De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar receptores individuales en la superficie de células vivas y analizar su ubicación, movimiento y asociación dinámica en complejos supramoleculares. Esto se logra expresando receptores marcados a presión a niveles muy bajos en la superficie de las células vivas y marcándolos con fluoróforos orgánicos brillantes para permitir la detección de una sola molécula. Como segundo paso, las células se visualizan mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, que permite adquirir una secuencia de imagen rápida de las partículas receptoras individuales que se mueven en la superficie celular.

A continuación, se aplican algoritmos automatizados de detección y seguimiento a la secuencia de imágenes para obtener la posición y la intensidad de cada partícula receptora a lo largo del tiempo. Se obtienen resultados que muestran un análisis preciso del tamaño de los complejos de receptores en este ejemplo, beta dos receptores adrenérgicos basados en un ajuste gaussiano mixto de la distribución de intensidad de las partículas al inicio de la secuencia de la imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como cómo se organizan nuestros receptores en los dominios od de la superficie de las células vivas.

Cómo interactúan entre sí para formar dímeros y oligómeros, y cómo se producen realmente los eventos dinámicos en la base de la señalización de los receptores. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos bioquímicos y de microscopía estándar es que investiga el comportamiento de receptores individuales en el entorno natural, lo que nos permite estudiar aspectos importantes que normalmente están ocultos en las mediciones de conjuntos. Los cubreobjetos de las muestras deben limpiarse exhaustivamente para minimizar la fluorescencia de fondo Durante la toma de imágenes, utilice pinzas limpias para colocar 24 milímetros de diámetro.

La cubierta de vidrio se desliza en un soporte de cubreobjetos que separa los cubreobjetos individuales. Coloque el soporte con los cubreobjetos en un vaso de precipitados y añada cloroformo hasta que los cubreobjetos queden cubiertos. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio para reducir la evaporación y sonicar en un baño.

Sonicar durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, saque el soporte de la tapa del vaso de precipitados y deje que se sequen. A continuación, coloque el soporte con los cubreobjetos en otro vaso de precipitados y añada cinco molares de solución de hidróxido de sodio hasta que los cubreobjetos queden cubiertos.

Al igual que antes, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y sonique durante una hora a temperatura ambiente, transfiera el soporte de cubreobjetos a un nuevo vaso de precipitados y lávelo tres veces con agua destilada. Por último, coloque los cubreobjetos limpios en una placa de cultivo de células de vidrio llena de etanol al 100%. Aquí se muestran los cubreobjetos antes y después de la limpieza, tomados por fluorescencia de reflexión interna total o microscopía de césped.

Las muestras de calibración de Cal se utilizan para estimar la intensidad de moléculas fluorescentes individuales durante la microscopía de césped. Para preparar las muestras, disuelva el colorante fluorescente en el disolvente adecuado. Prepare una dilución en serie de uno a 10 del tinte fluorescente que va desde un picaMolar hasta un ano molar.

En filtro de agua esterilizada. Lave los cubreobjetos previamente limpios transfiriéndolos a una placa de cultivo celular llena de agua esterilizada con filtro. Después de eso, coloque cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos y espere hasta que se sequen, localice 20 microlitros de cada dilución de tinte fluorescente en un cubreobjetos limpios por separado.

Deje que la funda se seque debajo de una capucha estéril. Proteja los deslizadores de la cubierta de la luz y el polvo hasta que se use antes de la transfección. Prepare una placa de cultivo celular de seis pocillos Lave los cubreobjetos limpios con PBS estéril y coloque un cubreobjetos en cada pocillo de la placa de cultivo celular de seis pocillos.

Las células CHO que se van a transfectar para este estudio se cultivan a 37 grados centígrados con 5% de CO2 en una mezcla de nutrientes medio de águila modificada con ECCOs uno a uno F 12 suplementada con 10% de penicilina sérica bovina fetal y estreptomicina después de tripsina y se cuentan las células siguiendo los métodos estándar de siembra a una densidad de tres veces 10 a la quinta célula por pocillo. En la placa de cultivo celular del sexto pocillo que contiene los cubreobjetos, deje que las células crezcan en una incubadora durante 24 horas para lograr aproximadamente el 80% de fluidez, que es la densidad celular óptima. Para la transfección.

El aspecto más difícil de este protocolo es lograr un nivel de expresión extremadamente bajo de los receptores de membrana en la superficie celular para garantizar el éxito. La condición de transfección. Por ejemplo, la cantidad de NA de medios positivos y el tiempo después de la transfección deben optimizarse el día de la transfección.

Prepare los reactivos de transfección para cada uno de los cuales se diluirán dos microgramos del ADN escocés deseado en 500 microlitros de medio óptimo en otro tubo. Para cada pocillo, diluya seis microlitros de Lipectomía 2000 en 500 microlitros de medio Optum. Incuba ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, combine ambas soluciones en un tubo y mezcle para obtener una mezcla de transfección. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 minutos. Mientras tanto, prepare las células CHO.

Lavar las celdas dos veces con PBS preavisado Después del segundo lavado, reemplace PBS con un mililitro por pocillo de medio D-M-E-M-F 12 libre de rojo fenol suplementado con 10% de FBS, pero sin antibióticos. Agregue un mililitro de la mezcla de transfección, gota a gota a cada pocillo y mueva suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás para asegurar una mezcla completa. Incubar a 37 grados centígrados en 5%CO2 durante dos a cuatro horas antes de proceder inmediatamente al etiquetado de proteínas.

