Abstract
Microscopia a singola molecola sta emergendo come un potente approccio per analizzare il comportamento delle molecole di segnalazione, in particolare per quanto riguarda quelli di aspetto (ad es., Cinetica, la coesistenza di diversi stati e popolazioni, interazioni transienti), che sono in genere nascosti nelle misure Ensemble, come quelli ottenuti con metodi biochimici o microscopia standard. Così, eventi dinamici, quali le interazioni recettore-recettore, possono essere seguite in tempo reale in una cellula vivente con alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo descrive un metodo basato sulla marcatura con fluorofori organici piccoli e luminosi e riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia di visualizzare direttamente singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi. Questo approccio permette di localizzare con precisione i recettori, misurare la dimensione dei complessi recettoriali e catturare gli eventi dinamici come le interazioni recettore-recettore transitori. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come perform un esperimento singola molecola, compresa la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e l'analisi delle immagini. Come esempio, l'applicazione di questo metodo per analizzare due proteine G recettori, cioè., Β 2-adrenergici e γ-aminobutirrico tipo B acido (GABA B) recettore, viene segnalato. Il protocollo può essere adattato ad altre proteine di membrana e modelli cellulari diversi, metodi di trasfezione e strategie di etichettatura.
Introduction
Recettori situati sulla superficie cellulare percepire l'ambiente extracellulare e rispondono a una varietà di stimoli, come odoranti, ioni, piccole e grandi neurotrasmettitori ormoni proteici. La fluidità delle membrane cellulari consente movimenti di recettori e altre proteine di membrana. Ciò è essenziale per la formazione di complessi proteici e il verificarsi di interazioni proteina-proteina transitori, come quelli utilizzati da recettori per assemblare in unità funzionali e trasdurre segnali nell'interno delle cellule. Ad esempio, G-proteine-recettori accoppiati (GPCR), che costituiscono la più grande famiglia di recettori di superficie cellulare 1, sono stati proposti per formare di-/oligomers, che sembra essere coinvolto nella regolazione messa a punto di trasduzione del segnale e potrebbe avere importanti conseguenze fisiologiche e farmacologiche 2-5.
Microscopia singola molecola ha il grande potenziale di visualizzare direttamente con l'alta spatiotemprisoluzione orale il comportamento dinamico dei singoli recettori situati sulla superficie delle cellule viventi, compresi loro associazione per formare dimeri e complessi molecolari ordine superiore 6-10. Questo offre diversi vantaggi rispetto ai metodi biochimici e microscopia standard, che di solito riportano il comportamento medio di migliaia o milioni di molecole.
Etichettatura proteina con un fluoroforo sufficientemente luminoso e fotostabili è essenziale per microscopia singola molecola. Questo protocollo sfrutta il tag SNAP recentemente introdotto 11 per collegare in modo covalente fluorofori organici piccole e luminose ai recettori della superficie cellulare. SNAP è un kD tag 20 proteine derivate da l'enzima O alchiltransferasi umano 6-alkylguanine-DNA riparazione del DNA, che può essere irreversibile etichettato con fluoroforo-coniugato benzylguanine (fluoroforo-BG) derivati. CLIP, un tag ulteriormente ingegnerizzato derivato da SNAP, può essere invece etichettato con fluoroforo-cDerivati benzylcytosine onjugated 12.
Il protocollo riportato in questo manoscritto spiega come transfettare e l'etichetta SNAP-tagged 11 recettori con piccole fluorofori organici e utilizzare riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) microscopia a visualizzare singoli recettori o complessi recettore sulla superficie delle cellule viventi 10. I risultati del protocollo riportati in> 90% di efficienza etichettatura di un extracellulare SNAP-tagged proteine della superficie cellulare 10. Ulteriori informazioni su come utilizzare dati singola molecola di analizzare la dimensione e la mobilità dei complessi recettoriali, nonché per catturare le interazioni recettore-recettore transitori, è fornito. Un flusso di lavoro schematicamente l'intero protocollo è data in Figura 1. Come esempio, la trasfezione di ovaio di criceto cinese (CHO) con-G recettori accoppiati alla proteina SNAP-tag (GPCR) seguita da marcatura con un derivato fluoroforo-BG come nonché la sua applicazione alla quantify e il monitor del recettore di-/oligomerization sono descritti. Questo protocollo può essere estesa ad altre proteine della superficie cellulare e tag fluorescenti (ad es., CLIP), così come ad altri metodi di trasfezione e di etichettatura.
