se alimenta de bactérias como fonte de nutrientes. Assim, é fácil de substituir a sua comida bacteriana normal com um patógeno intestinal para investigar as interações entre C. elegans e o agente patogénico escolhido. Nisto um protocolo é descrito combinar infecção por Salmonella e C. elegans RNAi alimentando tratamento para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. Protocolos de infecção prévia expor C. vermes elegans para bactérias patogênicas, incluindo Salmonella durante a sua vida 20. No presente protocolo, Salmonella infecta os vermes em um período de dois dias. Depois disso, os vermes não estão mais expostos a Salmonella. Esta infecção por Salmonella diminui significativamente o tempo de vida de C. elegans animais de tipo selvagem. Assim, invadiram Salmonella replicar vermes dentro e matar os animais 10 Salmonella Salmonella imita humano, o que deve ajudar a descobrir informações úteis para entender doenças de origem alimentar humana causada pela infecção por Salmonella. Além disso, este protocolo de combina o tratamento de alimentação de RNAi com infecção por Salmonella, tornando-se possível testar quaisquer genes candidatos que possam estar envolvidos na defesa do hospedeiro contra a infecção por Salmonella, especialmente quando os mutantes genéticos não estão disponíveis. O gene autofagia bec-1 conhecido por estar envolvido na defesa contra a infecção por Salmonella é usada como um exemplo, no presente estudo. Mutações bec-1 é letal 21, o que impede a testar o seu papel na defesa contra a infecção por Salmonella em adultos. Usando o protocolo de corrente, foi mostrado que a inibição de bec-1 por RNAi produz a susceptibilidade a infecção por Salmonella em C. elegans. No presente estudo, N2 vermes de tipo selvagem fed com bactérias L4440 tem um tempo de vida semelhante ao de animais alimentados com OP50. Os animais começam a morrer por volta do dia 6 eo tempo máximo é de cerca de quatro semanas. Vermes N2 infectadas por Salmonella viver alguns dias mais curtos. Por contraste, bec-1 vermes tratados com RNAi infectadas com Salmonella morrem cerca de duas vezes mais rápido do que os animais de controlo, embora a data de início para os animais morrem em ambos os grupos é de apenas alguns dias de intervalo (Figura 2). Todo o experimento dura cerca de 1 mês.

Neste protocolo, a coordenação de alimentação RNAi e preparação Salmonella é necessária para que tratados com RNAi hermafroditas estágio L4 são submetidos a infecção por Salmonella. Um período típico do protocolo usado no laboratório dos autores é descrito na Tabela 1. Bactérias que se alimentam de RNAi são preparadas semanalmente e a cultura bacteriana é armazenado a 4 ° C quando não usado. É de notar, no dia 7, a infecção vai começar a 60; hr depois de Salmonella culturas durante a noite são colocadas em placas NGM. Durante este período de 6 horas, tratados com RNAi hermafroditas L4 N2 são escolhidos a partir de correspondente bec-1 e controlar placas RNAi vetores vazios. Os vermes não infectados são usados ​​como controles para determinar se a infecção de Salmonella encurta o tempo de vida de vermes infectados e, se bec-1 tratamento RNAi tem qualquer influência sobre verme vida.

Atualmente, a sobrevivência de C. elegans após a infecção é comumente usado para medir a virulência dos patógenos 3-5. No entanto, a inibição de RNAi de certos C. genes elegans resultar na diminuição da expectativa de vida. Portanto, deve-se ter cuidado na interpretação dos dados. Quando esta situação é encontrada, diferentes concentrações do composto indutor de RNAi, IPTG, pode ser testada para identificar a concentração desejada que influencia apenas a resposta do hospedeiro a infecções de agentes patogénicos, sem impacto sobre o tempo de vida dos animais. Como relatado anteriormente <sup> 10, à concentração de 1 nM de IPTG foi utilizado com sucesso para examinar o papel da autofagia em IGF-sinalização mediada resistência patógeno em C. elegans.

Dado que o C. elegans genoma foi seqüenciado e C. bibliotecas alimentação elegans ARNi foram gerados 16,18, é possível rever o protocolo descrito para realizar um rastreio de RNAi de todo o genoma para identificar todos os genes do hospedeiro envolvidos na defesa contra a infecção por Salmonella. Por exemplo, em vez de usar a sobrevivência mediana para medir a virulência de Salmonella, a sobrevivência máxima é usado. Além disso, os vermes infectadas podem ser esterilizadas, completando placas com fluorodesoxiuridina, um inibidor da síntese de ADN. Assim, a transferência de vermes infectados é desnecessária, desde que o alimento é fornecido para evitar vermes de fome. Estas alterações vão reduzir a carga de trabalho para uma tela de alto rendimento tremendamente. Este tipo de estudo em grande escala pode shed luz sobre a compreensão da resposta humana à infecção por Salmonella tantos caminhos biológicos em C. elegans são evolutivamente conservada em humanos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Diane Baronas-Lowell para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma FAU Charles E. Schmidt Faculdade de Ciências Grant Semente e uma bolsa Envelhecimento da Fundação Médica Ellison para KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

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