Análisis de Redes Tubular membrana en miocitos cardiacos de aurículas y los ventrículos

Resumen

En los miocitos cardíacos, estructuras tubulares de membrana forman redes intracelulares. Se describen protocolos para i) el aislamiento de los miocitos de corazón de ratón, incluyendo el control de calidad, ii) la tinción de células vivas para la microscopía de fluorescencia estado-of-the-art optimizado, y iii) el análisis de imagen directa para cuantificar la complejidad de los componentes y la plasticidad de la membrana intracelular redes.

Resumen

En los miocitos cardíacos, una compleja red de túbulos de membrana, el sistema de túbulos axiales transversales (TATS), controla las funciones de señalización intracelular profundas. Si bien la membrana de la superficie externa y los componentes asociados de la membrana TATS parecen ser continuos, existen diferencias sustanciales en el contenido de lípidos y proteínas. En los miocitos ventriculares (VM), ciertos componentes de TATS son muy abundantes, lo que contribuye a las redes de túbulos rectilíneos y a las arquitecturas 3D de ramificación regular. Se cree que los componentes periféricos de TATS propagan potenciales de acción desde la superficie celular a miles de dominios de contacto de membrana del retículo sarcoendoplasmásico intracelular (SER) remotos, activando así las unidades de liberación de Ca²⁺ intracelular (CRU). A diferencia de las VM, la organización y el papel funcional de las membranas de TATS en los miocitos auriculares (AM) es significativamente diferente y mucho menos conocida. En conjunto, la caracterización estructural cuantitativa de las redes de membrana de TATS en miocitos sanos y enfermos es un requisito previo esencial para una mejor comprensión de la plasticidad funcional y la reorganización fisiopatológica. Aquí, presentamos una combinación estratégica de protocolos para el análisis cuantitativo directo de redes de membranas TATS en VM y AM vivas. Para ello, acompañamos los aislamientos de células primarias de VM y/o AM de ratón con pasos críticos de control de calidad y protocolos de tinción directa de membrana para la obtención de imágenes de fluorescencia de membranas TATS. Utilizando un flujo de trabajo optimizado para el procesamiento de imágenes TATS confocal o de superresolución, se generan datos binarizados y esqueletizados para el análisis cuantitativo de la red TATS y sus componentes. A diferencia de las estrategias de análisis de imágenes agregadas regionales indirectas publicadas anteriormente, nuestros protocolos permiten la caracterización directa de componentes específicos y derivan propiedades fisiológicas complejas de las redes de membrana de TATS en miocitos vivos con herramientas de software de alto rendimiento y acceso abierto. En resumen, la estrategia de protocolo combinado se puede aplicar fácilmente para estudios cuantitativos de la red TATS durante la adaptación fisiológica de los miocitos o los cambios en la enfermedad, la comparación de diferentes tipos de células cardíacas o del músculo esquelético, el fenotipado de modelos transgénicos y las intervenciones farmacológicas o terapéuticas.

Introducción

En las células del músculo estriado sanos, estructuras de membrana tubulares con orientaciones "transversales" (T-túbulos) perpendiculares al eje de células principales son abundantes. En consecuencia, los túbulos T se han caracterizado como extensiones continuas de la célula muscular principal "lateral" membrana de la superficie (sarcolema), que penetran profundamente el citosol hacia el centro de la celda. El papel fisiológico de los túbulos T continuo con la membrana de la superficie exterior es el acoplamiento eléctrico rápido de los compartimentos intracelulares remotas formadas por dominios de contacto de orgánulos SER en todo el volumen relativamente grande de células del músculo cardiaco por acoplamiento de proximidad nanométrica de voltaje activado de tipo L de Ca ^{2 +} canales (Cav1.2) corriente de entrada (I _Ca) activación de los receptores de rianodina adyacente (RyR2) SER Ca ^{2 +} comunicados. En miocitos ventriculares (VM), los contactos de membrana no continuos ("uniones") entre los dominios de unión de SER y T-tubules se cree que controlar miles de nanodominios liberación de Ca2 ⁺ intracelular individuales en cada celda ^1.

Para cualquier dominio contacto dado, las porciones de membrana yuxtapuestos cada uno de los T-túbulos y el periférico (unión) SER son aproximadamente 15 nm cerca uno del otro, por lo tanto, se define como nanodomain. De esta manera, muy pequeñas subespacios citoplasmáticos individuales son segregados que permiten comportamientos compartimiento células autónomas cuasi. Cuando un potencial de acción entrante activa los canales Cav1.2 en los túbulos T de máquinas virtuales, una parte relativamente pequeña de Ca2 ⁺ hacia adentro corriente aumentará rápidamente el subespacio concentración de Ca2 ⁺ [Ca ^{2 +]} _S en el attoliter nanodomain tamaño ^1. A continuación, la [Ca ^{2 +]} _S aumento de Ca2 ⁺ activa los receptores de rianodina -gated (RyR2) dentro de la proximidad del nanómetro en la unión entre la membrana SER yuxtapuesta, y este proceso de acoplamiento se produce a lo largo de toda pareja eléctricamented miocitos nanodominios. RyR2s producen racimos de múltiples canales como densas con una estequiometría estimado de 1 canal Cav1.2 durante 5-10 RyR2 canales ^2. Desde la SER-a citosol [Ca ^{2 +]} gradiente es muy empinada (relación 10 ^4: 1) y RyR2s funcionan como alta conductancia Ca ^{2 +} canales de liberación de los clústeres funcionalmente acoplados, RyR2 activación resulta en una gran cuantitativamente Ca ^{2 +} versión actual de T-túbulos junto dominios SER unión crecientes subespacial local de [Ca ^{2 +]} _S 100 M o superior dentro de 1-2 ms ^3,4. Este comportamiento amplificación de la señal cardiaca también se conoce como Ca ^{2 +} inducida por Ca ^{2 + en} libertad (CICR). Tomados en conjunto, los túbulos T son esenciales estructuras de membrana que activan rápidamente las señales de liberación de Ca ^{2 +} a través de contactos SER nanodomain de unión y CICR ​​en toda la célula durante la excitación-contracción de acoplamiento (CE).

Además de los túbulos T, túbulo axials (A-túbulos) con una orientación significativamente diferente paralela a las principales (longitudinal) del eje de células han sido documentados por microscopía electrónica (EM), y estudios de microscopía confocal de 2 fotones. Por ejemplo, una red continua de toda la célula de A-túbulos entre miofibrillas interconectados con T-túbulos cerca sarcómero Z-líneas se demostró por trazadores extracelulares y EM imágenes de conejillo de indias fijo VM ^5. Uso de la tinción con fluoresceína dextrano ligado extracelular y vivir de imágenes 2-fotón de rata máquinas virtuales, una red de túbulos 3D reticular complejo se visualizó que consiste en ~ 60% túbulos T y ~ 40% A-túbulos ^6. Este estudio no sólo llevó a la visualización en 3D de abundantes A-túbulos, sino también a la comprensión de que el corte para la visualización EM está inherentemente limitado para el análisis de redes complejas y dinámicas de membrana como el sistema túbulo-transversal axial (TATS). En consecuencia, confocal imágenes de células vivas de las membranas TATS directamente manchada con di-8-ANNEPS fue desarrollado. Si de células vivasRedes TATS se analizaron por transformación de Fourier, el aspecto habitual de componentes túbulo-T en el espacio cerca del sarcómero líneas z se refleja en el espectro de potencia de conjunto de una región de señales estriados ^7. Esta estrategia de análisis indirecto se ha utilizado para detectar cambios regionales en todo el componente de células en la regularidad TATS en modelos de enfermedad ^7. Por ejemplo, shRNA mediada junctophilin-2 derribo provocó insuficiencia cardíaca y la deficiencia de proteína específica isoforma resultaron en reorganización T-túbulos con nanodomain Ca ^{2 +} disfunción versión ^8. Recientemente hemos ampliado el análisis de las redes de membrana TATS a través de enfoques cuantitativos directos y aún más por microscopia de super-resolución de células vivas de los componentes individuales en TATS ratón máquinas virtuales utilizando el agotamiento de la emisión estimulada (STED) nanoscopía ^9. Resolución de imagen nanométrica permitido para el análisis directo de los componentes TATS individuo más pequeños, que se aproximan una distribución 50:50 de transversalfrente a las orientaciones del túbulo axiales, confirmando cuantitativamente dos componentes TATS abundantes todavía orientados diferencialmente individuales en corazones sanos ratón ^9. Estas estrategias se describen con más detalle en la sección del protocolo de abajo.