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Pulizia Coverslip
NOTA: Lavorare sotto una cappa aspirante.- Utilizzare pinzette pulite per posizionare vetrini (diametro 24 mm) in un vetrino porta che separa le singole lamelle.
- Mettere il supporto con vetrini in un bicchiere e aggiungere cloroformio fino a quando i coprioggetti sono coperti. Coprire il becher con foglio di alluminio per ridurre l'evaporazione e ultrasuoni in un bagno sonicatore per 1 ora a RT. Prendete il titolare vetrino fuori del bicchiere e lasciare i coprioggetti asciutto.
- Ripetere passo 1.1.2 con la soluzione di NaOH 5M invece di cloroformio.
- Estrarre il porta vetrino in una nuova becher e lavare tre volte con acqua distillata. Mettere coprioggetti puliti in una piastra di coltura cellulare di vetro riempito con 100% di etanolo.
- Preparazione dei campioni di taratura
- Sciogliere colorante fluorescente in solvente appropriato.
- Preparare una diluizione seriale 1:10 del colorante fluorescente che vannoda 1:00 a 1 nM filtro (0,22 micron) di acqua sterilizzata.
- Prendere coprioggetti puliti memorizzati in 100% etanolo e lavare con acqua sterilizzata per filtrazione. Spot 20 ml di ogni diluizione colorante fluorescente su un vetrino pulito separato. Lasciate che i coprioggetti asciugare sotto una cappa sterile. Proteggere i coprioggetti dalla luce e dalla polvere fino al momento dell'uso. Utilizzare questi esempi per stimare l'intensità di molecole fluorescenti singoli (vedi punto 3).
- Transfezione
- Cellule CHO cultura in miscela 1:1 medio / nutriente Dulbecco Modified Eagle F-12 (DMEM/F12) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C, in . 5% di CO 2 NOTA: Usare mezzi di comunicazione liberi fenolo-rosso tutto l'esperimento per ridurre al minimo autofluorescenza.
- Prendere coprioggetti puliti dalla soluzione di etanolo al 100%, lavarli con sterile tampone fosfato salino (PBS), e mettere un vetrino in ciascun pozzetto di un 6 celle ben cultura plmangiato.
- Trypsinize, contare e cellule CHO seme con una densità di 3 x 10 5 cellule / pozzetto nella piastra di coltura cellulare 6-pozzetti contenenti le lamelle. Lasciare che le cellule crescono in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 24 ore al fine di raggiungere ca. 80% di confluenza, che è la densità cellulare ottimale per la trasfezione.
- Per ogni bene, diluire 2 mg di DNA plasmide desiderato (ad es., SNAP-tag β del recettore 2-adrenergici) e 6 ml Lipofectamine 2000 a due tubi separati contenenti 500 microlitri di media OptiMEM. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Unire le soluzioni dal punto 1.3.4 in una provetta e miscelare per ottenere una miscela di trasfezione. Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20 min.
- Durante l'incubazione (1.3.5), prendere le cellule CHO e lavare due volte con pre-riscaldato (37 ° C) PBS. Sostituire PBS con 1 ml / pozzetto di fenolo mezzo DMEM/F12 aneritro supplementato con 10% FBS ma senza antibiotici.
- Aggiungere l'intero transfectmiscela di ioni (1 ml) dal punto 1.3.5 goccia a goccia in ogni pozzetto, e delicatamente Rock il piatto avanti e indietro per garantire la completa miscelazione.
- Incubare per 2 a 4 ore a 37 ° C, in 5% CO 2 e procedere subito dopo il passaggio successivo. NOTA: Queste condizioni di trasfezione sono stati ottimizzati per raggiungere densità dei recettori <0,45 particelle / 2 micron, che sono adatti per singola l'imaging molecola. Le regolazioni possono essere necessari quando si utilizzano diverse celle, costrutti o reagenti.
- Etichettatura Protein
- Diluire 1 ml di soluzione madre fluoroforo-BG in 1 ml di mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% FBS per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Prendere le cellule trasfettate dall'incubatore e lavare due volte con preriscaldata (37 ° C) PBS. Sostituire PBS con 1 ml di soluzione 1 mM fluoroforo-BG e incubare per 20 min a 37 ° C 5% CO 2 in un incubatore.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule trevolte con DMEM/F12 mezzo supplementato con 10% FBS, ogni volta seguiti da 5 minuti di incubazione a 37 ° C. Prendete un vetrino (con cellule marcate) con le pinzette e mettetelo in una camera di imaging.
