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Artículo de método

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

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DOI:

10.3791/51751

⸱

8 de septiembre de 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

En este artículo

Resumen

Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Resumen

Las neuronas dopaminérgicas representan menos del 1% del número total de neuronas en el cerebro. Esta baja cantidad de neuronas regula importantes funciones cerebrales como el control motor, la motivación y la memoria de trabajo. Las neuronas dopaminérgicas nigroestriatal selectivamente degeneran en la enfermedad de Parkinson (PD). Esta pérdida neuronal progresiva está inequívocamente asociada con los síntomas motores de la patología (bradicinesia, temblor en reposo, rigidez muscular y). El principal agente responsable de la degeneración de neuronas dopaminérgicas es aún desconocido. Sin embargo, estas neuronas parecen ser muy vulnerables en diversas condiciones. Los cultivos primarios constituyen uno de los modelos más relevantes para investigar las propiedades y características de las neuronas dopaminérgicas. Estas culturas se pueden enviar a varios agentes de estrés que imitan patología PD y para compuestos neuroprotectores para detener o ralentizar la degeneración neuronal. Los numerosos modelos de ratones transgénicos de PD que han sido generATED durante la última década se incrementó aún más el interés de los investigadores por cultivos de neuronas dopaminérgicas. En este caso, el protocolo de vídeo se centra en la delicada disección de cerebro de ratón embrionarias. La escisión precisa del mesencéfalo ventral es crucial para obtener cultivos neuronales suficientemente ricos en células dopaminérgicas para permitir estudios posteriores. Este protocolo puede ser realizado con ratones transgénicos embrionarias y es adecuado para la tinción de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa, la cuantificación segundo mensajero, o la evaluación de la muerte / supervivencia neuronal.

Introducción

La dopamina, uno de los neurotransmisores cerebrales esenciales 1,2, se libera principalmente por dopaminérgicas del cerebro medio (DA), las neuronas. La mayoría de las neuronas DA residen en la parte ventral del mesencéfalo 2-6. Esquemáticamente, las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio se pueden dividir en tres anatómica y funcionalmente distintos sistemas de proyección: mesostriatal, mesolímbico y vías mesocorticales 2,5. La vía nigroestriatal está implicado en el comportamiento motor, las vías mesolímbico juegan un papel importante en el refuerzo, la motivación y el aprendizaje, mientras que las vías dopaminérgicas que se proyectan hacia la corteza prefrontal están implicados en la cognición 2.

Neuronas DA están implicados en varios trastornos neurológicos humanos tales como la esquizofrenia, déficit de atención, trastorno de hiperactividad, y la enfermedad de Parkinson (PD) 2,4. PD se caracteriza por una degeneración progresiva y selectiva de las neuronas DA de conexión sustancia negrapars compacta (SNC) a el cuerpo estriado. La pérdida de nigro-estriatal neuronas DA resultados en grave agotamiento de la dopamina en el cuerpo estriado que es responsable de los síntomas motores de la EP (bradicinesia, temblor de reposo, y la rigidez) 7. La causa inicial de la idiopática PD no se ha establecido y los tratamientos actuales sólo son sintomáticos, con el objetivo de restauración del nivel de dopamina en el cuerpo estriado. El fármaco más prescrito es la L-Dopa (Levodopa), el precursor natural de la dopamina. Aunque la administración de levodopa compensa la pérdida de dopamina durante un cierto tiempo, las complicaciones motoras se producen después de los tratamientos a largo plazo (discinesia y estados activado / desactivado) 8,9.

La investigación sobre las neuronas dopaminérgicas y PD está en constante progresión y se están realizando intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos basados ​​en el trasplante de células, la terapia génica, o agentes neuroprotectores 10,11. Sin embargo, un problema importante sigue siendo no dilucidado: ¿cuál es la causa de la extrema Vulnerability de neuronas DA? Parte de la respuesta se puede encontrar en la actividad de las neuronas dopaminérgicas. Una reducción en la actividad eléctrica y de la excitabilidad de las neuronas DA parece aumentar su propensión a degenerar 12. Sin embargo, la complejidad de la EP patogénesis requiere más estudios para identificar los mecanismos implicados en la degeneración de neuronas DA 13-15.