Aunque el papel fisiológico de los abundantes componentes A-túbulos en el corazón adulto se ha mantenido enigmático, EM estudios han documentado estructuras de membrana SER asociados con A-túbulos que sugieren endógena Ca ^{2 +} nanodominios liberación en cobaya y rata VMs ^5,10. Confocal análisis de Cav1.2 y RyR2 encontró un alto grado de colocalización en las uniones A-túbulo ^10. Desde ~ 20% de los espontáneos Ca ^{2 +} chispas en rata VMs originó relativamente lejos de estrías Z-línea donde normalmente se producen túbulos T, un argumento ha sido que, efectivamente, pueden existir y funcionar nanodominios A-túbulo asociados como Ca ^{2 +} sitios de liberación ^11,12. Curiosamente, la formación de túbulos T-OC y la maduracióncurs sólo después del nacimiento y es paralelo al crecimiento de las células cardíacas, por ejemplo, a través de la brotación de invaginaciones del sarcolema precursor en P5 y inmadura ramificados asambleas red TATS en P10 en ratones ^13. Parece que Junctophilin-2 es particularmente importante para la maduración postnatal red TATS desde shRNA knock-down impidió que el anclaje de las membranas de los túbulos T-SER a los cruces que conduce a un retraso en la liberación de Ca2 ⁺ y la organización TATS patológicas compatibles con arquitecturas inmaduros A-túbulo dominadas en VM ^13. Estas observaciones pueden en última instancia conducir a una prueba de concepto de que los túbulos T se forman a través de procesos de invaginación de la membrana, mientras que A-túbulos pueden transformarse a través de mecanismos intracelulares adicionales o incluso alternativas ^14.

Caracterización de TATS cambios de membrana en las enfermedades del corazón se ha convertido en un área de investigación importante para cuestiones fisiopatológicas. Los informes iniciales en un modelo canino de estimulación inducida failu corazónre mostraron una pérdida de túbulos T y actual Cav1.2 (I _Ca) ^15. Un modelo de cerdo de miocardiopatía isquémica demostraron una reducción de la densidad de los túbulos-T y una sincronía reducido intracelular de Ca ^{2 +} en libertad ^16. Utilizando un modelo de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de la insuficiencia cardíaca, una pérdida de túbulos T se asoció con una reducción de acoplamiento nanodomain de Cav1.2 y RyR2 por el mecanismo propuesto de "RyR2 orfandad" ^7. Una pérdida de túbulos T también se ha demostrado en las VM humana a partir de muestras de miocardiopatía isquémica, dilatadas, hipertróficas y ^17. Además, se informó de un aumento de la A-túbulos en secciones de tejido de miocardiopatía dilatada humana ^18. A raíz de un infarto de miocardio, mostramos un mecanismo diferencial de TATS reorganización en ratón VM con disminuciones significativas de los túbulos T, en contraste con los aumentos de los componentes A-túbulo ^9. Es importante destacar que, la mejora de contraste local de lograrse a través de la membrana de células vivas superresolución STED microscopía de activar el análisis de componentes cuantitativa detallada a través de mediciones directas, que mostraron una proliferación significativa de la A-túbulos con aumentos globales de la longitud de la red TATS y complejidad de ramificación ^9. Además, se demostró que el entrenamiento físico puede revertir la remodelación T-túbulo en ratas después de infarto de miocardio ¹⁹ y que la terapia de resincronización cardiaca puede conducir a revertir la remodelación de los túbulos T en perros con insuficiencia inducida tachypacing fibrilación corazón ^20. En conjunto, los estudios tanto en las intervenciones terapéuticas potenciales humano enfermo y animal máquinas virtuales, así como posiblemente se beneficiarán de los procedimientos de aislamiento de células de alta calidad y estrategias de análisis cuantitativos detallados como se indica en el protocolo y los resultados de las secciones a continuación.

Además, como se ha demostrado recientemente por superficie lateral frente TATS el tráfico de membrana de canal de KATP isoformas ^21, es importante tener en cuenta m fibrilaciónyocytes (AMS) como biológicamente diferentes, así como comparativas modelo celular cardiaca frente a las máquinas virtuales. T-túbulos fueron recientemente documentados en ovejas y acompañamiento humano ^22. La evidencia actual sugiere que existen pocos túbulos T en células de AM y normalmente en los mamíferos más grandes, como las ovejas y los seres humanos, pero no en los roedores pequeños ^23. A diferencia de las máquinas virtuales, en los AM aparece intracelular de Ca ^{2 +} liberación se produzca a partir de la propagación de la superficie celular por difusión hacia el centro de la celda que se traduce en marcado Ca espacial y temporal ^{2 +} gradientes ^23. Dentro de este marco parece importante dilucidar los mecanismos de Ca ^{2 +} señalización intracelular inestabilidad de las formas de enfermedades comunes tales como la fibrilación auricular ^24. En resumen, tanto el aislamiento de células AM y VM y cada uno de los corazones sanos y enfermos se emplean comúnmente protocolos. Sólo si el aislamiento de células se hace correctamente, a juzgar por la documentación microscópico de calidad suficiente de células, las muestras de AM y VM deben ser carried hacia adelante para el análisis cuantitativo TATS. Por consiguiente, las siguientes secciones de protocolo son críticamente dependientes de células de alta calidad aislados de ratón o de otras especies, seguido por microscopia de células vivas para analizar las membranas intactas TATS. Como se ha señalado anteriormente, la caracterización de membranas TATS es un área de investigación difícil, con una propensión a la fijación y preparación de artefactos ^6, los cambios de la membrana debido a alteraciones osmóticos y limitaciones de la resolución de la microscopía de luz convencional ^9. Tomamos nota de que los protocolos recientes del estado de la técnica para el aislamiento de los AM humanos de Ca ^{2 +} de imágenes y patch-clamp y de rata máquinas virtuales para el cultivo celular se han publicado previamente en esta revista ^25,26.

Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Centro Médico de Goettingen en el cumplimiento del cuidado humano y el uso de animales de laboratorio.