- Lavare due volte con 300 microlitri di buffer di imaging. Aggiungere 300 ml di buffer di immagini fresche e procedere immediatamente alla diagnostica per immagini (parte 2).
2. Acquisizione Immagine
NOTA: Usare un totale di fluorescenza di riflessione interna (TIRF) microscopio, dotato di un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica (ad esempio, apertura numerica 100X magnification/1.46.), I laser adatti (ad esempio, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 645 laser a diodi nm), un dispositivo ad accoppiamento di carica dell'elettrone moltiplicando (EMCCD) macchina fotografica, un incubatore e un controllo della temperatura per visualizzare molecole fluorescenti singoli.
- Impostare i parametri desiderati microscopio, cioè., Linea laser, l'angolo TIRF (questo parametro controlla la penetrazionezione profondità del campo evanescente), tempo di esposizione, il frame rate e il numero di immagini per film 10. Mantenere il controllo del riscaldamento / incubatore e la temperatura sempre per evitare derive di temperatura e umidità di condensa.
- Mettere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo 100X del microscopio. Posizionare la camera di imaging con le cellule marcate sul supporto esemplare di microscopio, e portare le cellule a fuoco in illuminazione campo chiaro.
- Passare alla illuminazione TIRF. Mantenere potenza del laser più basso possibile per consentire una ricerca per la cella desiderata ma allo stesso tempo minimizzando fotoscolorimento.
- Selezionare la cella desiderata e fine regolare la messa a fuoco. Impostare la potenza del laser ad un livello che permette la visualizzazione di singoli fluorofori. Acquisire sequenza di immagini e salvare file di sequenza di immagini crudo. Tiff.
3. Calibration (Fluorofori singoli su vetro e monomeriche / dimerica controlli Receptor)
- Assemblare ogni sampl taraturae preparato come descritto in 1.2 nella camera di imaging. Collocare ogni campione sul microscopio e scegliere il campione contenente macchie diffrazione limitata ben separati che candeggina in un unico passaggio. NOTA: Questi punti rappresentano singole molecole del colorante fluorescente.
- Acquisire TIRF sequenze di immagini come descritto al punto 2. Importante: gli stessi parametri di imaging devono essere utilizzati per tutti gli esperimenti, compresi quelli per la calibrazione.
- Eseguire la rilevazione e l'analisi di monitoraggio come indicato in 4,1-4,2. Estrarre l'intensità di ciascuna particella come descritto al punto 4.2.6. Da questi dati, calcolare la media (μ) e la deviazione standard (σ) dell'intensità dei singoli fluorofori.
- Facoltativo: eseguire la stessa analisi su cellule trasfettate con un recettore sulla superficie cellulare monomerica (. Esempio, CD86), N-terminale con etichetta una o due copie di SNAP 10 ed etichettato con il derivato fluoroforo-BG. Follow la procedura sopra descritta per il singolo fluoroforo su vetro. Stimare l'efficienza di etichettatura come descritto in Calebiro, D. et al. 10
4. Image Analysis
- Preparazione sequenza di immagini
- Utilizzare un software di elaborazione delle immagini (ad es., ImageJ) per ritagliare le immagini.
- Salvate singoli fotogrammi come separato. Immagini TIFF in una nuova cartella, indicando su ogni immagine il numero di telaio.
- Misurare la superficie cellulare disegnando una regione di interesse (ROI) lungo il contorno di una cella mediante lo strumento di misura in ImageJ o uno strumento simile in un altro software. Utilizzare questo valore per calcolare la densità delle particelle dividendo il numero totale di particelle all'inizio del film dalla superficie cellulare.
- Rivelazione di particelle e di monitoraggio
NOTA: Utilizzare un software non commerciali come u-track 13, lavorando in Matlabambiente, per rilevare automaticamente e tenere traccia di particelle recettore singoli.