Los cultivos primarios son especialmente relevantes para el estudio de las propiedades de las neuronas DA 16-19 y el de impugnar estas neuronas a varios tipos de estrés para la evaluación de agentes neuroprotectores 20-24. Se utilizan más a menudo modelos de cultivo de rata, como la disección de mesencéfalo de embriones de rata es más fácil, en comparación con el ratón, y cantidades más altas de las neuronas se pueden obtener en la rata. Sin embargo, la generación de modelos de ratones transgénicos de la enfermedad 25 ha aumentado considerablemente el interés de la comunidad neurocientífica para cultivos primarios de ratón 26-29. Aunque las culturas prepared de los animales recién nacidos puede ser utilizado, es mejor para prepararlos a partir de embriones en la etapa de post-mitótico (E13.5 para las neuronas de mesencéfalo), cuando las neuronas han conservado su capacidad de diferenciarse. El siguiente protocolo presenta mesencéfalo neuronas aisladas en cultivo primario a partir de embriones de ratón (E13.5), que son los más difíciles de preparar. En particular, se proporciona un protocolo de uso de medio de cultivo libre de suero para una mejor reproducibilidad. Los dos pasos más importantes en la preparación de la cultura (disección y disociación mecánica) se detallan cuidadosamente en el vídeo asociado.

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Protocolo

Los ratones utilizados en este trabajo fueron atendidos y manejados de acuerdo con las directrices del Consejo de la Unión Europea (86/609 / UE) para el uso de animales de laboratorio.

1 Preparación de soluciones requeridas

  1. Soluciones de archivo
    1. 10x poli-L-ornitina (OLP) Solución: Pesar 10 mg de bromhidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) y disolver en 70 ml de agua estéril. Se filtra la solución con 0,2 micras filtro de jeringa, alícuota, y se almacenan a -20 ° C.
    2. 30% solución de glucosa: pesar 30 g de D (+) - Glucosa y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
    3. Medio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / mezcla de nutrientes F-12 de Ham: Pesar de 6 g de polvo de DMEM / F-12 de jamón y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
    4. 7,5% de bicarbonato de sodio (NaHCO3) Solutien: Pesar 7,5 g de NaHCO3 y se disuelven en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
    5. 1 M HEPES Solución: Pesar 23,8 g de HEPES y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
    6. 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto con 30 ml de agua estéril.
  2. PBS con glucosa y antibióticos (PBS-GAB): añadir 10 ml de solución de glucosa al 30% y 5 ml de solución de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline. Almacenar a 4 ° C.
  3. Fetal inactivado de suero bovino (IFB): Descongelar de suero bovino durante la noche a 4 ° C e inactivar a 56 ° C durante 30 min. Alícuota en 50 ml y se almacena a -20 ° C.
  4. Medio de Cultivo: En agua estéril, se mezclan sucesivamente 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glucosa unnd 3 ml de 7.5% de NaHCO3 a un volumen final de 180 ml. Filtrar y utilizar el mismo día.
  5. Hormona Mix
    1. Preparar 180 ml de medio de cultivo. Disolver 200 mg de apo-transferrina en este medio.
    2. Pesar 50 mg de insulina y disolver en 2 ml de HCl 0,1 M. Añadir lentamente 8 ml de agua estéril mientras se mezcla suavemente. Diluir esta solución en el medio de cultivo.
    3. Pesar 19,3 mg de dihidrocloruro de putrescina y disolver en 10 ml de agua estéril. Añadir la solución de 10 ml a la mezcla de la hormona.
    4. Preparar una solución de selenito de sodio 3 mM en agua estéril y una solución de progesterona 2 mM en etanol absoluto. Añadir 20 l de cada solución a la mezcla de la hormona.
    5. Se filtra la mezcla de hormonas, alícuota de 10 ml y se almacena a -20 ° C.