1. aislamiento de miocitos auriculares y ventriculares del corazón alfombrillas

1. Maneje animales tan suavemente como sea posible y de acuerdo a los protocolos aprobados para minimizar el estrés en general y específicamente para evitar potenciales poderosos efectos involuntarios de excesos neurohormonales en células cardíacas aisladas. Además, inyectar cada ratón con heparina (500 UI / kg sc peso corporal) al menos 20 min antes de la extracción del corazón para prevenir la coagulación de la sangre y micro émbolos que pueden comprometer de manera significativa el rendimiento y la integridad de las células cardíacas durante el aislamiento.
2. Anestesiar a los ratones de más de 12 semanas o más años por inhalación de isoflurano, confirmar la ausencia de reflejos de retirada dolor y eutanasia a los animales por dislocación cervical.
   1. Extraer el corazón con rapidez siguiendo los protocolos de expertos establecidos con anterioridad (por ejemplo, ver Kaestner et al., ²⁶ y Louch et al. ^27). Evite cualquier daño accidental a las aurículas por compresión innecesaria o estiramiento.
   2. Preservar cuidadosamente el tejido de la aorta ascendente proximal utilizando un par de fórceps y tijeras rectas tocón para establecer un borde de corte transversal continua a través de la pared del vaso de la aorta, que es importante para la canulación y la perfusión del corazón éxito.
3. Transferir el corazón extirpado de inmediato en hielo-frío nominalmente Ca ^{2 +} tampón de perfusión libre (para soluciones ver Tabla 1). Mantenga los grandes vasos sujetadas durante la transferencia a través del aire en el buffer para evitar una embolia gaseosa inadvertida hasta que el corazón está totalmente sumergido. Utilice BDM en las soluciones tampón y enfriada con hielo para inhibir la contracción cardíaca.
4. Utilice un microscopio binocular con suficiente illum 3Dminación.
   1. Canular la aorta bajo estereovisión panorámica del corazón con una superficie lisa y pulida 21 G cánula (diámetro exterior de 0,81 mm; para el normal peso del corazón del ratón) que debe ser llenado completamente con buffer. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la cánula mediante la conexión de una solución depósito próximo (por ejemplo, una jeringa) a través de una válvula Luer 2 vías que permite el control del flujo de disolución rápida.
   2. Confirmar bajo ampliación binocular que la cánula está colocada correctamente dentro de la aorta, que es de aproximadamente 1 mm por encima de las válvulas aórtica y las ramas de las arterias coronarias. Absolutamente evitar el paso a través o perforación accidental de las válvulas aórticas con la cánula (esto alterará permanentemente cierre de la válvula aórtica y en consecuencia interrumpir la perfusión cardiaca).
5. Ate la aorta suavemente para ranuras antideslizantes a medida, orientada circunferencialmente cerca del extremo de la cánula utilizando dos suturas de seda. No enjuagar la arteri coronariait fuerza en cualquier punto. Conecte la cánula solución lleno atado a la aorta y el corazón a un conector de salida ajustadas al contorno de un sistema de perfusión calibrado pre personalizado y, también conocido como la configuración Langendorff modificada (ya sea mediante la presión constante o flujo constante, véase también la sección más adelante).
6. Perfundir el corazón tan pronto como sea posible durante 4 min usando tampón de perfusión oxigenado a 37 ° C (velocidad de perfusión de destino: 4 ml / min). Iniciar la digestión por el cambio de la perfusión a la colagenasa que contiene tampón de digestión (600 U / ml de colagenasa tipo II) para 8-10 min a 37 ° C. Monitorear el progreso de la digestión de los tejidos mediante la confirmación de cambios en los tejidos similares, incluyendo el aumento de la opacidad, la suavidad y la flacidez en toda la superficie del corazón aparente.
7. Diseccionar las cavidades cardíacas, según sea necesario después de la digestión. Coloque el corazón canulado bajo un microscopio binocular y visualizar la pared del corazón posterior. Diseccionar tejido residual por ejemplo, no cardiaco, pulmón unand partes de los buques para evitar la contaminación de células en el tampón de digestión usando tijeras micro (por ejemplo, tijeras de primavera con 8 mm cuchillas rectas), como se muestra en la Figura 1.
8. Sigue una lista de verificación que deben cosecharse cámaras particulares, regiones y / o células de la colagenasa digerido corazón (Figura 1): a la izquierda y / o aurícula derecha, izquierda libre y / o en la pared del ventrículo derecho, y / o del tabique ventricular.
   1. Para la disección de los tejidos cardíacos específicos, use un relativamente ancho y plano de disección de baño revestido con varios mm de espesor de capa de elastómero de silicona de plástico. Fijar el ápice del corazón con un perno de acero de insectos bien a la capa de elastómero inferior.
   2. Desviar la orejuela de la aurícula derecha y diseccionar la aurícula derecha justo por encima de las válvulas auriculoventriculares. Continuar la disección con la aurícula izquierda. Diseccionar y deseche el aparato valvular fibroso. Por último, diseccionar las paredes ventriculares libres izquierdo y derecho y el tabique y / o pequeñoser partes de tejido según sea necesario.
   3. Nota sólo para los alumnos: para ganar práctica, comenzar con los corazones del ratón no digeridos. Para facilitar la orientación anatómica, practicar la manipulación de tejidos incluyendo todos los pasos consecutivos de disección bajo visión binocular como se muestra en la Figura 1. Una vez que la anatomía 3D, la manipulación manual bajo visión binocular, y los pasos de disección están suficientemente familiarizados, continúe con los corazones de ratón digerido con colagenasa como descrito anteriormente.
9. Para los miocitos ventriculares (VM) de aislamiento de células: transferir el tejido ventricular en 2,5 ml de tampón de digestión fresco. Si se intenta aislamientos de células simultáneas de varias partes de órganos, por ejemplo, aurículas y ventrículos, una segunda persona puede hacerse cargo de una pierna del procedimiento de disociación de células, tanto para minimizar y optimizar el uso de los ratones a través de la manipulación coordinada de múltiples tejidos cardíacos. Continúe con los pasos 1.9.1-1.9.4, después 1,10.
   1. Diseccionar, ya sea toda la tejido ventricularo parte de las mismas (por ejemplo, LV, RV, paredes libres, y / o tabique) en aproximadamente 1 mm ³ piezas en 2,5 ml de tampón de digestión usando unas tijeras afiladas (por ejemplo, tijeras de primavera con 8 mm hojas rectas) en una placa de 60 mm Petri .
   2. Disociar suavemente máquinas virtuales en suspensión de células por trituración lenta de las piezas de tejido con una pipeta de transferencia. Evite cualquier burbujeo de aire en la suspensión celular.
   3. Añadir 8 ml de tampón de parada a la suspensión celular VM y transferir la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Permitir que las piezas de tejido restantes se asienten en la parte inferior durante aproximadamente 15 segundos, pero lo suficientemente corto para que las células aisladas para permanecer en suspensión. A continuación, la suspensión cosechar VM a través de transferencia del volumen de sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml. Si las piezas de tejido excesivas están presentes, usar alternativamente una malla de nylon mínimamente 200 m espaciadas para separar las piezas de tejido de la suspensión celular.
   4. Deje que la suspensión de células VM depositan en el fondo de un co 15 mltubo técnica por gravedad durante 8 min.
   5. Lave paso: eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet VM restante en 10 ml de tampón de perfusión. Repita el paso de lavado 1.9.5 (opcional: añadir medidas adicionales de lavado para aumentar gradualmente la concentración de ^{Ca2 +,} según sea necesario).
   6. Resuspender el precipitado VM asentado en tampón de perfusión de 10 ml y distribuir el volumen de suspensión celular restante en 1,5 ml tubos de microcentrífuga (aproximadamente 50.000 células VM por tubo).
10. Para fibrilación miocitos (AM) de aislamiento de células: transferir el tejido auricular digerido / diseccionado en 1 ml de tampón de digestión fresco.
    1. Cortar el tejido auricular parcialmente digeridos en aproximadamente 1 mm ³ piezas en tampón de digestión 1 ml utilizando micro tijeras en una pequeña placa de Petri (por ejemplo, diámetro 60 mm). Disociar suavemente las células AM de las piezas de tejido digeridas en suspensión celular mediante trituración con una pipeta de plástico de 1 ml con una punta de corte para evitar los chorros de fluido dañinos. Durantetrituración estrictamente evitar cualquier formación de burbujas de aire en la suspensión celular. Después de la agitación mecánica, añadir 4 ml de tampón de parada (50 mM _CaCl2; BCS al 10%) para detener cualquier actividad de la colagenasa que queda en suspensión de células.
    2. Transferir la suspensión celular AM en un tubo cónico de 15 ml. Permita que las piezas de tejido restantes se asienten en la parte inferior de aproximadamente 15 segundos, pero lo suficientemente corto como para que las células aisladas para permanecer en suspensión. Se recoge el volumen de sobrenadante que contiene las células SOY libre a través de la transferencia de la solución a un nuevo tubo de 15 ml.
    3. Centrifugar la suspensión de células AM, por ejemplo, 2 min a 20 xg a temperatura ambiente o - preferible para los estudios de membrana - dejar que las células se asientan hacia abajo lentamente por gravedad durante 20 min en un tubo cónico de 15 ml.
    4. Lave paso: descartar el sobrenadante y suavemente resuspender el precipitado AM en 5 ml de tampón de perfusión. Repita 1.10.4.
    5. Resuspender las células AM suavemente en tampón de perfusión de 5 ml. Distribuir el volumen de suspensión celular en 1,5 ml bañera de microcentrífugaEs (aproximadamente 1000 AM células por tubo).
11. Analizar y documentar la calidad de la población aislada de células para cada corazón, incluyendo el rendimiento de células mediante tinción con azul tripán.
    1. Para ello, diluir 500 l de la suspensión celular como 1: 1 vol / vol con solución de azul de tripano (concentración final 0,02%) utilizando 1 ml puntas de pipeta corte. Mezclar las células y el azul tripán suavemente por muy lento hasta pipeteo / abajo. Inmediatamente aplicar el azul de tripano que contiene la suspensión celular a un tipo citómetro de Neubauer mejorada y contar los miocitos intactas usando un microscopio invertido.
    2. Excluir las células con daño aparente, vesículas de membrana, estrías interrumpidas, contracturas, y las células que se acumulan azul tripán intracelular (Figura 2). También excluyen espontáneamente contraer las células, que son susceptibles a la muerte celular subsiguiente. Para evaluar el recuento de células intactas en suspensión, utilizar sólo los miocitos cardíacos con estrías regulares que excluyen tripán azul a lo largo deel volumen celular.
12. Juzgar la integridad de los miocitos auriculares y ventriculares individuales por microscopía de luz transmitida. Guardar la imagen de campo claro como un archivo TIF para la documentación y su posterior análisis.
    1. Utilice los siguientes criterios para el análisis de la integridad de la célula cardiaca:
       1. confirmar la presencia de estrías regulares durante todo el volumen de la celda visible;
       2. confirmar la integridad continua de la membrana de la superficie lateral en ambos lados de las celdas en paralelo a los miofilamentos;
       3. visualizar estrías afiladas en los discos intercalados en ambos lados de las celdas que reflejan la integridad de las estructuras específicas de la membrana de la superficie; y
       4. visualizar las señales fluorescentes de membranas TATS (o immunolabeled proteína caveolina-3 u otros marcadores de membrana) como se describe en la sección 3 de la correlación de localización al lado del campo brillante imagen la morfología específica de la célula subyacente (por ejemplo, combinar dos imágenes con ImageJ como imag compuesto superposicióne).
       5. Determinar la longitud del sarcómero de las imágenes de campo claro. Para longitud media sarcómero, medir la distancia de forma secuencial alineado estrías sarcómero, y dividir la distancia por el número de sarcómeros. Medir al menos dos lugares por célula. Realice el análisis con software comercial o fuera de línea con ImageJ.
          NOTA: Si se trata con agentes de desacoplamiento, intacta VMs relajado de corazón de ratón muestran una longitud media sarcómero de ~ 1,9 m ^28.
13. Cuantificar la morfología y dimensiones de los miocitos auriculares y ventriculares individuales de la imagen de microscopía de luz transmitida. Considere que las células de AM y VM difieren significativamente de tamaño. Mida la longitud de la célula, la anchura, y la zona, y calcular la longitud: anchura.
    1. Analizar las dimensiones de la celda 2D a partir de la imagen de la luz transmitida en ImageJ utilizando la herramienta de selección de comandos polígono y añadir al gestor de retorno de la inversión, de forma análoga a la Figura 3. Si c morfológicoSe espera que Hanges dentro de los contextos específicos de estudio, más documento para todas las células de la cepa de ratón específico, la edad, el sexo, el tamaño del corazón, y cualquier intervención para la clasificación de datos subsiguiente.