NOTA: L'algoritmo u-track si basa su un approccio di monitoraggio a più ipotesi. Questo approccio unisce le particelle tra i fotogrammi con la costruzione di matrici di costo, in cui vengono assegnati i singoli probabilità che una data particella in un fotogramma corrisponde a una data particella nel frame successivo, appare, scompare o si fonde / divide con / da altre particelle. La soluzione che minimizza globalmente i costi, cioè., Quello con la più alta probabilità, è finalmente selezionato. Questo permette anche di inseguimento una particella scomparire temporaneamente, un fenomeno tipico causato da fluoroforo lampeggiante. L'ultima versione di u-track (2.1.0) dispone di interfacce utente grafiche che facilitano l'esecuzione di queste analisi.- Dal prompt dei comandi Matlab, digitare "movieSelectorGUI" per aprire l'interfaccia di selezione di film. Seguire le istruzioni per creare unnuovo database di film a partire dalle immagini separate salvate in precedenza (vedi 4.1.2).
- Fornire la dimensione dei pixel in nm, intervallo di tempo in secondi, apertura numerica, profondità di bit fotocamera e lunghezza d'onda di emissione del fluoroforo, richiesta per il rilevamento di particelle e di inseguimento. Salvare il database di film.
- Dall'interfaccia selezione di film, eseguire l'analisi, la scelta di "particelle singole" come tipo di oggetti. Verrà visualizzata una nuova finestra in cui i parametri utilizzati per il rilevamento di particelle e di monitoraggio possono essere definiti. Inizia con i parametri di default. Più tardi, regolare questi parametri se la qualità della rilevazione e / o di monitoraggio non è soddisfacente (ad esempio, alcune particelle non vengono rilevati o tracce sono frammentati) Facoltativo:. Sotto le impostazioni di rilevamento, selezionare "i risultati di monitoraggio Esportare in formato matrice" per memorizzare le coordinate e le ampiezze delle particelle in una singola matrice (campo denominato "trackedFeaturedInfo"). Per una descrizione dettagliata di questi parametri, fare riferimento alla documentazione u-track.
- Eseguire l'algoritmo di rilevamento. Questo algoritmo determinare automaticamente la posizione e l'intensità sopra sfondo di ogni spot diffrazione limitata (ie., Complessi singoli recettori / recettore), calibrando una funzione gaussiana bidimensionale con deviazione standard pari alla funzione punto diffusione del microscopio intorno massimi di intensità locale . Quindi, eseguire l'algoritmo di tracking. Memorizzare i risultati delle analisi in un file mat..
- Utilizzare la routine "movieViewer", contenuto nel pacchetto u-track, o quelli personalizzati simili a visualizzare le tracce e controllare la qualità della rilevazione e di monitoraggio.
- Aprire il file mat. Vedere la posizione e l'ampiezza (cioè., Intensità) delle particelle rilevate ad ogni frame. Dati generati nel passaggio 4.2.4 sono contenuti nel campo tracksCoordAmpCG della ar tracksFinalray e / o in trackedFeaturedInfo. Dal numero totale di particelle rilevato calcolare la densità delle particelle dividendo questo valore per l'area superficiale delle cellule misurata a 4.1.3.
- Facoltativo: utilizzare le coordinate della particella nel tempo (vedere 4.2.6) analizzare il moto delle particelle recettore. Calcolare gli spostamenti medi quadrati (MSD) e coefficienti di diffusione (D) utilizzando Matlab o software simili. Per ogni particella e ogni intervallo di tempo (Δ t) considerato, calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) utilizzando la seguente formula:
dove Δ t è l'intervallo di tempo in fotogrammi, N è il numero di passi analizzati, x ed y sono x della particella e coordinate Y al telaio indicata dall'indice. Utilizzare il MSD su appezzamenti di tempo per valutare il tipo di moto di una data particella: relazioni lineariindicare diffusione gratuita (ie., moto browniano), una curvatura positiva (cioè., la curva appare come una parabola) suggerisce movimento diretto, una curvatura negativa è indicativo del movimento confinato 14. Nel caso di particelle diffondenti banche, calcolare il coefficiente di diffusione (D) di ciascuna particella inserendo i dati MSD ottenuti con la seguente equazione:
- Calcolo della dimensione delle particelle con il metodo di montaggio gaussiana
NOTA: Una volta che la distribuzione di intensità di campioni di taratura (singoli fluorofori su vetro e / o recettori monomerici fluorescente) è noto, eseguire una misura gaussiana mista sulla distribuzione delle intensità delle particelle all'inizio di una sequenza di immagini per determinare la dimensione di complessi recettoriali (cioè., il numero di recettori per particella) 10. Eseguire queste analisi utilizzando Matlab o ssoftware analoghe sui.- Calcolare l'intensità di ciascuna particella facendo la media dell'intensità della particella dal primo fotogramma per fotogramma prima della prima variazione di intensità verificato (nella maggior parte dei casi decremento per photobleaching).