2 Preparación de las placas e instrumentos Cultura

  1. FBS Recubrimiento de las placas de cultivo: El día antes de la disección, preparar 180 ml de medio de cultivo. Añadir 10 ml deIFB a 90 ml de medio de cultivo. Añadir 300 l / pocillo de medio de cultivo / 10% IFB en precubiertas placas de 24 pocillos de poli-D-lisina. Incubar toda la noche a 37 ° C. Almacenar los residuos de medios (con y sin OFI) a 4 ° C.
  2. Esterilizar los instrumentos y pipetas Pasteur. Reúna el equipo listado en la tabla de materiales, así como una campana de flujo laminar clase II y una incubadora de CO 2.

3. Disección de Ratón Mesencéfalo

  1. Sacrificar un ratón embarazada E13.5 (según las directrices institucionales). Limpiar el abdomen del ratón con etanol al 70% y abrir la pared del abdomen. Recoge los cuernos uterinos, abrirlas con unas tijeras delicadas, diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos, y quitar las membranas amnióticas. Coloca los embriones en una placa de Petri de 100 mm que contiene PBS estéril-GAB y lavarlos por transferencia en 3 baños idénticos sucesivos utilizando pinzas. Para la disección, colocar los embriones en un 3 en un 60 mm placa de Petri estéril.
  2. Move el plato final Petri bajo el microscopio estereoscópico. No decapitar a los embriones. Con unas tijeras Vannas, extirpar el cerebro.
    1. Retire con cuidado y deseche las regiones previsiones y cerebro posterior. Para el lado rostral, cortar cerca de la región talámica, a la corte lateral caudal en la región del istmo, retire el colículo superior.
    2. Una vez que el cerebro medio ventral está aislado, retire con cuidado meninges utilizando fórceps ultrafinas. Recoge los segmentos disecados, sin las meninges, en un tubo de 13 ml estéril llena de PBS-GAB.
  3. Limpie el tubo que contiene la mesencephala a fondo con etanol al 70% y ponerla bajo el capó.

Disociación 4. Cell

  1. Lave mesencephala 3x con PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos cerebrales se asienten entre cada lavado y evitar la interrupción del tejido. Después del último lavado, eliminar cuidadosamente como cantidad posible de solución e incubar segmentos cerebrales en 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C en unCO 2 incubadora.
  2. Fuego-pula las pipetas Pasteur para maximizar la supervivencia de las neuronas como el final de una pipeta de vidrio no pulida es fuerte y puede dañar las células durante las etapas de disociación. Ligeramente reducir el diámetro de la extremidad (hasta 0,5 mm) de la pipeta Pasteur, mientras que el fuego-pulirlo.
  3. Retire con cuidado tanto / EDTA solución tripsina como sea posible y añadir 10 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Segmentos cerebrales Lave 3 veces con medio de cultivo / 10% IFB.
  4. Usando la pipeta Pasteur pulida al fuego, comience disociación de mesencephala en 6 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Triturar 10x (evitar las burbujas de aire), permiten que los trozos se asienten, a continuación, recoger el medio en un nuevo tubo estéril 13 ml.
  5. Añadir 6 ml de medio de cultivo, repita el paso anterior una vez y recoger el medio que contiene células disociadas en el mismo tubo de 13 ml.
  6. Centrifugar las células a 160 g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo suplementado conMezcla de la hormona 10%.

5. Cell Plating

  1. Contar las células en suspensión en una célula de Malassez y ajustar el volumen del medio a una concentración de 600.000 células / ml. Alrededor de 1,7 millones de células se pueden obtener de un mesencéfalo ratón.
  2. Retire que contenía FBS medio de revestimiento de placas de 24 pocillos y añadir en cada pocillo 1 ml de la suspensión celular (600.000 células / pocillo, el 2-4% de las células TH +).
  3. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO 2/95% de aire. No es necesario cambio de medio. Las neuronas dopaminérgicas son maduros después de unos 5-7 días in vitro (expresión coherente del transportador de dopamina). Mantener las células en cultivo hasta 15 días sin reemplazo medio.

