Artículo de método

Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología

DOI:

10.3791/51807

⸱

18 de agosto de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito presenta una simple, pero potente, método in vitro para evaluar la contractilidad del músculo liso en respuesta a agentes farmacológicos o la estimulación nerviosa. Las principales aplicaciones son la detección de drogas y la comprensión fisiología del tejido, la farmacología y la patología.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método in vitro para medir la contractilidad del músculo liso de la vejiga, y su uso para la investigación de las propiedades fisiológicas y farmacológicas de músculo liso, así como los cambios inducidos por la patología. Este método proporciona información crítica para la comprensión de la función de la vejiga, mientras que la superación de las principales dificultades metodológicas encontradas en los experimentos in vivo, tales como manipulaciones quirúrgicas y farmacológicas que afectan la estabilidad y la supervivencia de las preparaciones, el uso de tejido humano, y / o el uso de productos químicos caros. También proporciona una manera de investigar las propiedades de cada componente de la vejiga (es decir, músculo liso, la mucosa, los nervios) en condiciones saludables y patológicos.

La vejiga urinaria se retira de un animal anestesiado, se colocó en solución de Krebs y cortar en tiras. Las tiras se colocan en una cámara llena con solución caliente de Krebs. Un extremo está unido a un tensio isométrican transductor para medir la fuerza de contracción, el otro extremo está unido a una varilla fija. El tejido se estimuló mediante la adición de compuestos directamente al baño o electrodos de estimulación de campo eléctrico que activan los nervios, similar a la activación contracciones de la vejiga in vivo. Se demuestra el uso de este método para evaluar la contractilidad del músculo liso espontánea durante el desarrollo y después de una lesión de la médula espinal experimental, la naturaleza de la neurotransmisión (transmisores y receptores implicados), factores implicados en la modulación de la actividad del músculo liso, el papel de los componentes individuales de la vejiga, y las especies y las diferencias de órganos en respuesta a los agentes farmacológicos. Además, podría ser utilizado para la investigación de las vías intracelulares implicadas en la contracción y / o la relajación del músculo liso, relaciones estructura-actividad de la droga y la evaluación de la liberación del transmisor.

El método de la contractilidad del músculo liso in vitro se ha utilizado ampliamente for más de 50 años, y ha proporcionado datos que han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la función de la vejiga, así como para el desarrollo farmacéutico de los compuestos que se utilizan actualmente para el manejo clínico de la vejiga.

Introducción

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El músculo liso de la vejiga se relaja para permitir el almacenamiento de la orina, y contratos para provocar la eliminación de orina. Relajación es mediado por las propiedades intrínsecas del músculo liso y por la liberación tónica de norepinefrina (NE) de los nervios simpáticos, que activa los receptores adrenérgicos beta (β 3 AR en humanos) en el detrusor. La micción se logra mediante la inhibición de la entrada simpática y la activación de los nervios parasimpáticos que la liberación de ACh / ATP se contraiga el músculo liso de la vejiga 1. Numerosos estados patológicos, incluyendo el cerebro y / o lesión de la médula espinal, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, obstrucción de la salida de la vejiga o cistitis intersticial, pueden alterar profundamente la función de la vejiga, con graves repercusiones en la calidad de vida del paciente 2. Estas condiciones alteran la contractilidad del músculo liso al afectar a uno o más componentes de la vejiga: el músculo liso, el aferente o nervios eferentes y / o lamucosa.

Varios in vivo y métodos in vitro para estudiar la función de la vejiga se han desarrollado. In vivo, cistometría es la principal medida de la función de la vejiga. Aunque esta es una preparación intacta que permite la recogida de información en virtud próximo a las condiciones fisiológicas, hay una serie de circunstancias en las que se prefiere el uso de tiras de músculo liso. Estos incluyen situaciones en las técnicas quirúrgicas y / o manipulaciones farmacológicas que puedan afectar a la supervivencia y la estabilidad de la preparación in vivo, o cuando los estudios requieren el uso de tejido humano o productos químicos caros. Este método también facilita un examen de los efectos de los fármacos, la edad y la patología en cada componente de la vejiga, es decir, el músculo liso, mucosa, aferentes y nervios eferentes.