- Eseguire un raccordo gaussiana misto secondo la seguente equazione:
dove φ (i) è la frequenza di particelle aventi intensità I, n è il numero dei componenti, α n è un parametro che contribuisce alla altezza del componente n, μ e σ sono la media e la deviazione standard della intensità di riferimento singoli fluorofori . (calcolato come descritto al punto 3) NOTE: Determinare tegli massimo numero di componenti (n max) per ogni sequenza immagine aumentando progressivamente n max finché l'aggiunta di un componente non più produrre un migliore raccordo statisticamente, come giudicato da un F-test. - Optional: (. Esempio, gli ultimi 60 fotogrammi di una sequenza di 400 telaio) Eseguire un fit gaussiano mista sulla distribuzione dell'intensità ottenuto sugli ultimi fotogrammi del filmato. Sostituire μ e σ con i valori ottenuti dopo il montaggio, che forniscono stime raffinate per tali parametri e ripetere il punto 4.3.2.
- Calcolare l'area sotto la curva (AUC) di ciascun componente del fit gaussiano mista. Calcolare l'abbondanza relativa di particelle recettore di differenti dimensioni (cioè, monomero, dimero, trimero, ecc) dividendo il valore AUC di ogni componente l'AUC dell'intera distribuzione.
- Facoltativo: utilizzare dati provenienti da diverse cellule e le corrispondenti densità di particelle (calcolati come descritto in 4.2.6) per generare trame dove la distribuzione di particelle con dimensioni diverse è correlata con la densità delle particelle 10.
- Calcolo della dimensione delle particelle con metodo sagomata passo
NOTA: Utilizzare un analisi passo-montaggio come metodo alternativo per determinare la dimensione dei complessi recettoriali 10. La base per questa analisi è che la distruzione indotta dalla luce (photobleaching) di una singola risultati fluoroforo in sua scomparsa istantanea - quindi particelle contenenti n fluorofori dovrebbero progressivamente candeggina produrre un profilo di intensità con n passi.- Estrarre i profili di intensità di ogni particella dal file. Mat generato da u-track o simile software di rilevamento / tracking (vedi 4.2.6).
- Utilizzare un algoritmo passo-montaggio, come quello presentatoin rif. 10, per contare il numero di passi sbianca per ogni particella.
- Facoltativo: utilizzare i risultati per generare distribuzioni mostrano l'abbondanza relativa di particelle recettori di diverse dimensioni e correlare con densità di particelle come precedentemente descritto per i risultati del raccordo gaussiana mista (vedi 4.3).
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Representative Results
Il protocollo descritto può essere applicato ad una varietà di differenti proteine di membrana. Come esempio, risultati rappresentativi ottenuti con β 2-adrenergici e GABA B sono riportati 10. Poiché i segnali fluorescenti da singole molecole sono deboli, minimizzazione di fluorescenza di fondo è il primo passo fondamentale per ottenere buoni risultati. Quindi, è importante utilizzare coprioggetti ampiamente puliti (Figura 2A) così da minimizzare autofluorescenza campione (ad es., Utilizzando mezzi di connessione fenolo-rosso). Il passo successivo consiste nel determinare l'intensità di fluorescenza di molecole singole fluoroforo. Questo può essere fatto eseguendo un'immagine singoli fluorofori macchiato su un vetrino pulito (Figura 2B). Tipicamente, una diluizione seriale del fluoroforo viene usato per selezionare le migliori condizioni per l'analisi, cioè., La concentrazione che produce ben separati e distribuiti uniformemente singoli fluorofori. Cont aggiuntiveRols possono essere eseguite eseguendo un'immagine proteine monomeriche di controllo, per es., recettori CD86 NAP-tag etichettati con un derivato fluoroforo-BG. Una volta che sono stati eseguiti questi controlli preliminari e la calibrazione, gli esperimenti reali possono cominciare. Figura 3A mostra il primo fotogramma di una tipica sequenza di immagini TIRF di una cellula transfettate con SNAP-tag β 2-adrenergici e marcato con un derivato fluoroforo-BG. Le macchie rappresentano singoli recettori o complessi recettoriali. Questa immagine mostra anche una densità di particelle adatto per il rilevamento e l'inseguimento automatico -. Secondo la nostra esperienza, densità superiori a 0,45 particelle / micron 2 risultato una scarsa qualità di inseguimento e dovrebbe essere evitata 10 Figura 3B mostra i risultati dell'algoritmo di rilevamento applicata allo stesso sequenza di immagini. Ogni cerchio blu indica una