Para comenzar este procedimiento, diluya un microlitro del derivado de benzoguina conjugada con fluoro cuatro o de la solución madre de fluoro cuatro BG en un mililitro de medio D-M-E-M-F 12 suplementado con FBS al 10% para obtener una concentración final de un micromolar. Recupere las células transfectadas de la incubadora y lávelas dos veces con PBS precalentado. Reemplace PBS con un mililitro de una solución micromolar de fluoro cuatro BG e incube a 37 grados Celsius en 5% de CO2 durante 20 minutos.

A continuación, lavar las células tres veces con el medio D-M-E-M-F 12 suplementado con 10% de FBS cada vez, seguido de una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados. Pinzas usadas para transferir cubreobjetos con células marcadas a una cámara de diagnóstico por imágenes. Lavar dos veces con 300 microlitros de tampón de imagen.

Agregue 300 microlitros de tampón de imagen nuevo y proceda inmediatamente a obtener las imágenes de imagen. Usando un microscopio de césped equipado con un objetivo de inmersión en aceite, un objetivo de alta apertura numérica, láseres adecuados, un dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones, una cámara y una incubadora, y un control de temperatura. Establezca los parámetros deseados del microscopio, es decir, la línea láser, el ángulo de tur, el tiempo de exposición, la velocidad de fotogramas y el número de imágenes por película.

Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo de 100 x del microscopio. Coloque la cámara de imágenes con las células marcadas en el portamuestras del microscopio y enfoque las células. Uso de iluminación de campo claro.

Cambie a la iluminación del césped. Mantenga la potencia del láser lo más baja posible para permitir la búsqueda de la célula deseada, pero al mismo tiempo minimizando el fotoblanqueo. Seleccione la celda deseada y fina.

Ajusta el enfoque. Aumente la potencia del láser a un nivel que permita la visualización de cuatro de flora individuales. Adquiera una secuencia de imágenes y guarde la secuencia de imágenes sin procesar como un archivo tiff para la calibración.

Reúna cada muestra de calibración en la cámara de imágenes y colóquela en el microscopio. Elija una muestra que contenga difracción bien separada. Manchas limitadas que se blanquean en un solo paso.

Las secuencias de imágenes de césped se adquieren posteriormente de la misma manera que se muestra para las células marcadas. Para preparar una secuencia de imágenes, utilice un software de procesamiento de imágenes como Image J para recortar las imágenes. Guarde los fotogramas individuales como imágenes TIFF separadas en una nueva carpeta que indique el número de fotograma de cada imagen.

La detección y el seguimiento de partículas se realizan con un software no comercial, como U Track, en un entorno de MATLAB. En el símbolo del sistema de MATLAB, escriba selector de película, GUI. Para abrir la interfaz de selección de películas, siga las instrucciones para crear una nueva base de datos de películas a partir de las imágenes separadas guardadas anteriormente.

Proporcione el tamaño de píxel en nanómetros, el intervalo de tiempo en segundos, la apertura numérica, la profundidad de bits de la cámara y la longitud de onda de emisión del fluoróforo necesaria para la detección y el seguimiento de partículas. Guarde la base de datos de películas desde la interfaz de selección de películas. Ejecute el análisis eligiendo partículas individuales como tipo de objeto.

Ejecute el algoritmo de detección y, a continuación, ejecute el algoritmo de seguimiento. Utilice la rutina del visor de películas contenida en el paquete URAC para visualizar las pistas y comprobar la calidad de la detección y el seguimiento. Abra el archivo MAT de puntos para ver la posición y la amplitud de las partículas rastreadas en cada fotograma.

El tamaño de las partículas también se puede calcular a partir de los datos adquiridos. Aquí se muestra el primer fotograma de una secuencia típica de imágenes de césped de una célula transfectada con receptores adrenérgicos beta dos marcados con snap y marcados con un derivado de bencilguina conjugado con fluoro cuatro. Las manchas representan receptores individuales o complejos de receptores.

Se aplica un algoritmo de detección a la misma secuencia de imágenes y cada partícula detectada se indica mediante la aplicación de un círculo azul de un algoritmo de seguimiento. La misma secuencia de imágenes da como resultado las trayectorias de las partículas individuales indicadas en azul. Los segmentos verdes representan eventos de fusión y los segmentos rojos representan eventos de división.

Este método también captura eventos dinámicos. En este ejemplo, dos partículas experimentan una interacción transitoria, se mueven juntas durante varios fotogramas y se vuelven a dividir. Las trayectorias de las partículas individuales se utilizan para calcular sus coeficientes de difusión.

Este resultado representativo muestra que el receptor adrenérgico beta dos tiene una alta movilidad. Si bien el receptor gaba B tiene una movilidad limitada, el tamaño de los complejos de receptores se puede estimar con precisión ajustando las distribuciones de las intensidades de las partículas con un modelo gaussiano mixto. Este análisis también puede revelar la coexistencia de monómeros y dímeros.

Aquí se muestran ejemplos de un blanqueo de partículas de receptor monomérico en un solo paso y un blanqueo de partículas de receptor diametral en dos pasos. Estos procedimientos pueden extenderse y adaptarse para trabajar con otras proteínas de la superficie celular, métodos de nivelación y modelos celulares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo producir un sueño de cobertura limpio, cómo obtener niveles de expresión bajos y un etiquetado eficiente con fluoros orgánicos brillantes, así como cómo adquirir y analizar imágenes de césped, que representan todos los pasos clave para el éxito de una sola molécula.