Tiras de vejiga se han empleado en los últimos años por muchos grupos para responder a una serie de preguntas científicas. Estaban acostumbrados a evaluate cambios en la actividad espontánea miogénica inducida por la patología. Se cree que esta actividad para contribuir a los síntomas de urgencia y frecuencia de la vejiga hiperactiva (OAB), y por lo tanto es una diana para fármacos se están desarrollando para OAB 3-9. Tiras de vejiga también se utilizaron para investigar los factores miogénicas y neuronales que modulan el tono del músculo liso con el objetivo de descubrir los canales iónicos y / o receptores y / o vías intracelulares que podrían ser objeto de inducir la relajación o contracción del músculo liso 3,10- 13. Otros estudios se han centrado en la naturaleza de la neurotransmisión, incluyendo transmisores y receptores implicados y los cambios inducidos por la patología 14,15. Además, el método ha sido utilizado para las comparaciones entre los tejidos de diferentes especies jóvenes de 16 18, entre los órganos 19-21, y la evaluación de las relaciones estructura-actividad de drogas 22-24. Una extensión de este método ha sido utilizado para Measure el efecto de los fármacos sobre la liberación del transmisor de los nervios eferentes 25. Además, una variedad de tejidos (vejiga, la uretra, el tracto gastrointestinal, GI) cosechado de animales o seres humanos (de cirugías o tejido de un donante de órganos aprobados para investigación) y de una variedad de modelos animales, incluyendo lesión de la médula espinal (SCI), obstrucción de la salida de la vejiga (BOO), o la cistitis intersticial (IC) pueden ser investigados mediante esta técnica.

En este artículo se expone la aplicación de este método, junto con los protocolos experimentales necesarios, para abordar varias cuestiones científicas antes mencionadas.

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Protocolo

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Todos los procedimientos descritos aquí son aprobados por el comité de IACUC en la Universidad de Pittsburgh.

1. Soluciones

  1. Preparar la solución de Krebs de acuerdo a la receta. Composición en mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, dextrosa 11.7.
  2. Airear Krebs con un 95% de O 2, 5% de CO 2 y colocarlo en un baño de 37 º C el agua que se utilizará durante todo el experimento. Coloque de lado ~ 200 ml de solución de Krebs aireado a temperatura ambiente que se utilizarán para la disección de tejidos.
  3. Medir pH (~ 7.4) y la osmolaridad (~ 300 mOsm) de aireado Krebs.

2. experimental (Figura Esquema 1A)

  1. Rellene aireado (95% O 2, 5% de CO 2) cámaras con 10 ml de Krebs.
  2. Encienda la bomba de circulación de agua para calentar las cámaras de hasta 37 ° C; encender el equipo necesario: amplificador (s), estimulador (s) y grabación de software.
  3. Calibrar transductores con un 1 g de peso.

3. tisular (Figura 1B)

Retire la vejiga de un Sprague Dawley adultas ingenuo hembra (200-250 g; ~ 10-12 semanas de edad) siguiendo estos pasos:

  1. Prepare el área de disección y los instrumentos necesarios: máquinas de afeitar eléctricas, pinzas con dientes, hoja de bisturí, tijeras de disección, micro tijeras, dos pinza de disección (autores prefieren Dumont fórceps # 3), clips de tejido (o sutura de seda), un plato de disección Sylgard recubiertos con Krebs y alfileres de disección de tejidos.
  2. Anestesiar al animal con la inhalación de isoflurano (4% en O 2) en la cámara de inducción. Use pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Controlar continuamente el nivel de anestesia mediante la observación de la tasa de respiración, la respuesta a los estímulos externos, y la pérdida de la extremidad trasera retirar reflejo.
  3. Cuando el animal se anestesia el afeitado una baja del abdomenrea. Exponer los órganos de la pelvis a través de una incisión abdominal en la línea media. Identificar la vejiga y la uretra. Retire la vejiga por el corte en el cuello de la vejiga cerca de la uretra proximal. Coloque tejido inmediatamente en el plato recubierto Sylgard lleno con solución de Krebs aireada.
  4. Si es necesario, retire el tejido adicional en este momento: la uretra, piezas de gastrointestinal (GI) y / o de la próstata, etc
  5. Sacrificio del animal utilizando métodos aprobados IACUC (por ejemplo, por sobredosis de anestésico o asfixia de CO 2 seguido de un método secundario).
  6. Inserte pernos de tejido a través de la disección de la cúpula vesical, el cuello y los uréteres, para estabilizar el tejido para su posterior disección. No estire el tejido. Retire, tejido graso conectivo, la uretra proximal, y uréteres si están presentes.
  7. Abra la vejiga desde la base hasta la cúpula para crear una hoja plana, lado serosa abajo / lado luminal (Figura 1B). Coloque pasadores de disección en cada esquina del tejido. Retire dom vejigaE y tejido del cuello.
  8. Si el propósito del experimento es determinar la contribución de la mucosa (urotelio y lámina propia - véase el diagrama de la Figura 1C) a la contracción del músculo liso, comparar las propiedades de las tiras del detrusor con y sin la mucosa unida. Para ello, antes de cortar el tejido en tiras, retire con cuidado la capa de la mucosa utilizando iris primavera tijeras y pinzas finas bajo un microscopio de disección. Al final del experimento, fijar las tiras para la tinción H & E para confirmar la eliminación completa de la mucosa. Tenga en cuenta que este procedimiento es más fácil en la vejiga del ratón que en vejiga de rata.
  9. Cortar el tejido a lo largo de la base de la cúpula en tiras de ~ 2 x 8 mm (Figura 1B). Ate o adjuntar un clip de tejido a ambos extremos de cada tira.
    NOTA: Una vejiga de rata por lo general se puede cortar en tiras 4, pero el número de tiras puede aumentar o disminuir dependiendo del tamaño del animal / vejiga.
  10. Transferir las tiras a la expercámaras imental. Una un extremo de cada tira a un transductor de fuerza, que mide la contracción del tejido, y el otro a una varilla de vidrio / de metal fijo.
    NOTA: cámaras de tejidos varían en tamaño (0,2 ml a 20 ml o más). Cámaras típicas para vejigas de roedores son 5-20 ml, que proporcionan una altura suficiente para que las tiras se sumergieron completamente en la solución. Algunas cámaras vienen con una función de electrodos de estimulación, no otros. Se debe tener cuidado para asegurar que todas las conexiones de los electrodos están en buen estado, de lo contrario la estimulación de campo eléctrico no es confiable.
  11. Aplicar una cantidad definida de la fuerza para cada tira por el estiramiento suavemente el tejido hasta que la tensión alcanza la línea de base 1 g (~ 10 mN). Inicialmente, el tejido tiende a relajarse, que se registra como una disminución en la tensión de línea de base. Lavar el tejido aproximadamente cada 15 min usando la cálida Krebs aireado y ajustar la tensión de la línea de base a 1 g después de cada lavado. Deje que el tejido se equilibre durante ~ 1-2 horas o hasta que la tensión de línea de base es estable (es decir, hay una mayor relajación del tejido).
  12. Se alcanza prueba la viabilidad del tejido mediante la adición de KCl (80 mM) directamente al baño para ~ 5 min, o hasta que una respuesta meseta. Las respuestas a altas concentraciones de KCl también se pueden repetir durante el experimento o al final del experimento y se utilizan para la normalización de las respuestas a otros fármacos o entre las tiras (véase la normalización en la sección de análisis de datos).
  13. Tejido Lavar varias veces (3-5x) con la tibia aireada Krebs para permitir que los tejidos regresen a las condiciones pre-tratamiento.