2. tinción de TATS Membranas en Living Los miocitos auriculares y ventriculares

1. Cargue la cámara de imágenes (por ejemplo, POC-R2) con un cubreobjetos de vidrio de 42 mm. Para la fijación de los miocitos estable para el cubreobjetos, preparar 20 l de solución de laminina por dilución 1:10 de la población de laminina en tampón de perfusión fisiológica (concentración final 0,2 mg / ml). Corre 20 l de la solución de laminina uniformemente en cubreobjetos de vidrio.
2. Preparar 800 l de una solución de di-8-ANEPPS 50 mM en tampón de perfusión. Para ello, diluir 20 l de 2 mM solución di-8-ANEPPS de stock en 780 l de tampón fisiológico.
3. Para la tinción de las máquinas virtuales, permiten que las células se depositan por gravedad durante 8 minutos en un tubo de 1,5 ml de reacción. Para la tinción de acompañamiento, o bien utilizar la sedimentación por gravedad o spen la suspensión celular durante 2 min (consulte 1.10.3). Por tanto el AMS y máquinas virtuales, retirar cuidadosamente el sobrenadante evitando al mismo tiempo la agitación innecesaria del sedimento celular y resuspender suavemente el sedimento celular en 800 l de di-8-ANEPPS que contiene la solución (50 M). Transferir inmediatamente el di-8-ANEPPS / suspensión de los miocitos en el cubreobjetos recubiertos de laminina en la cámara de imágenes.
4. Manchar la suspensión VM durante 15 min a TA en la oscuridad.
5. Retire lentamente exceso de volumen a través de los menisco de fluido hacia arriba en los lados de la cámara de imágenes con una pipeta manual. Confirme que los miocitos la mayoría de los di-8-ANEPPS manchadas continúa estando firmemente unidos a la laminina cubreobjetos recubiertos y no se convierten en expuestos al aire. A continuación, lavar la suspensión de miocitos adjunta una vez por adición lenta de 1 ml de tampón de perfusión seguido de la eliminación de cualquier exceso de líquido incluyendo las células no adherentes.
6. Superponer con cuidado los miocitos manchadas y la superficie que se suministran con 1 ml de tampón de perfusión lenta desde el lado de tque la formación de imágenes de cámara. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio.

3. Imaging de Estructuras TATS membrana en Living Los miocitos auriculares y ventriculares

1. En general, elija cuidadosamente la mejor opción posible microscopio de fluorescencia (s) disponibles para la imagen de la membrana TATS. Para la imagen confocal, considere la generación reciente, microscopios de fluorescencia modernas con detectores optimizados matriz PMT y las vías de reciclaje de fotones que maximizan la intensidad de la señal fluorescente. Para la imagen confocal de detalles más pequeños de TATS estructuras de membrana utilizan un objetivo 63X petróleo 1.4 NA o - dependiendo de la disponibilidad - utilizar un microscopio de super-resolución STED para detalles más pequeños como TATS opinión para aplicaciones de miocitos específica por Kohl et al ³⁴ para principios generales de alta. microscopía de fluorescencia de resolución, consulte la sección de discusión.
2. Establezca los parámetros de imagen para detectar más, idealmente todos mem intracelular di-8-ANEPPS manchadobranas dentro de un plano de imagen de miocitos dado. Utilice los siguientes parámetros como punto de partida para microscopía confocal de barrido láser: 458 nm de excitación, por ejemplo, en el 3% de la potencia del láser máxima; detectar la señal emitida entre 550 nm y 740 nm; ganancia del detector (por ejemplo, el mando principal 800); y pinhole 1 UA para un grosor de corte óptico de 900 nm. Ajuste estos parámetros para optimizar la relación señal-ruido.
3. Utilice el modo de campo claro para seleccionar una AM intacta o celular VM en su caso (Figuras 4A y 4B). Consulte el punto 1.12 de criterios pertinentes la manera de juzgar la integridad celular para seleccionar las células que se resumen: estrías regulares a nivel de células y separación igual sarcómero, bordes de superficies afiladas y bordes dentados en los cuatro lados de las celdas, la integridad continua de la membrana de la superficie lateral, y la ausencia de cualquier vesículas de membrana.
4. Tome una imagen de muestra de una sección de miocitos intracelular central. Para ajustar el ROI utilizar la "cosecha" función →; Ajustar la ventana de recorte → el tamaño final pixel mide 100 nm x 100 nm. Ajustar el eje x de la ventana de recorte para corresponder con el mayor (axial / longitudinal) eje del miocito.
5. Seleccione el plano de la imagen final. Utilice cuadros de imagen individuales para seleccionar manualmente el plano de la imagen apropiada en la dirección z. Confirme que las membranas TATS, incluyendo T-túbulos y componentes de un túbulo, son visualmente evidentes en el plano focal. Tenga en cuenta que un avión típico de formación de imágenes intracelular puede incluir un núcleo como punto de referencia intracelular. Consulte los ejemplos de las Figuras 4A y 4B.
   NOTA: En general, mantener la exposición de células a la luz láser lo más corta posible. Si es posible, utilizar cuadros de imagen individuales para determinar el plano focal óptima en los miocitos cardíacos.
6. Ajuste el tiempo de permanencia de píxeles aproximadamente 0,5 microsegundos. Seleccione 16x promediado y grabar la imagen como instantánea. Repita el paso foto de la imagen para establecer la imagen apropiada plano uns indicado para estructuras de membrana TATS en 3.5, según sea necesario.
7. Guardar la imagen final y confirme que el archivo se ha guardado en su carpeta de destino. En general, guarde todos los archivos de imagen en el mismo formato (por ejemplo, LSM) para la aplicación uniforme de software de análisis. Antes de cualquier análisis de la imagen, una vez más confirmar suficiente integridad celular fuera de línea (considerar los criterios enumerados en el paso 1.12.1) y excluir las células dañadas del análisis. Consulte los ejemplos de las figuras 4C y 4D.

4. Análisis de la Red de membrana TATS y sus Componentes

Los siguientes pasos de procesamiento de imágenes para el análisis directo de componentes de la membrana TATS se resumen como diagrama de flujo de trabajo de arriba hacia abajo en las figuras 5A y 5B.

