Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo Salmonella enterica Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Resumen

Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.

Resumen

Especies de Salmonella son patógenos zoonóticos y principales causas de las enfermedades transmitidas por los alimentos en los seres humanos y el ganado ^1. La comprensión de los mecanismos que subyacen a las interacciones Salmonella -host son importantes para dilucidar la patogénesis molecular de la infección por Salmonella. El ensayo de protección de Gentamicina fenotipo asociación Salmonella, la invasión y la replicación en las células fagocíticas fue adaptado para permitir la selección de alto rendimiento para definir las funciones de los mutantes de deleción de Salmonella enterica serotipo Typhimurium en las interacciones huésped utilizando RAW 264,7 macrófagos murinos. Bajo este protocolo, la varianza en las mediciones se reduce significativamente en comparación con el protocolo estándar, porque de tipo salvaje y cepas mutantes múltiples pueden ser probados en la misma placa de cultivo y, al mismo tiempo. El uso de pipetas multicanal aumenta el rendimiento y mejora la precisión. Además, las preocupaciones relacionadas con el uso de menos hose trataron células st por pocillo en 96-así placa de cultivo. En este caso, el protocolo de la vitro Salmonella ensayo modificado en la invasión utilizando células fagocíticas se empleó con éxito al fenotipo 38 mutantes de deleción Salmonella individuales para la asociación, la invasión y la replicación intracelular. Se presentan los fenotipos in vitro, algunos de los cuales fueron posteriormente confirmó que en fenotipos in vivo en un modelo animal. Por lo tanto, la modificación, ensayo estandarizado fenotipo Salmonella asociación, la invasión y replicación en macrófagos con capacidad de alto rendimiento podría ser utilizado más ampliamente para estudiar las interacciones huésped-bacteriana.

Introducción

No tifoidea Salmonella son causas importantes de enfermedades entéricas en todos los vertebrados. La salmonelosis en los seres humanos es una de las principales enfermedades transmitidas por los alimentos bacterianas ^1. Caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones de Salmonella con sus huéspedes animales se logra principalmente a través del estudio de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (STM) en cultivo de tejidos y modelos animales de infección. Obtener ideas en las interacciones huésped-STM nos ayudará a entender cómo Salmonella sobrevivir y crecer dentro de las células huésped. E....

Protocolo

1. murino macrófagos RAW264.7 Cell Culture

1. Crecer bajo número de pasos células de macrófagos murinos, RAW264.7 (el número ATCC ^®, TIB-71) en un matraz de cultivo celular ventilado tapa T-75 de filtro en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) , 0,5% de _NaHCO3, y el 1% 100x Los aminoácidos no esenciales (AANE) a 37 ° C, en un incubador de _CO2 al 5%.
2. Una vez que las células alcanzan una confluencia del 60-80% en el matraz, utilizar un rascador de células para cosechar las células, y contar las células en un hemocitómetro y calcular la concentración de células.
....

Resultados

Ver resultados representativos (Figura 2) después de que los datos que se muestran en base al ensayo de invasión celular fagocítica modificado. Los datos incluyen cinco cepas diferentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A y B. mutante Δ Inva, conocido por ser defectuoso para la invasión, y ΔphoP conocidos por ser defectuoso para la replicación ^8, se utilizaron como controles positivos para evaluar la validez experimental . En efecto, en el ensayo de invasión modificado, un.......

Discusión

El ensayo de protección de gentamicina se utiliza ampliamente para estudiar la invasión y la replicación de patógenos bacterianos intracelulares dentro de la célula huésped, y es especialmente una herramienta biológica importante para el estudio de los patógenos, como Salmonella, cuya invasión es el paso requisito previo para el establecimiento de la infección ^1. El ensayo estándar de protección de gentamicina en la comunidad de investigación de Salmonella se implementa en 24 pocillos placa .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Suero fetal bovino	HyClone	SH30910.03
T-75 Matraz de cultivo celular tapón de filtro ventilado	Nest Biotechnology	708003
100x Aminoácidos no esenciales	Life Technologies	11140
Raspador de células	BD Falcon	353086
Placa de cultivo celular de 96 pocillos	Corning Incorporated	3595
Caldo Luria-Bertani (LB)	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Tubo de polipropileno de fondo redondo	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamicina solución	Sigma	K0254
Gentamicina solución	Sigma	G1272
0.25% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25200
Azul de tripano	Sigma	T8154