4. Estimulación Protocolos

  1. Para investigar los efectos de la patología en la actividad miogénica espontánea o tono del músculo liso, utilizar tiras de músculo liso de diferentes modelos animales, tales como SCI, BOO, o neonatos. Figura 2 ilustra el uso de este método para investigar los cambios en la actividad espontánea de la vejiga durante el desarrollo y después de la lesión. Además, los agentes farmacológicos pueden ser utilizados para modular spactividad ontaneous. Figura 3 ilustra el efecto de los moduladores del canal KCNQ, flupirtina y XE991, sobre la actividad espontánea y tono del músculo liso.
  2. Para constructo estimulación muscular curvas de respuesta de concentración lisas farmacológicas mediante la adición de compuestos a partir de soluciones madre concentradas directamente al baño a intervalos de tiempo definidos. El consumo de drogas y el vehículo en bandas paralelas para dar cuenta de los efectos de los vehículos y de tiempo.
    1. Haga soluciones madre de los compuestos de ensayo deseados a 1000x la concentración de trabajo final. Para carbacol (CCh), un agonista de los receptores muscarínicos, preparar siguientes poblaciones: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Las concentraciones finales en el baño es de 10 -8 M a 10 -5 M (Figuras 4C, D). Para neuromedina B (NMB), un receptor de bombesina subtipo 1 agonista, preparar siguientes poblaciones: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M y concentraciones finales en el baño son 10 -11 M a 10 -6 M. Se espera que tanto CCh y NMB para aumentar la contractilidad del tejido.
    2. Para un baño de tejido de 10 ml, añadir 10 l de cada solución madre CCh tan pronto como la respuesta alcanza una meseta (Figura 4C, D). En tiras paralelas añadir la misma cantidad de vehículo (agua). Del mismo modo, añadir 10 l de cada solución neuromedina B ~ acción cada 5 min.
      NOTA: Observar el efecto excitatorio de NMB y CCh en tono del músculo liso en tiras de diferentes especies en la Figura 4.
    3. Investigar las propiedades de relajación de los músculos lisos en los tejidos pre-contrato con un agente excitador, por lo general CCh o KCl.
    4. Para bloquear una respuesta agonista, pretratar el tejido durante 10-20 min con el antagonista para permitir la penetración del tejido, antes de la estimulación agonista.
  3. Por estimulación neuralulación del músculo liso, también llamada estimulación de campo eléctrico (EFS) siga los pasos 1 a 3.13 y continuar como se describe a continuación. EFS está destinado a activar selectivamente los nervios frente del músculo liso. Parámetros para la estimulación deben ser elegidos cuidadosamente para evitar la estimulación directa del músculo liso.
    1. Establecer parámetros de estimulación: tipo de estímulo (pulsos individuales o trenes), la duración (duración del pulso y la duración de tren), la frecuencia y la intensidad, como se describe en los pasos a continuación y se ilustra en las figuras 5A, B.
      1. Para sola estimulación de pulso, set duración del pulso, intervalo entre el estímulo y la cantidad de estímulos deseados. Habituales parámetros de duración de estimulación son pulsos individuales de 0,05-0,3 mseg de duración entregado a intervalos deseados (Figura 5A). Siga el paso 4.3.1.4 de la intensidad del estímulo.
      2. Para la estimulación de tren, establecer la duración de trenes y el intervalo entre trenes. Los valores típicos de tejido de la vejiga son 3-10 seg entregados al menos 1 men aparte (Figura 5B). Si se produce la fatiga del tejido (es decir EFS contracciones disminuyen durante el período de control), aumentar el intervalo entre trenes.
      3. Establecer la frecuencia de los trenes de estímulos (número de pulsos de un tren - Figura 5B). Ejecutar una curva de respuesta de frecuencia que va desde 0,5 hasta 50 Hz. Frecuencias típicas para la vejiga son 10-20 Hz, que dan contracciones reproducibles y estables mediadas por ATP y ACh. Observar las respuestas dependientes de la frecuencia a la estimulación EFS en tiras de vejiga del ratón en la Figura 5 demuestran cómo este método se puede utilizar para evaluar la contribución de los mecanismos colinérgicos y purinérgicos a la neurotransmisión.
      4. Establecer intensidad del estímulo: aumentar sistemáticamente la intensidad (voltaje) del estímulo hasta que la amplitud de la contracción alcanza una meseta (si se utiliza trenes de mantener constante la frecuencia).
      5. Ajuste la intensidad del estímulo en función de laobjetivo del experimento. Si el objetivo es aumentar las contracciones neuralmente evocada, a continuación, utilizar la intensidad submáxima de manera que la amplitud de la contracción es de ~ 50% de la contracción máxima. Si el objetivo es disminuir las contracciones neuralmente evocada, a continuación, establezca la intensidad de ~ 80% de la amplitud máxima para evitar la fatiga del tejido.
    2. Una vez establecidos los parámetros de estimulación (duración, frecuencia e intensidad), permitirá a ~ 20-30 min para EFS- evocó las contracciones se estabilice antes de la prueba de drogas.
      NOTA: Para verificar la selectividad de EFS para la transmisión neuronal, bloque de transmisión neuronal con el bloqueador de los canales de Na +, la tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 M). Realice este paso al comienzo del experimento, como TTX lava relativamente fácil. Además, realizar esta al final del experimento (véase el paso 4.3.5. Abajo).
    3. Preparar soluciones madre a las concentraciones de trabajo 1,000x finales para: alfa, beta-ATP de metileno (ABMA; un activador del receptor purinérgicoy desensibilizante) 10 -2 M, atropina (un antagonista del receptor muscarínico) 10 -3 M (Figura 5C). Observe otros ejemplos en la Figura 6. El agonista del receptor 5HT4, cisaprida (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), aumenta la contractilidad del tejido y SB-203186 (3 x 10 -3 M), un antagonista del receptor 5HT4, invierte los efectos de la cisaprida.
    4. Para probar los efectos de la ABMA y atropina en EFS (Figura 5C), realizar dos curvas de respuesta de frecuencia de control. Añadir 10 l de 10 -2 M ABMA al baño para una concentración final de 10 mM. Esto se contraerá el tejido debido a la estimulación directa de los receptores purinérgicos en el músculo liso. Después de la respuesta vuelve a la línea de base, repetir las curvas de respuesta de frecuencia. Añadir 10 l de 10 -3 M de atropina para un concentrat definitivaion de 1 mM. Después de ~ 10 min (necesario para la atropina para bloquear los receptores muscarínicos), repetir las curvas de respuesta de frecuencia. En tiras paralelas añadir 10 l de vehículo, agua, en cada paso.
      NOTA: Para otros ejemplos en la Figura 6, añadir 10 l de cada solución de stock cisaprida a intervalos definidos de tiempo (~ cada 15 min; véase la discusión), seguido por 10 l de SB-203186 de stock solución directamente al baño y vigilar su efecto en contracción EFI inducida. En tiras paralelas añadir 10 l de vehículo, DMSO. Observar los efectos de la cisaprida, un agonista del receptor 5HT4, sobre las contracciones evocadas-EFS en los tejidos de la vejiga e íleon humanos en la Figura 6. Además, observe el efecto de DMSO, el vehículo de la cisaprida, el EFS evocados contracciones en la vejiga humana y tejidos íleon .
    5. Al final del protocolo de EFS verificar la selectividad de EFS mediante el bloqueo de la transmisión neural con el bloqueador del canal de Na +, tetrodotoxina (TTX; 0,5-1 y# 181; M). Si las contracciones resistentes a TTX están todavía presentes, se recomienda ajustar la duración y la intensidad del estímulo en experimentos posteriores.
  4. Para determinar los efectos de los fármacos en los sitios pre o post-sináptica (Figura 7A) siga los pasos 1 a 4.3.2. Establecer respuestas reproducibles al carbachol y EFS, a continuación, añadir la droga X.
  5. Al final del experimento, desenganchar o desatar las tiras, secar suavemente sobre un trozo de papel de seda para eliminar el exceso de líquido y medir el peso de cada tira con una balanza. También mida la longitud del tejido usando un calibrador para determinar el área de la sección transversal. Esta información se utiliza para la normalización de los datos (ver sección 5.4).