1. Abra el archivo de imagen de un miocito manchado di-8-ANEPPS en Fiji (http://fiji.sc/), una variante de la libre disposición de ImageJ que contiene plugins esenciales para el análisisprocesamiento de imágenes. Para más información por favor consulte Schindelin et al ^29.
2. Guarda la imagen → Archivo → Guardar como → Tif.
3. Analizar los componentes de la membrana TATS, seleccione el ROI apropiado excluir la señal de membrana de la superficie exterior, a continuación, utilizar la herramienta "polígono de selección" para delinear la frontera ROI con exclusión de la membrana de la superficie exterior (sarcolema) y que incluye las porciones intracelulares de las membranas TATS como se muestra en Figura 5A (ROI). Añadir la ROI seleccionada para el "Administrador de ROI" aplicando Analizar → Herramientas → ROI Manager.
   1. Para seleccionar un ROI específico para el análisis de la orientación de los componentes TATS, alinee el eje principal longitudinal celular y la imagen x-eje en paralelo. Si la célula es ligeramente curva, seleccionar varias regiones de interés y alinear cada ROI de forma individual. Excluir cualquier núcleos del análisis. Excluir las células excesivamente curvadas del análisis debido a la alineación precisa de RIO será cada vez más difícil y aumentar los errores de orientación durante el análisis.
4. Eliminar toda la información de la señal no deseada de la membrana de la superficie exterior: Editar → Borrar Fuera de generar el "ROI seleccionada" (Figura 5). Asegúrese de que el retorno de la inversión seleccionado sólo contiene las porciones de membrana intracelular, que se corresponden con la red TATS.
5. Realice la siguiente cadena de pasos de procesamiento de imágenes (comandos) antes del análisis cuantitativo posterior tal como se documenta en la Figura 5A.
   1. Haga clic en → Proceso → Antecedentes Reste. Ajuste el radio de la esfera rodante a 5 píxeles.
      NOTA: Ajuste el radio de la bola que rueda a 5 píxeles si la imagen que se analiza tiene un tamaño de píxel de 100 nm x 100 nm. Para otros tamaños de pixel ajustar el radio de la bola rodante para el número de píxeles que corresponden aproximadamente a un radio física de 500 nm.
   2. Haga clic en → Proceso → Mejorar contraste local (CLAHE). Ajuste el tamaño de bloque a 49, los intervalos del histograma a 256, la pendiente máxima a 3, y la máscara de "ninguno".
   3. Haga clic en → Proceso → Smooth.
   4. Haga clic en → Plugins → Segmentación → Región Estadística Fusión. Establezca los parámetros de Q100 → haga clic en Mostrar Promedios.
   5. Confirmar el procesamiento completo de la región estadística de fusionar indicado por la presentación automática de un nuevo cuadro de imagen y confirme que aparece la etiqueta "SRM Q = 100". Continuar los siguientes pasos con este archivo de imagen. Haga click en la imagen → → Tipo → 8 bits.
   6. Haga clic en → Imagen → Ajuste → Umbral. Elija el umbral lo suficientemente bajo para detectar la mayoría, idealmente todas las estructuras TATS, en particular, la exclusión de evitar componentes TATS con una baja intensidad de señal (umbral de 40 como punto de partida). Consulte la sección "Los resultados representativos" para la salida de datos detallada y los ejemplos de la Figura 6(Umbral superior de 255). Documentar la elección final de los parámetros de umbral. Tenga en cuenta que la elección correcta del umbral debe producir estructuras sólo específicos de membrana TATS pero no señales de falsos positivos debido a ruido de fondo.
   7. Confirmar correcta superposición de TATS detalles de imagen frente a los datos extraídos esqueleto, en particular para los niveles de la señal de fluorescencia media y alta, que debe coincidir con el (des) la continuidad de la estructura de esqueleto. Una vez que un umbral apropiado ha sido identificado, aplicar este mismo umbral a todas las imágenes durante el análisis y repetir la comparación de superposición de la señal original frente a los datos de esqueleto para minimizar consistentemente esta fuente potencial de sesgo.
   8. Haga clic en → Aplicar: los datos de imagen se convierte en binario como se muestra en la Figura 5 en "Threshold".
   9. Haga clic en → Plugins → → Esqueleto Skeletonize (2D / 3D). Guarda la imagen en 2D esqueleto (como se muestra en la Figura 5) como archivo Tif poral hacer clic en Archivo → → Guardar como → Tif. Analizar el archivo de imagen de esqueleto para la salida de los datos cuantitativos, haga clic en → Plugins → Analizar Skeleton (2D / 3D). Elegir método de ciclo Prune: ninguno. Confirmar la generación automática de la tabla de datos resultante.
   10. Guarde la tabla de datos generados automáticamente como archivo txt. Seleccione los parámetros cuantitativos pertinentes, por ejemplo, el número total de puntos de ramificación o la duración media rama como lo demuestran los datos de ejemplo en la figura 7. Considere su posterior análisis de datos con herramientas de apoyo complementarios / software como Excel y, según proceda.
6. Considere la posibilidad de usar rutinas automatizadas de procesamiento de imágenes cada vez que sea posible, incluyendo todas las medidas necesarias que se describen en el punto 4.5 de armonizar el análisis entre las imágenes individuales y / o lotes de imágenes. Utilice el ejemplo del archivo Código suplementario que contiene una macro de procesamiento de imágenes programada para Fiji (ajustar la programación según sea necesario).
7. Analizar el enorientaciones individuales de todos los componentes de la red o seleccione TATS de los datos de imagen esqueletizadas por el plugin de Fiji "direccionalidad". Generar un histograma direccionalidad donde la respectiva orientada axialmente A-túbulo o componentes-T túbulo orientadas transversalmente están representados por los 0 ° o 90 ° contenedores. Nota la referencia correcta de orientación de la imagen y que es importante para el eje x de la imagen para que se corresponda estrechamente con los principales (longitudinal) 0 ° eje de la célula VM como se muestra en la Figura 8 y resultados representativos.
   1. Haga clic en Analizar → → → Direccionalidad especificar Método: componentes de Fourier, Nbins 180, histograma iniciar -45 → haga clic en Mostrar tabla.
   2. Guarde la tabla de resultados recién generado y mostrado incluyendo datos del histograma asociados como archivo txt. Considere la posibilidad de un análisis más detallado de los datos del archivo txt por herramientas de software gratuitos como Excel y, según sea necesario.
8. Para generar subclases dedatos como conjuntos de datos agrupados por ejemplo, para todas las células tratadas en las mismas condiciones (y potencialmente otras enfermedades), repetir el análisis de los pasos 4.1 a 4.7 para todas las imágenes correspondientes, según proceda. Importar los parámetros de datos esqueletizadas de todas las imágenes en un archivo Excel combinada con el fin de obtener los valores promedio. Además, importar todos los datos del histograma direccionalidad del mismo conjunto de datos agrupados en un archivo combinado Excel para calcular y generar el histograma promedio direccionalidad. Considere la posibilidad de su posterior procesamiento de conjuntos de datos agrupados para analizar los parámetros de red TATS adicionales de interés para los diferentes grupos de tratamiento individuales o entre, según sea necesario.

Resultados

Además, para el análisis de redes membrana TATS una serie de técnicas de biología celulares de uso común como intracelular de Ca ^{2 +} de imágenes, electrofisiología patch-clamp, o estudios de dosis-respuesta farmacológica depende críticamente de alta calidad de aislamiento de células primarias de las aurículas o los ventrículos o seleccionar partes de tejido del corazón para permitir la caracterización de los miocitos cardíacos intactas diferenciadas, estructuralmente y fisiológicos maduros. Por lo tanto, la evaluación del aislamiento y la calidad de las células de AM y VM descritas en el apartado 1 son, en última instancia útil para muchas preguntas diferentes, incluyendo el análisis de redes TATS aquí descrito, que depende fundamentalmente de la membrana intacta y la integridad celular.

Figura 1 se presenta un manual paso a paso de las imágenes de cómo proceder con la disección de tejido cardíaco a partir de las cámaras auriculares en el corazón del ratón. Posteriormente, se preparan las cámaras ventriculares y el tabique und diseccionado según sea necesario. Selección y preparación de las piezas de tejido correctos precisa es importante establecer de forma fiable AM ​​y VM aislamientos con suficiente pureza celular. Después de la digestión de colagenasa puede ser relativamente difícil identificar la línea correcta de la disección entre el tejido auricular y ventricular, sin embargo, una vez que las células AM y VM se mezclan en suspensión celular incontrolada, es imposible invertir la población de células mixtas. Por lo tanto, la orientación anatómica, visualización de tejidos 3D, una experiencia suficiente con la manipulación de tejidos digeridos, la correcta identificación de las piezas de tejidos específicos y sus líneas de disección, contribuirán al éxito de la celda de aislamiento.