Protocolo 6. inmunofluorescencia

  1. Limpieza de las Cubreobjetos
    1. El día antes de la disección, agregar 10 ml de HCl 1 M en una placa de Petri. Coloque en la superficie de las 12-15 cubreobjetos de vidrio líquido y esperar 15 min.
    2. Hunde la cubiertacaer en el líquido y esperar 15 min.
    3. Retire HCl y lavar 3 veces con agua.
    4. Lavar los cubreobjetos con etanol puro rápidamente una vez, a continuación, añadir etanol puro al plato y esperar 30 min.
    5. Bajo el capó, retire cubreobjetos limpios a partir de etanol y añadir 1 cubreobjetos por pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos usando fórceps esterilizados.
    6. Lavado cubreobjetos dos veces con agua estéril (1 ml / pocillo). A continuación, lavar una vez con PBS estéril.
  2. Recubrimiento de los cubreobjetos
    1. Retirar PBS y añadir 500 l / pocillo de 2x OLP (diluido en PBS). Incubar durante 4 horas a 37 ° C en la incubadora de CO 2.
    2. Eliminar la solución de la OLP y lavar 3 veces con PBS estéril.
    3. Retire PBS y añadir 500 l / pocillo de 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubar toda la noche a 37 ° C en la incubadora de CO 2.
  3. Plating las células para inmunofluorescencia
    1. Retire medio de revestimiento de placas de 12 pocillos.
    2. Añadir 900,000 células / pocillo en 2 ml de volumen y hacer crecer las células a 37 ° C en la incubadora. Las células se pueden mantener en cultivo de hasta 15 días sin reemplazo medio.
  4. La inmunotinción
    1. Retire medio de placas de 12 pocillos y lavar con 500 l / pocillo DMEM precalentado a 37 ° C.
    2. Añadir 500 l / pocillo de DMEM precalentado a 37 ° C, a continuación, añadir con cuidado 160 l / pocillo de 8% de paraformaldehído (PFA, concentración final del 2%) y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
    3. Eliminar PFA y lavar 3 veces con PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
    4. Retirar PBS, añadir 300 l / pocillo de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de suero de cabra y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
    5. Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo primario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios que se pueden utilizar para la detección de las neuronas dopaminérgicas y caracterización de la cultura se indican en la Tabla de Materiales. Mantenga1 bien sin anticuerpo primario para evaluar para el fondo de los diferentes anticuerpos secundarios.
    6. Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
    7. Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo secundario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, en la oscuridad. Secundaria anticuerpos utilizados se indican en la tabla de Materiales.
    8. Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
    9. Retire medio y lavar 3 veces con PBS.
    10. Montar los cubreobjetos en el lado diapositivas celda de vidrio en una gota de VectaShield. Mantenga las diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el montaje medio seco, y luego almacenarlas a 4 ° C.
    11. Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal o un microscopio de contraste de fase equipado para epifluorescencia. Imágenes representativas fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica SP2 UV.

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Resultados

Un diagrama de flujo que ilustra los pasos de cultivo mesencéfalo se muestra en la Figura 1. Brevemente, después de la recolección de embriones E13.5 de un ratón suizo embarazada, mesencéfalo ventral se diseca de todo el embrión. Los fragmentos cerebrales aisladas se someten sucesivamente a la digestión enzimática y disociación mecánica. Las células disociadas se sedimentan por centrifugación, se resuspendieron en medio de cultivo y se sembraron en placas de 12 o 24 pocillos pre-revestido. Las células s...