Análisis 5. Datos

Analizar datos utilizando el software adecuado (por ejemplo, Windaq, LabChart).

  1. Para la actividad espontánea, seleccione una ventana de al menos 30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por drogas y measure amplitud y frecuencia de la actividad miogénica (Figura 3).
    1. Utilice el análisis de transformación rápida de Fourier para determinar el espectro de frecuencias que contribuyen a respuestas contráctil y si hay diferencias entre las diferentes partes de la vejiga (por ejemplo, la cúpula vs. cuello) o con el desarrollo, patología, y las drogas 8.
  2. Para efectos sobre el tono del músculo liso seleccionar una ventana de al menos 10-30 segundos antes y en el pico de la respuesta inducida por fármacos y medir la amplitud de la contracción.
  3. Para efectos sobre las contracciones neuralmente evocadas-medir la amplitud, la duración y el área bajo la curva de las contracciones (al menos 3) antes y en el pico de la respuesta inducida por fármacos.
    NOTA: Es necesario medir tanto la amplitud y el área bajo la curva de las contracciones inducidas por EFS porque los componentes purinérgicos y colinérgicas tienen diferentes cinéticas. El componente purinérgico es rápido y transitorio (ATP activa purinergic ionotrópicos canales tales como P2X1 que permiten afluencia rápida de calcio, entonces se insensibilizan), contribuyendo así más a la respuesta de amplitud de pico y menos para el área bajo la curva. El componente colinérgico es más lenta y sostenida (ACh activa los receptores muscarínicos metabotrópicos, que requieren más tiempo para activar las vías intracelulares que en última instancia, activan canales iónicos que despolarizan del músculo liso para inducir una contracción). Por lo tanto, el componente muscarínico se captura mejor midiendo el área bajo la curva.
  4. Normalizar los datos para poder comparar los resultados entre los tiras y tratamientos farmacológicos. El parámetro elegido para la normalización no debe estar influenciada por los compuestos de ensayo, condición patológica o estudió diseño experimental. Entre estos parámetros, el peso utilización tira, área de la sección transversal, las respuestas de KCl (Figura 4B),% de la respuesta máxima (Figura 7B) o% de la respuesta máxima a otro agente contráctil(Por ejemplo, CCh) o agentes de relajación (por ejemplo, papaverina).