Figura 1.Dissection de tejido auricular. (A) Frente a la parte anterior del corazón, dos s quirúrgicosutures fijar la aorta proximal al extremo tronco de una cánula de 21 G de acero. (B) Vista hacia los espectáculos básicos corazón restantes tejido pulmonar obstruir la vista cámara auricular durante la disección. LA, la aurícula izquierda; RA, aurícula derecha. (C) lungtissue restante y los grandes vasos fueron retirados para acceder a las cámaras auriculares. Lleno triángulo negro, la arteria pulmonar; triángulo estriado, las venas pulmonares; lleno triángulo blanco, la vena cava superior; triángulo en caja, vena cava inferior. (D) En primer lugar, la pared de la aurícula derecha se diseca mientras que las pinzas tienen el apéndice auricular. (E) Ver en la cavidad de la cámara auricular derecha. El triángulo negro marca el tabique interauricular intacto. (F) La disección se continúa para entrar en la cavidad de la cámara de la aurícula izquierda. (G) Después de la disección completa de las aurículas izquierda y derecha, las válvulas auriculoventriculares se hacen visibles. El aparato valvular fibrosa se diseca y se desecha a subsequently cosechar sólo el tejido muscular ventricular. vista (H) posterior de las aurículas izquierda y derecha aisladas. LA, la aurícula izquierda; RA, derecha atrium.Scale bares: 700 m.

Para determinar la calidad de los aislamientos de células, la Figura 2 proporciona ejemplos de células típicas durante la evaluación del rendimiento y la viabilidad de la varilla típica o miocitos intactas estriado en forma de ladrillo, tanto para AMS y máquinas virtuales. Poco dañado, visualmente discreto, así como las células gravemente dañadas con morfologías anormales excesivamente curvos, o células anormales en forma esférica, se pueden identificar fácilmente incluida la exclusión de azul de tripano como se describe en la sección 1.11. Mientras miocitos intactas siguen siendo brillantes y homogéneamente estriado cuando se expone a tripán azul extracelular, las células dañadas muestran típicamente múltiples vesículas de membrana y / o rápidamente se acumulan daños en la membrana que indica intracelularmente azul tripano. Sin embargo, el azul tripán por sí mismo puede dañar las células a través de unnecessarily larga incubación y evaluación inmediata de la calidad celular es, por tanto, obligatoria. Los ejemplos de las formas más evidentes de daño celular como contractura myofilament o daños en la superficie bruta de comprometer la integridad celular se muestran en las figuras 4C y 4D. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Trypán tinción de células de exclusión con azul. Aislados (A) AM y las células (B) VM se mezclan en suspensión con azul de tripano y se visualizaron con un microscopio de luz invertida se muestra en 40Xmagnification. Nota thatabnormal células esféricas en (A) y (B), teniendo en azul tripán, que indicatesmembrane leakaGE y el daño estructural. En contraste, las células centralAM y VM con membranas intactas excluyen azul tripán como se muestra. Por otra parte, cabe destacar que AM intacto y las células VM muestran estrías sarcómero en todo su volumen celular, ampollas nomembrane y bordes afilados en los dos lados laterales y ambos discos intercalares. Las barras de escala: 20 m.

Tras el éxito registrado rendimientos de aislamiento, los teléfonos de las máquinas virtuales de 5 x ¹⁰ mayo a 10 junio se puede esperar de una sola digestión corazón de ratón. El rendimiento de AMS es significativamente inferior en el orden de 3 x ¹⁰ 03 al 03 x 10 ^4, azul de tripano en forma de barra con exclusión de las células. En contraste con VM, AM aislamientos ocasionalmente fallan incluso en manos expertas. Paso 1.11 resume los procedimientos de cómo estimar el rendimiento de las células sanas aisladas en suspensión. Además, determinar las dimensiones de celda promedio a través de paso 1.13, como se muestra en la Figura 3 para AM individuo o aislamientos de células VM o para comparar AM frente a las poblaciones de células VM de lado a lado (según sea necesario). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3.Bright análisis de campo morfométricos de los miocitos cardíacos. El contorno VM fue detectado por las herramientas de análisis de imágenes que se describen en el paso 1.13. Utilice la herramienta de selección poligonal visualmente marca y definir la frontera extracelular celda definida por la membrana de la superficie exterior para su análisis. Anuncio de la región seleccionada de interés (ROI) al gestor de retorno de la inversión seguida por las mediciones de distancia 1D. Para los estudios comparativos de AM versus dimensiones VM, es útil para documentar la longitud de la célula, la anchura, y la zona, y para calcular la longitud: anchura.

nt "> Para membranas fluorescencia TATS mancha ya sea en células AM o VM, el tinte de membrana integral-ANEPPS di-8 se utiliza como se describe en la sección 2, seguido por microscopía confocal, que dio lugar a las imágenes representativas de las redes TATS mostrados en las figuras 4A y 4B. Además, la Figura 4A muestra la correspondiente imagen de luz transmitida de un AM intacta de lado a lado de la imagen confocal con TATS (para la adquisición de imágenes véase la sección 3). Tal como se describe a paso 1,12, la integridad de la membrana y la superficie morfológica de vida miocitos se juzga a través de las imágenes de luz transmitidos. La región amplificada de la señal de di-8-ANEPPS destaca la morfología subyacente de la red en TATS de AMS, caracterizado por abundante axiales (longitudinales) túbulos de membrana. En contraste, la morfología TATS de máquinas virtuales saludable como se muestra en la Figura 4B se caracteriza por un número aproximadamente similares, con un axiald componentes transversales. Por el contrario, las figuras 4C y 4D muestran ejemplos de los miocitos cardíacos dañados que deben ser excluidos de los nuevos análisis. En particular, la célula AM en la Figura 4C se contrae como se evidencia por una longitud del sarcómero anormalmente corta de 1,2 micras y una red irregular, distorsionada TATS mientras que la célula VM en la Figura 4D muestra múltiples vesículas de membrana (algunos destacan por triángulos rojos), indicando las interrupciones de membrana , lo que puede ocurrir en la membrana de la superficie exterior, sino también en las membranas TATS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tinción de la membrana Figura 4.Live de la fibrilación ventricular intacto y myocitos. correspondiente se enciende y confocal de imágenes de la vida transmitidos di-8-ANEPPS manchada intacto (A) AM y células (B) VM. En contraste, un AM dañado parcialmente contraída y, potencialmente, con una longitud del sarcómero de 1,2 micras se muestra en (C). Miocitos contratados típicamente muestran una anormalmente acortan y estructuras TATS distorsionados, por lo tanto, excluidos de los nuevos análisis. Otro indicador importante para los defectos de la membrana celular son vesículas de membrana (triángulos rojos) como se muestra en una máquina virtual en (D). Vesículas de membrana representan estructuras de la membrana de la superficie dañada y células con ampollas deben ser excluidos de los nuevos análisis TATS. Además, la máquina virtual muestra el daño grave al parecer falta una pieza completa de su parte inferior izquierda (marcado con asterisco). En resumen, mediante la comparación de la luz transmitida y confocal de imágenes, las células de morfología y intacto superficie se documenta y se combinan con información de la señal fluorescente. Marcas 'N' nuCLEI omitido en el análisis de la mancha de la membrana TATS. Las barras amarillas indican magnifican ROIs de la misma imagen confocal presentado anteriormente. Las barras de escala:. 10 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las imágenes confocales de membranas TATS con una relación suficiente de señal a ruido como se muestra en las Figuras 4A y 4B se aceptan para su posterior análisis cuantitativo. El análisis de membrana TATS se basa en datos esqueletizadas derivados de los componentes de señal rectilíneas fluorescentes. Figura 5 muestra el diagrama de flujo de trabajo de los pasos de procesamiento de imágenes individuales que se describen en detalle los pasos 4.3 a 4.5. Estos pasos producen imágenes que representan esqueletizadas TATS rectilíneas redes de membrana como se muestra para cada aislado VM (Figura 5A) y células AM (Fifigura 5B).

Figura 5.Workflow para esqueletización de imágenes TATS fluorescentes. Etapas de procesamiento de imagen que conducen a una imagen esqueletizada de la red TATS están representados por ejemplos individuales de la imagen paso a paso tanto para un di-8-ANEPPS tiñeron VM (A) y AM (B). Para la etapa de procesamiento de imagen individual, por favor refiérase a la sección 4. Nota diferencias en barras de escala:. 20μm (A) y 10μm (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Un paso crítico en el procesamiento de imágenes, determinar el umbral adecuado para la binarización de datos tal como se describe en la sección 4.5.6. La imagen binaria resultante debe incluir sólo los verdaderos señales de la membrana de la red TATS pero no estructuras falsas obtenidas por umbral errónea de la señal de ruido de fondo. Sin embargo, es importante que el umbral es lo suficientemente baja para detectar todos los verdaderos estructuras TATS tales que los componentes TATS verdaderos no se pierden erróneamente durante el análisis de imagen. Figura 6 ilustra el proceso de cómo seleccionar el umbral durante binarización de datos. Mientras que un umbral de 40, como se muestra en las Figuras 6B y 6C parece apropiado para detectar todas las verdaderas estructuras TATS individualmente, por ejemplo, la elección de un umbral más alto, de 60, como se muestra en la Figura 6A no detecta estructuras de membrana más débil axiales (ATS) como se indica por triángulos amarillos . En contraste, la elección de un umbral inferior, por ejemplo, de 20, como se muestra en la Figura 6D conduce a la detección errónea de ruido de fondo estructuras TATS como falsos positivos como se indica portriángulos amarillos.