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Discusión

Este protocolo presenta los procedimientos y reactivos necesarios para preparar un cultivo primario de neuronas mesencefálicas desde el ratón embrionario y el procedimiento de inmunofluorescencia para detectar las neuronas dopaminérgicas. Los pasos críticos del procedimiento son la disección de los embriones y la disociación mecánica de los fragmentos del cerebro recogidos. Instrumentos de disección de alta calidad ayuda a dominar la técnica de disección. Neuronas DA constituyen una pequeña proporción de mesencéfalo. Po...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Financiado por subvenciones del CNRS y del INSERM. El primer ministro agradece el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC agradece el apoyo de la Fondation de France.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Suero fetal bovinoLonza14-801F
DMEM 4,5 g/L de glucosa con L-glutaminaLonza BE12-604F
0,05% Tripsina-EDTA (1x), rojo fenolLife Technologies25300-054
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)Life Technologies15140122
L-Glutamina, solución de 200mM Life Technologies
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfatoSigma-Aldrich D8537
Dulbecco' s Águila Modificada' s Mezcla Media/Nutriente F-12 JamónSigma-Aldrich D0547
Laminina en polvo - 1 mg/ml en NaCl tamponado TrisSigma-Aldrich L2020
Hidrobromuro de poli-L-ornitinaSigma-Aldrich  P3655
Insulina de páncreas porcinoSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin humanoSigma-Aldrich T1147
Cimlorhidrato de putrescinaSigma-Aldrich P5780
ProgesteronaSigma-Aldrich P8783
Selenito de sodioSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlicinaSigma-Aldrich G7126Solución madre 1 M en agua
GelatinaSigma-Aldrich G9391Solución madre al 2% (p/v) en agua
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehído 16% en aguaCiencias de la Microscopía ElectrónicaRT 15710-S
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glucosa, monohidratoMerck Millipore4074-2
Ácido clorhídrico - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Agua estéril - Aqua B.Braun Braun Braun
Etanol absoluto NORMAPUR reactivo analíticoVWR20821.321
Placas de Petri estérilesVWR82050-566
Pipetas Pasteur vidrio liso - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Cámara de recuento MalassezVWR631-0975
Filtro de jeringa Acrodisc de suero con membrana Supor, estéril, GF/0,2 y micro; m, 37 mmPALL Life Science4525
Tijeras quirúrgicas - Rectas, afiladas-afiladas, de 14,5 cmde largo Fine Science Tools14002-14Para abrir la pared abdominal
Tijeras - Rectas, puntiagudas, delicadas, de 10 cm de largoMORIA4877APara abrir la pared uterina
Pinzas - Mandíbulas curvas, habituales, dentadas 1 mmMORIA2183Para manipular embriones
Tijeras Vannas - Hojas curvas, puntiagudas, de 7 mmMORIAMC50Para sacar el mesencéfalo
Pinzas ultrafinas - Curvas, delicadas, 13 cm de largoMORIA9987Para eliminar las meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine Placas multipocillos de 24 pocillosBD Bioscience356414
BD Falcon Placa de cultivo celular de 12 pocillos, fondo plano con tapaBD Bioscience353043
Portaobjetos de microscopio SuperFrost, bordes rectificados 90ºMENZEL-GLÄ SERAG00008032E
Cubreobjetos de precisión espesor Nº 1,5H circular 18 mm ØMARIENFELD117580
Anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2)Chemicon MilliporeAB56221/200
Anticuerpo monoclonal anti-glutamato descarboxilasa (GAD67) de ratón, clon 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Anticuerpo monoclonal anti-transportador de dopamina (DAT) de rata, clon DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Anticuerpo1/8.000 - Generoso regalo de Yves Charnay (Suiza, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Suero de Cabra, Nueva Zelanda OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Cabra Anticuerpo Anti-Conejo IgG (H+L)Life TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG (H+L) AnticuerpoLife TechnologiesA-110011/1.000
Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Rata IgG (H+L)Anticuerpo Life TechnologiesA-110071/1.000
VECTASHIELD HardSet Medio de montajeVector LaboratoriesH-1400
Microscopioestereoscópico Carl ZeissStemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOYVWR451-0136
25030123 monoclonal anti-5-HT para ratón

Referencias

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