particella rilevata. I risultati dell'algoritmo di inseguimento vengono riportati in Figura 3C,dove le scanalature blu rappresentano le traiettorie delle singole particelle. Le traiettorie di ogni particella possono quindi essere utilizzati per calcolare i coefficienti di diffusione. Questo metodo consente l'acquisizione degli eventi dinamici come mostrato nella figura 3D, in cui due particelle apparentemente subiscono una interazione transitoria. Figura 4 mostra la distribuzione dei coefficienti di diffusione misurato per due diversi GPCR, cioè., Β 2-adrenergici e GABA B. Questo tipo di analisi ci ha permesso di dimostrare che una grande frazione di recettori GABA B è immobile o ha una bassissima mobilità 10. Il raccordo gaussiana misto e passo-montaggio analisi forniscono una precisa quantificazione della dimensione di complessi recettoriali sulla superficie di cellule viventi (Figura 5). Questa analisi può anche rivelare distribuzioni complesse, ad es., La coesistenza di monomeri e dimeri come mostrato nell'esempio di figura 5A.Figure 5B e 5C forniscono due esempi di particelle imbianchimento in uno o due passi e le corrispondenti analisi passo-sagomata che li assegnato correttamente come recettori monomerici e dimeri rispettivamente.
Figura 1. Flusso di lavoro di un tipico esperimento singola molecola come descritto in questo protocollo. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Coverslip pulizia e la preparazione dei campioni di calibrazione. (A)Confronto della fluorescenza di fondo prima e dopo una pulizia vetrino. Coprioggetto sono state ripreso al microscopio TIRF. (B) immagini TIRF di concentrazioni crescenti di un derivato fluoroforo-BG macchiato su vetrini puliti. Barra della scala:. 10 micron , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Tipiche immagini di singola molecola e risultati degli algoritmi di rilevazione / monitoraggio. (A) cellule CHO trasfettate con SNAP-tag β 2-adrenergici e marcato con un derivato fluoroforo-BG sono stati visualizzati mediante microscopia TIRF. Viene mostrato il primo fotogramma della sequenza dell'immagine acquisita. Scala bar:. 5 micron (B)0; particelle rilevati sono indicati da cerchi blu sopra l'immagine originale (C) Le traiettorie risultanti dall'applicazione dell'algoritmo di inseguimento alla stessa sequenza di immagini vengono visualizzate su uno sfondo bianco.. L'istantanea corrisponde alla situazione al telaio no. 35. Segmenti verdi, si fondono eventi. Segmenti rossi, eventi scissione. (D) traiettorie rappresentativa risultante da due particelle recettori (blu e verde, rispettivamente), subendo una interazione transitoria apparente (rosso). Le due particelle si fondono, si muovono insieme per diversi telai, e dividere di nuovo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi di mobili recettorety. Le traiettorie delle singole particelle sono utilizzati per calcolare i coefficienti di diffusione. In questo esempio, sono riportate le distribuzioni dei coefficienti di diffusione calcolati per due diversi GPCR. β 2-adrenergici sono caratterizzati dalla diffusione laterale veloce sulla superficie cellulare, mentre i recettori GABA B hanno limitato la mobilità. Modificato da Calebiro, D. et al. 10
Figura 5. Analisi della dimensione di complessi recettoriali. (A) La dimensione di complessi recettoriali può essere stimata con precisione inserendo le distribuzioni di intensità delle particelle con un modello Gaussiano misto. L'esempio riportato mostra l'applicazione di questa analisi ad una cellula che esprime SNAP-tag recettori β 2-drenergic. Il raccordo rivela due cOmponents: uno corrispondente all'intensità di singoli fluorofori (sostanzialmente sovrapponibile a quella dei campioni di taratura e alla distribuzione ottenuta dopo imbianchimento parziale del campione, mostrata qui) e una con circa doppia intensità. I due componenti possono essere assegnati come monomeri e dimeri, rispettivamente, e le aree sotto i due componenti possono essere utilizzati per stimare l'abbondanza relativa dei recettori monomerici e dimeri. (B) Esempio di monomerica sbianca particella recettore in un solo passaggio. (C ) Esempio di una particella recettore dimerica con la caratteristica sbianca due fasi. Le linee rosse in (B) e (C) sono il risultato dell'algoritmo step-montaggio. Il dato è stato modificato da Calebiro, D. et al. Del 10 cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto permette l'analisi della disposizione spaziale, mobilità e dimensioni