Figura 6.How para determinar el umbral de la señal durante skeletonizing de TATS datos de la imagen. Los ejemplos muestran esqueletos TATS cada generados para diferentes umbrales durante binarización de datos (que se describen en el paso 4.5). Las imágenes superiores muestran los ajustes de umbral usando Fiji. Las imágenes de menor: superposición de imágenes esqueletizadas la imagen de fluorescencia de entrada correspondiente con y regiones magnificados como se indica. Un umbral por ejemplo, alto, 60 aplicado en (A), aparentemente, no es adecuado para detectar todos los verdaderos estructuras TATS según lo indicado por los triángulos amarillos en la sección ampliada. Un umbral de 40 aplicado en (B) y (C) detecta todas las estructuras TATS correctamente y no detecta el ruido de fondo, mientras que por ejemplo un umbral bajo., 20 en (D) identifica erróneamente el ruido de fondo como estructuras TATS y por lo tanto produce falsos positivos señales de estructuras de membrana no existentes. Señales de falsos positivos se indican con triángulos amarillos en el recuadro ampliada. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El plug-in "Analizar Skeleton (2D / 3D)" apoya el análisis detallado de las estructuras TATS esqueletizados. Una vez ejecutado, el plugin se generará una tabla de datos con los siguientes parámetros: esqueleto #branches, #junctions, # voxels de punto final, longitud media rama, puntos #triple, puntos #quadruple, y la máxima longitud de la rama. Para una descripción detallada de todos los parámetros de salida posibles consulte tohttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton y artículos conexos ^29-31. Una salida típica tabla de datos se muestra en la Figura 7A.

Longitud esqueleto Total por retorno de la inversión:

Σ (x #branches rama longitud promedio) = 5155 px = 515,5 micras

La longitud total del esqueleto puede ser normalizada para el área de imagen. Para el ejemplo mostrado en la figura 7 la longitud normalizada del esqueleto 0.64μm / m ² y la suma de todas las uniones se calculan como se muestra a continuación:

Normalizada la longitud del esqueleto:

515,5 m / 803,6 m ² = 0.64 m / m ²

Número normalizado de uniones:

155 uniones / 803.6 m ² 2

Figura salida de datos 7.Automated de imágenes esqueletizados. (A) Una hoja de cálculo de datos típico generado por el 'Analizar Skeleton (2D / 3D)' plug-in de la imagen skeletonized muestra en (B). Para una descripción detallada de los posibles parámetros de salida consulte http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los pasos de procesamiento de imágenes descritos en 4.5 y se ilustran en la Figura 5 pueden ser automatizadas usando un macro Fiji proporcionado como Código complementario Archivo 4.3 y 4.4. La macro puede ser ventajoso para el análisis de grupos de conjuntos de datos completos, por ejemplo mediante la preparación de pilas de imagen de entrada individuales para cada grupo de tratamiento independiente para el análisis automatizado utilizando los comandos de macro.

La estrategia de software descrito permite además el análisis de orientación red TATS para todos los componentes. Para ello, utilice el plugin "direccionalidad" (http://fiji.sc/Directionality) ^29,31 que produce datos de histograma que muestra la distribución de la orientación de todos los TATS orientaciones componentes. Si el eje x de la imagen de entrada se corresponde con el eje principal de una célula AM o VM dado, el axial (longitudinal) componentes TATS estará representada por el bin 0 °, mientras que los componentes transversales estarán representados por el 90 y# 176; bin. Figura 8 muestra direccionalidad ejemplar histogramas de imágenes TATS esqueletizadas para una máquina virtual (8A) frente a un (8B) de células AM. Mientras que el histograma direccionalidad de una máquina virtual típica muestra una distribución doble pico a 0 ° y 90 °, el histograma AM muestra un único pico dominante a 0 °. Estos ejemplos están de acuerdo con las observaciones anteriores de que los componentes individuales de TATS máquinas virtuales se distribuyen casi a partes iguales entre los túbulos T y A-túbulos, mientras que los componentes TATS en los AM pueden estar compuestos predominantemente de A-túbulos.

Figura histograma direccionalidad 8.Representative de TATS redes de células individuales. Histogramas Direccionalidad se generaron a partir de imágenes esqueletizadas de VM individuales (A) versus AM (B Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El tampón de perfusión	mM
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0,6
Na 2 HPO 4	0,6
MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO3	4.6
Taurina	30
2,3-Butanedione-monoxima	10
Glucosa	5.5
pH 7,4
Tampón de digestión	mM (si no se especifica)
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0,6
Na 2 HPO 4	0,6
MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO3	4.6
Taurina	30
2,3-Butanedione-monoxima	10
Glucosa	5.5
La colagenasa de tipo II	600 U / ml
pH 7,4
Tampón de parada	mM (si no se especifica)
NaCl	120.4
KCl	14.7
KH 2 PO 4	0,6
Na 2 HPO 4	0,6
MgSO4	1.2
HEPES	10
NaHCO3	4.6
Taurina	30
2,3-Butanedione-monoxima	10
Glucosa	5.5
CaCl 2	0.0125
de suero bovino de ternero	10%
pH 7,4

Tabla 1.Buffer solutiones. El contenido de las tres soluciones tampón fisiológicas diferentes para el aislamiento de células y la imagen se resumen.

Discusión

Aunque los miocitos cardiacos se han aislado y estudiado durante décadas ^32, una revisión reciente concluyó que la alta calidad aislamientos de células miocitos consistentes siguen siendo difíciles ^27. Esto refleja protocolos relativamente complejos para el aislamiento de los miocitos cardíacos primarios vis-à-vis la falta de enfoques estándar comunes, metadatos compartidos, y la documentación transparente de la calidad de la célula. Protocolos de aislamiento de células se suelen personalizarse por grupos individuales, producir resultados variables de la célula aislados, dependerá de la configuración de modelo individuales (por ejemplo, especies, edad, coexisten enfermedades del corazón), y por lo general se ajustan a determinadas condiciones experimentales. En el contexto de la TATS cuantitativa estudios de membrana y protocolos presentados aquí, un nivel esencial de la evaluación y documentación de la calidad se refiere a la confocal o microscopía de super-resolución de las estructuras de membrana de células individuales propensas a metabólicas y protocolo de aislamiento de los cambios dependientes, tantoen AM o VM. Es importante destacar que, aunque los altos rendimientos de los aislados de células intactas sugieren miocitos sanos, los investigadores tienen que documentar y juzgar críticamente cada célula individual cuidadosamente frente a los criterios morfológicos de superficie y TATS integridad de la membrana frente a daños no específicos debido a los procedimientos de aislamiento frente a los cambios específicos debido a diferentes tipos de las intervenciones, en comparación con las condiciones de control. Una variable importante durante el aislamiento célula cardíaca es la actividad específica de un lote de colagenasa dado. Para seleccionar un nuevo lote de colagenasa, la actividad enzimática de varias muestras de colagenasa se debe probar uno contra el otro mediante la evaluación de rendimiento de miocito cardiaco y la calidad, y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lo ideal sería que un nuevo lote de colagenasa se identifica con la actividad colagenasa similar a anteriores lotes utilizados con éxito (por extensión de la evaluación de las posibles actividades enzimáticas se refieren a la "herramienta de selección mucho colagenasa" en la tabla de materiales y métodos). TAken juntos, los enfoques cuantitativos de la visualización de la membrana TATS dependen críticamente de la calidad del aislamiento de células y, viceversa, aislamientos de células cardíacas que conducen a daño de la membrana no específico tal como se documenta por TATS microscopía deben dar lugar a la revisión crítica y la corrección de los procedimientos de aislamiento. Dado que la calidad de aislamiento de células y la visualización de la membrana TATS y cuantificación están intrínsecamente ligados, los protocolos descritos en este artículo abarcan todos los aspectos importantes, como una estrategia continua.

