Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Resumen

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

Resumen

La piel es un tejido altamente heterogénea. Estructuras intra-dérmica incluyen los folículos pilosos, músculos erectores del pelo, especializaciones epidérmicas (tales como grupos de células de Merkel), glándulas sebáceas, nervios y terminaciones nerviosas y capilares. La disposición espacial de estas estructuras está estrechamente controlada en una escala microscópica - como se ve, por ejemplo, en la disposición ordenada de tipos de células dentro de un único folículo piloso - y en una escala macroscópica - como se ve por las orientaciones casi idénticas de miles de pelo folículos dentro de una región local de la piel. La visualización de estas estructuras sin seccionar físicamente la piel es posible debido a la geometría de 2 dimensiones de este órgano. En este protocolo, se muestra que la piel del ratón puede ser diseccionado, fijo, permeabilized, se tiñe y se aclaró como un objeto tridimensional intacta dos, un soporte plano. El protocolo permite la fácil visualización de las estructuras de la piel en su totalidad a través del grosor completo de grandes áreas de la piel por OPTseccionamiento y reconstrucción ical. Las imágenes de estas estructuras también se pueden integrar con la información acerca de la posición y orientación relativa a los ejes del cuerpo.

Introducción

La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo, con funciones importantes en somato-sensación, aislamiento / termorregulación, y la defensa inmune ^1. La comprensión de las bases moleculares y celulares del desarrollo y función de la piel le ha interesado desde hace mucho tiempo debido a la importancia fundamental de la piel como un sistema biológico y su importancia para la dermatología. Piel de los mamíferos contiene una variedad de estructuras multicelulares, incluyendo capas estratificadas de queratinocitos, tejido conectivo dérmico, varios tipos de folículos pilosos, glándulas sebáceas, músculos erectores del pelo, vasos sanguíneos, y al menos un....

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los animales fueron manejados de acuerdo a la atención de los animales institucional y el empleo aprobado (IACUC) Protocolo MO11M29 de las Instituciones Médicas Johns Hopkins. Consulte las pautas locales del Comité de Cuidado de Animales e Institucional para los métodos de eutanasia aprobados. Usar guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad al manipular fijadores aldehído o disolventes orgánicos.

1. Preparación de Materiales

1. Verter Placas SYL....

Resultados

De imágenes de campo claro de flatmounts piel se puede utilizar para imagen aferentes cutáneos sensoriales (Figura 3 A ¹⁰⁾ y los patrones de folículos capilares a base de melanina pigmentación (Figura 4). De formación de imágenes confocal de flatmounts de la piel se puede utilizar para definir la geometría de (1) grupos de células de Merkel, visualizadas con anti-citoqueratina-6 o con la absorción de colorante AM (figuras 3I-L), (2) los músculos erectores del.......

Discusión

El dominio de los métodos de disección descritos anteriormente sólo requiere paciencia, una mano firme, y algunas buenas herramientas de disección. La disección de la piel dorsal es relativamente fácil, pero los de la cola y de la piel del pie disecciones - especialmente en las edades postnatales tempranas - son más difíciles. A edades tempranas prenatales (por ejemplo, antes de E15), la piel es difícil de quitar sin romperlo. Convenientemente, para muchos estudios sobre el crecimiento y el patrón de las estruc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-bromo-4-cloro-indolil fosfato (BCIP)	Roche	11383221001
AM1-43	Biotium	70024
AM4-65	Biotium	70039
Alcohol bencílico	Sigma	402834
Bendicelo benzoato	Sigma	B-6630
Microscopio confocal	Zeiss	LSM700
Cy3-alfa músculo liso anticuerpo de actina	Sigma	C6198	1:400
Citoqueratina-8	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	TROMA-I-c	1:500
Microscopio
Herramientas de disección	Fine Science Herramientas		, tijeras y pinzas
Maquinilla de afeitar
Fluoromount G	EM Sciences	17984-25
Formalina	Sigma	HT501320
Platos de vidrio	Pyrex		6 cm y 10 cm de diámetro
Placas de vidrio	Amersham Biosciences	SE202P-10	10 cm x 8 cm x 1 mm
Depilador
Plataforma giratoria horizontal	Hoefer	PR250 Agitador
Alfileres para insectos	Fine Science Tools	26002-20
Ketamina/xilacina	Sigma	K113
Nitroblue tetrazolio (NBT)	Roche
Aceite Rojo O	Sigma	O0625
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Hojas de afeitar	VWR	55411-055
Anticuerpos secundarios	Invitrogen		Alexa-dye conjugado
Sylgard-184	Fisher Scientific	NC9020938
Placas			10 cm de diámetro
Placas de cultivo de tejidos de			6 y 12 pocillos

de disección, eléctricaNairorbital11383213001 de plástico para cultivo de tejidos de