Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Summary

Aquí presentamos un método simple y rápido para caracterizar las propiedades adhesivas intrínsecas de las moléculas de adhesión celular putativas. El ectodominio secretado y marcado con epítopos de una molécula de adhesión celular se captura del medio de cultivo en perlas funcionalizadas pequeñas y uniformes. Estas perlas se pueden utilizar inmediatamente en ensayos simples de agregación de perlas.

Abstract

La adhesión célula-célula es fundamental a la vida multicelular y está mediada por una serie diversa de proteínas de la superficie celular. Sin embargo, las interacciones adhesivas para muchas de estas proteínas son poco conocidos. Aquí se presenta un método simple, rápido para la caracterización de las propiedades adhesivas de moléculas de adhesión celular homofílicas putativos. Células HEK293 cultivadas se transfectaron con el plásmido de ADN que codifica un secretada, ectodominio epítopo de etiquetado de una proteína de la superficie celular. El uso de perlas funcionalizados específicos para la etiqueta de epítopo, la proteína de fusión soluble, secretada es capturada del medio de cultivo. Las perlas recubiertas se pueden utilizar directamente en ensayos de agregación de talón o en grano fluorescente de clasificación ensayos para probar la adhesión homophilic. Si se desea, la mutagénesis se puede entonces utilizar para dilucidar los aminoácidos o dominios específicos requeridos para la adhesión. Este ensayo requiere sólo pequeñas cantidades de proteína expresada, no requiere la producción de líneas celulares estables, y se puede ACCOmplished en 4 días.

Introduction

Adhesión célula-célula es esencial para el desarrollo y la integridad de los organismos multicelulares y es mediada por un conjunto diverso de moléculas de superficie celular. Muchas de estas moléculas de adhesión se han identificado y caracterizado, aunque muchos aún no se han descubierto. Se utilizan varios métodos para investigar las propiedades de las moléculas de adhesión celular (CAMs), incluyendo ensayos de clasificación de células, ensayos de agregación celular ^1-8 y métodos biofísicos, tales como la microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza de superficie ^9-12.

La complejidad de incluso simplificada en sistemas in vitro utilizando líneas celulares hace que sea difícil determinar las propiedades adhesivas de una CAM putativo. Típicamente, una molécula se considera una CAM si induce la agregación de células cuando se transfecta en una línea celular no adhesiva. Sin embargo, está claro que esto no es evidencia directa de la actividad de adhesivo. Por ejemplo, facilitar la entrega de la superficie celular o la estabilidad de unCAM también se traduciría en un aumento de la agregación de células ^1,13. Por otra parte, una verdadera CAM puede fallar para mediar en la agregación de células si la línea celular carece de otros co-factores necesarios para la entrega de la superficie celular o la estabilización.

Para evitar estos factores que complican, los ensayos más directos pueden ser empleadas que se basan en la idea de que las interacciones adhesivas deben ser una propiedad bioquímica intrínseca del dominio extracelular. Mientras que los granos fueron utilizados inicialmente para caracterizar Ng-CAM ^2, estos ensayos se han ampliado con el fin de investigar la adhesión mediada por cadherina ^12,14,15. Uso de fusión de las fusiones C-cadherina ectodominio-Fc, el laboratorio Gumbiner mostró que múltiples repeticiones de cadherina contribuyen a las interacciones homofílicas ^14. Usando ensayos de agregación del grano comparables, E-cadherina y de adhesión N-cadherina también se han caracterizado ^12,15, como tener un número de protocadherins ^1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila ^19. Aquí se describe un ensayo relativamente simple y rápido para la caracterización de la actividad adhesiva de secretadas, ectodominios etiquetadas con epítopo de CAMs homofílicas putativo (Figura 1). Hemos usado este ensayo principalmente para caracterizar los miembros de la superfamilia de cadherina.

Protocol

1. Cell preparación (Día de -2 a 0)

1. Dividir celdas HEK293 1: 5 utilizando solución de tripsina-EDTA 0,05% y se incuban en medios de crecimiento a 37 ° C con 5% de CO ₂ hasta 60 - 80% de confluencia (2-3 días). Para cada condición, células de cultivo en 2 x 100 mm platos.

2. transfección celular (Día 1)

1. Transfectar células HEK293 con plásmido que codifica Fc-fusion utilizando un reactivo de transfección como Lipofectamine. Los métodos alternativos que resultan en eficiencias de transfección comparables también pueden ser utilizados.
2. Volver células transfectadas a la incubadora durante 24 horas.

3. Cell Propagación (Día 2)

1. Precaliente el crecimiento de medios sin suero bovino fetal (FBS) al 37 ° C.
2. Lavar platos 2x con 10 ml Growth Medios FBS, y devuelven los platos a la incubadora a 37 ° durante 1 hora.
3. Enjuague la culturas platos una vez más con 10 ml Growth Medios FBS, para un total de 3 lavados.
4. Incubate las células HEK293 transfectadas a 37 ° C durante otras 48 horas sin FBS antes de recoger los medios de comunicación.