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Resultados

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Actividad Myogenic espontánea

Actividad miogénica espontánea es una característica importante del músculo liso que sufre cambios con el desarrollo postnatal 6-9 y patología (por ejemplo, SCI, BOO) 3-5. Como se cree que esta actividad para contribuir a los síntomas de la vejiga hiperactiva (OAB) 2, una evaluación de los receptores, vías intracelulares y agentes farmacológicos que modulan ella, es de gran interés para el desarrollo de ...

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Discusión

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En este trabajo se describe un método simple en la contractilidad del músculo liso in vitro que se puede utilizar para hacer frente a una serie de importantes cuestiones científicas relacionadas con la fisiología y la patología de la vejiga, así como ayudar al descubrimiento de nuevos fármacos para el tratamiento de disfunciones de la vejiga. Hemos ilustrado el uso de este método para la evaluación de las propiedades de desarrollo, patológicas y farmacológicas de la contractilidad del músculo liso de l...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el NIH R37 DK54824 y R01 DK57284 subvenciones a LB.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
Sistema de baño de tejido con depósitoRadnoti, LLC159920baños de tejido aislados
Bomba recirculadora de agua calienteKent Scientific Corporation TPZ-749para mantener los baños de tejidos a 37 ° C
Sistema de
DataQ InstrumentsDI-710-UHPara ver, registrar y analizar datos
Transbridge Transductor AmplifierWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MAmplificador de transductor
Estimulador de céspedGrass TechnologiesModelo S88Estimulador
de anestesiaKent Corporación Científica ACV-1205SPara anestesiar al animal
Caja de anestesiaHarvard Apparatus 500116Para anestesiar al animal
Máscaras de anestesiaKent Scientific Corporation AC-09508Para anestesiar al animal
Materiales e Instrumentos Quirúrgicos
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITPara alfiler, diseccionar y cortar tejido
Placa de PetriCorning3160-152Para diseccionar/cortar tejido
Alfileres de insectosENTOMORAVIA Austerlitz Alfileres de insectostamaño 5Para sujetar tejido
Almohadilla de bancoVWR International56617-014Almohadillas de banco absorbentes
Kit quirúrgico para ratas KentScientific Corporation INSRATKITPara extraer y diseccionar tejido
2 Pinzas Dumont #3 KentScientific Corporation INS500064Para extraer y diseccionar tejido
Pinzas de tejidoKent Scientific Corporation INS500092Para extraer y diseccionar tejido
BisturíKent Scientific Corporation INS500236Para extraer y diseccionar tejido
Hoja de bisturí KentScientific Corporation INS500239Para extraer y diseccionar tejido
Professional Clipper Braintree Scientific, Inc.CLP-223  45Para quitar el pelo
Hilo de suturaFine Science Tools18020-50Tejido de amarre
Clips de tejidoRadnoti, LLC158802Fije el tejido a la varilla/transductor
1 g de peso  Mettler Toledo11119525Para la calibración de transductores
Chemicals
Krebs Solución:
Cloruro de sodio
Cloruro de potasio
Fosfato de potasio monobásico
Sulfato de magnesio
Dextrosa
Bicarbonato de sodio
Cloruro de calcio
Cloruro de		magnesio 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P. 217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		Para preparar la solución de Krebs
IsofluranoHenry Schein029405A anestesiar al animal
  Tanque de oxígenoMatheson Tri Gasox251Para usar con el sistema de anestesia
Tanque de carbógeno (95% de oxígeno; 5% de dióxido de carbono) Matheson Tri GasMoxn00hn36DPara airear las soluciones Krebs
adquisición de datos por computadora Sistema

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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