dei complessi recettore della superficie cellulare a livello di singola molecola. Rispetto all'uso di proteine fluorescenti, etichettatura con piccole fluorofori organici, che sono più luminoso e fotostabile, ha il vantaggio di permettere la visualizzazione estesa del recettore particelle singole. Poiché i livelli di espressione estremamente bassi sono raggiunti (<0,45 particelle recettore / micron 2), le proprietà di recettori e altre proteine di membrana possono essere analizzati densità che non superano quelle fisiologiche. Inoltre, gli effetti della stimolazione dei recettori con agonisti 10 o altre manipolazioni, ad esempio destinate a riprodurre una situazione patologica, possono essere analizzati. Inoltre, grazie alla flessibilità della strategia di etichettatura di etichetta SNAP / CLIP 11,12, differenti fluorofori possono essere impiegati secondo le proprie esigenze specifiche - Notevolmente, la combinazione di SNAPei tag CLIP possono essere utilizzati per eseguire esperimenti di due colori, ad es., per osservare la colocalizzazione tra due proteine interagiscono. Infine, questo protocollo può essere modificata in diversi punti, ad esempio utilizzando differenti cellule, metodi di trasfezione e strategie di etichettatura.
Fasi critiche includono la minimizzazione di sfondo e autofluorescenza (utilizzando coprioggetti ampiamente puliti, media liberi fenolo-rosso e soluzioni filtrate), l'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione (ad es., Quantità di DNA plasmidico e tempo dopo la trasfezione) per raggiungere livelli di espressione estremamente bassi , etichettatura efficiente e la scelta di un fluoroforo luminoso e sufficientemente fotostabili. Per quanto riguarda la scelta del fluoroforo, quelli rossi / rosso lontano solito danno risultati migliori perché autofluorescenza cellulare è più alto nel blu / parte verde dello spettro visibile e di solito quasi trascurabile al di sopra di 550 nm. Particolare attenzione deve essere rivolta ad evitare photobleaching difluorofori durante la ricerca di un cellulare adeguata e messa a fuoco. I campioni con fluorofori macchiato su vetrini nonché controlli recettori monomerici e dimerici (ad es., CD86 con una o due tag SNAP) 10 devono essere considerati per calibrare l'analisi e verificare l'efficienza di etichettatura.
I limiti di questo approccio sono in gran parte dipende dalla risoluzione spazio-temporale che può essere attualmente raggiunto. Questo è principalmente dettata dal numero di fotoni raccolti da un fluoroforo nonché dalla sensibilità e velocità di acquisizione della fotocamera utilizzata. Valori tipici per la precisione la localizzazione di una singola particella rilevata sono 20 - 30 nm (per confronto la risoluzione spaziale di microscopia a fluorescenza convenzionale è di circa 200-300 nm). Questi valori sono ancora più grandi della dimensione reale di un tipico proteina di membrana (circa di 2 - 8 nm). Poiché i recettori cadere ad una distanza inferiore al limite di diffrazione della microportata (circa 200-300 nm) vengono rilevati come una singola particella, opportuni controlli e le analisi statistiche dovrebbero essere utilizzati per sottrarre colocalizations casuali (falsi positivi) dal numero di veri interazioni recettore-recettore 8-10 Il tasso di acquisizione massima ottenibile con. telecamere EMCCD corrente possono superare 1 KHz, almeno in modalità di ritaglio (cioè., viene utilizzata solo una parte del sensore). Tuttavia, la velocità di acquisizione è limitata dal numero di fotoni emessi da un singolo fluoroforo che raggiungono la fotocamera. In pratica, i tempi di esposizione di almeno 10 - sono generalmente necessari 20 msec. Per questo motivo, le velocità tipiche di acquisizione variano tra 10 e 50 Hz, cioè., Un frame ogni 20 a 100 msec. Gli sviluppi futuri nel design fluoroforo, componenti ottici e tecnologia di rilevamento potrebbe permettere di aumentare ulteriormente la risoluzione spazio-temporale dei metodi di singola molecola.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
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- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
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- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
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- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
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- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