4. bolas Aggregation (Día 4)

1. Para recoger los medios de comunicación a partir de placas de cultivo, transferir los medios de comunicación de cada par de platos para 50 ml tubos cónicos y centrifugado a 500 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares.
2. Los medios de filtro de 50 ml tubo cónico de centrífuga en un filtro utilizando una jeringa de 30 ml y 0,45 micras filtro de jeringa.
3. Girar filtros centrífugos a 4.000 xg y 4 ° C hasta que el volumen de medios de cultivo concentrado es de aproximadamente 500 l (aproximadamente 15 min). Repita hasta que haya agregado todos los medios de cultivo y se concentró.
4. Añadir 1,5 l de perlas magnéticas proteína G a 1 ml de tampón de unión enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada muestra, el lugar en un imán y eliminar el tampón. Inmediatamente después, añadir el medio de cultivo concentrado a la proteína G perlas magnéticas.
5. Girar los tubos a 4 ° C durante 2 horas.
6. Pltubos as en un imán y eliminar los medios de comunicación. Lavarse rápidamente perlas dos veces con frío hielo 1 ml de tampón de unión, y luego volver a suspender cuentas en 300 l de tampón de unión.
7. Dividir volvió a suspender cuentas en 2 tubos, 150 l en cada tubo, y luego añadir 1,5 l de CaCl ₂ mM o 200 mM EDTA 200 para la condiciones "no" calcio "calcio", y, respectivamente.
8. Transferencia de 100 l de cada condición a una depresión bien deslice y recoger micrografías utilizando un microscopio de luz transmitida (Figura 2). Recoger imágenes de 5 campos de visión para cada experimento en cada punto de tiempo deseado.

Análisis 5. Datos

1. Usando ImageJ, o software de análisis de imagen comparable, abra uno de los cinco conjuntos de datos de imágenes utilizando la Importación / Secuencia de imágenes ... en el menú desplegable Archivo. Éstas se abrirán como de pilas de imágenes.
2. En el cuadro de diálogo ... Imagen / Propiedades, cambie la iunidades de magos a píxeles y establecer pixel Ancho y Altura en hasta 1,0.
3. Convertir las imágenes a binario utilizando el / Umbral Ajuste ... comando en el menú desplegable de imagen. Establecer el umbral para incluir píxeles que contribuyen a cuentas o agregados de cuentas, pero que excluye fondo y las partículas pequeñas. Aplicar a todas las imágenes de la pila.
4. En el cuadro de diálogo Medidas Set, seleccione las casillas de la zona y de pila de posición.
5. Ejecute Analizar Partículas ... en el menú desplegable Analizar. Esto generará una lista de partículas identificadas, incluyendo su tamaño (área) y la imagen en la que se identificaron.
6. Repita este proceso para el que experimento y la condición experimental.

Results

Un ejemplo experimento se presenta en la Figura 2, que muestra la agregación de talón dependiente de calcio por el ectodominio de N-cadherina fusionada a Fc (NcadEC-Fc). En ausencia de calcio, perlas exhiben poca o ninguna tendencia a agregarse y no hay aumento en tamaño de los agregados con el tiempo (Figura 1A, C). En presencia de calcio, perlas recubiertas con NcadEC-Fc muestran robusta agregación, con el aumento de tamaño de los agregados en el tiempo (Figura 1B, C).

Discussion

La adhesión celular es una característica esencial de la vida multicelular y está mediada por una amplia gama de proteínas de la superficie celular. De estos, se entienden las propiedades adhesivas detalladas por sólo una proporción relativamente pequeña. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y rápido para la investigación de la capacidad adhesiva homophilic de ectodominios secretadas fusionados con un cómodo marcador de epítopo. Este enfoque tiene una serie de ventajas importantes. En primer lugar, no se requieren...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFc-N1 plásmido	Addgene	A enviar
HEK293 células	Colección de cultivo tipo americano	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0.05% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads – Proteína G	Life Technologies	10003D
Albúmina sérica bovina	Sigma	A3294
Portaobjetos de depresión	Microscopía Electrónica Sciences	71878-06
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10	Millipore	UFC901024
filtro de jeringa de 0,45 mm	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Fiji (ImageJ) Software de análisis de imágenes	http://fiji.sc/Fiji
Tabla de tampones/soluciones
Medios de crecimiento	DMEM + 10% FBS + Filtro Pen-Strep	esterilizar y almacenar a 4 °C.
Medios de crecimiento – FBS	DMEM + Pen-Strep	Filter esterilizar y almacenar a 4 °C.
Tampón de unión	50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA	Vórtice hasta que se disuelva, mantener en hielo.