Un reto adicional y tema común de los estudios cardíacos, daño celular y / o la pérdida de células se producen debido a las intervenciones que comprometen metabólicamente por ejemplo, a raíz de un infarto de miocardio ^9, sin embargo, tienen que ser juzgados contra posibles daños, por ejemplo inadvertida, tras la embolia gaseosa desapercibido durante el aislamiento celular. El aislamiento de los miocitos cardíacos de corazones enfermos puede conducir a la pérdida de células significativa adicional y la disminución de los rendimientos celulares. Por lo tanto, ComparIson del número total de células intactas aisladas entre el control y corazones enfermos puede ser significativo si el aislamiento de células y el recuento se aplican de manera coherente a través de protocolos estandarizados. En consecuencia, es crítico para juzgar la integridad celular a través de un grupo de control apropiado, que refleja la mejor calidad posible de los miocitos de aislamiento de células. Es importante destacar que, la calidad célula individual y microscopía de células vivas de sanos frente a enfermo frente miocitos inadvertidamente dañados por el procedimiento de aislamiento pueden influir significativamente en el análisis de redes TATS de membrana. Los protocolos que aquí se presentan, por tanto, hacen hincapié en la integridad y la estabilidad de los componentes de la membrana fisiológicos durante el aislamiento celular y microscopía de células vivas de las membranas intactas. Todo el flujo de trabajo está diseñado como una estrategia continua para lograr y mantener componentes de la membrana TATS intactas mientras que excluye las células dañadas, ya que estos exhibirán aislamiento artefactos dependientes de membrana como túbulos de membrana interrumpidos, Membrane ampollas y redes TATS alterados erróneamente bajo condiciones de control y comprometer aún más el análisis cuantitativo. A la inversa, las mismas estrategias son cruciales para los estudios de intervención con el potencial de romper las membranas TATS, que dependen críticamente de los controles comparativos significativos entre verdad sana frente a la verdadera célula enferma con TATS cambios de membrana.

Además, nos ocupamos de los procedimientos para lograr el aislamiento técnicamente mucho más difícil de las células de AM. A pesar de los avances y protocolos mejorados, es importante hacer hincapié en que no es trivial reproducir aislamientos de células de alta calidad de las máquinas virtuales y aún menos fiable para los AM. Esto es debido a que el rendimiento global menor de células AM donde incluso pequeños errores o variaciones durante el aislamiento de células puede conducir a un fallo completo de aislamiento de células AM, mientras que un grado leve de daño celular VM puede ser menos aparente en suspensión de células debido a la relativamente alta de células números en comparación con AM. Dado que las células AM podrían convertirse en curved después del aislamiento, el análisis a través de varias regiones de interés puede ser ventajoso como se indica en el paso 4.3. Siguiendo un procedimiento detallado de las medidas de aislamiento de células, proporcionamos un protocolo para la tinción directa integral de membrana y confocal o STED imágenes de super-resolución de las redes TATS tanto para las máquinas virtuales y los AM. Estos protocolos permiten tanto el análisis cuantitativo y la diferenciación de ciertos componentes de las membranas TATS través de parámetros previamente establecidos. En comparación con máquinas virtuales, la organización 3D y comportamientos funcionales de la red TATS auricular en AMs son actualmente menos comprendidos.

Los procedimientos a membranas imagen TATS en células vivas (pasos 3.1 a 3.7) se desarrollaron con confocal comercial (Tabla de Materiales / Equipos) y STED microscopios de fluorescencia medida ^9. Para optimizar los ajustes del microscopio para la generación de imágenes de fluorescencia y el análisis cuantitativo TATS, los siguientes puntos son de importancia general:

• Objetivo
  A fin de resolver pequeños detalles de TATS estructuras de membrana, probar empíricamente cuyo objetivo ofrece la máxima calidad de imagen mientras se centra varios micrómetros de profundidad en la célula. Ciertos microscopios confocales pueden funcionar mejor con los objetivos de agua o glicerol, en contraste con el objetivo de aceite NA 63X 1,4 utilizado aquí. Objetivos con un aumento de 100X se utilizan para la super-resolución STED microscopía, la negociación fuera un campo de visión más pequeño para la resolución nanométrica ^34.
• La excitación y la ganancia
  Los ajustes óptimos de la potencia de excitación y la ganancia del detector depende de la trayectoria de la luz del microscopio, el rendimiento del láser, y propiedades de la muestra. Idealmente, la potencia del láser y la ganancia se ajustan para explotar toda la gama del detector, sin embargo, evitar la saturación de la imagen. Paquetes de software microscopía comerciales por lo general proporcionan tablas de búsqueda que visualizan el límite inferior y superior del rango dinámico. Además, para minimizar blanqueadora de colorantes emplean el l más bajo posiblepoder aser que todavía proporciona suficientes detalles estructurales de membrana TATS. Además, potencia de excitación debe ser lo suficientemente baja para evitar daños en la foto acumulativa que lleva a contracturas de miocitos y la muerte.
• Tamaño de píxel
  Utilice un tamaño de píxel compatible con el muestreo de Nyquist, aproximadamente la mitad de la resolución alcanzada con la configuración dada. Para formación de imágenes confocal un tamaño de píxel de 100 nm x 100 nm es compatible, que también limitar blanqueo. Para la microscopía de super-resolución tamaños de pixel significativamente más pequeños se utilizan, por ejemplo, 20 nm x 20 nm para microscopía STED ^9.
• Tiempo de permanencia
  Microscopios confocales proporcionan una función de promediación. En general, utilice el menor tiempo posible de permanencia de píxeles para evitar el blanqueo en combinación con la señal de promedio, por ejemplo, la línea-un promedio de ≥ 8 para mejorar la relación señal-ruido-.
• Documentar la configuración de Microscopía aplicada a través de Metadatos
  Una vez que los ajustes de cómodetalles de imagen de las estructuras de membrana TATS fueron optimizadas en un microscopio confocal particular, seguro y / o documentar la configuración (protocolo de meta-datos). Adquirir todas las imágenes dentro de un grupo (o entre) (s) de las células con el mismo objetivo, potencia de excitación, aumento de tamaño de pixel, pixel tiempo de permanencia, y la función de un promedio. Igualdad de condiciones de formación de imágenes permiten la comparación directa y la cuantificación dentro de un grupo (o entre) (s) de las células.
• Para orientación general y más detalles acerca de los principios y aplicaciones de la microscopía confocal consulte el Manual of Biological Microscopía Confocal (Pawley JB, 3 ^ª Edición, 2006, Springer Science + Business Media, LLC).

En contraste con las estrategias de análisis directos presentados aquí, publicaciones anteriores que describen membranas TATS y los cambios relacionados con la enfermedad, han utilizado lecturas agregados regionales de densidad de T-túbulos como estrategia cuantitativa ^16,17, o estrategias regionales indirectos basado en Fourier transformación análisis de las señales de membrana estriadas a fin de evaluar la regularidad componente túbulo ^T-7. En contraste, los enfoques cuantitativos descritos aquí están directamente relacionados con los componentes individuales TATS y ofrecen una serie de parámetros adicionales, incluyendo las propiedades de red de membranas y componentes específicos, como el porcentaje de los A-túbulos. Además, la densidad de la red TATS se puede cuantificar como la longitud normalizada de todo el esqueleto extraído por área ROI. El número de uniones triples de tres individual, componentes tubulares conectados continuamente se puede utilizar como una medida de la complejidad de ramificación de la red de membrana TATS. Tomamos nota de que cualquier análisis de componentes TATS más pequeños depende de los procedimientos de tinción. En nuestra experiencia, 800 l de una solución de di-8-ANEPPS 50 M son suficientes para teñir las redes TATS completos en un sedimento celular que contiene 50.000 células VM ^9. Sin embargo, si el sedimento celular contiene un menor número de miocitos cardíacos, Si los detectores de fluorescencia potentes están disponibles, y si la imagen confocal de la distribución global de la red TATS más que detalles más pequeños de la membrana y los cambios cuantitativos son de interés, menores concentraciones de colorante puede ser utilizado en base a pruebas empíricas. Finalmente, una macro software escrito para el análisis descrito se puede utilizar para automatizar los pasos de procesamiento de imágenes para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos, que es particularmente útil para la comparación entre los diferentes grupos de tratamiento (por ejemplo, fármacos), tipos de células (por ejemplo, AM contra VM ), y las intervenciones fisiopatológicos (por ejemplo, el tratamiento simulado contra el infarto de miocardio).

Para el análisis de imagen de las redes TATS, la siguiente secuencia de pasos principio se aplica: 1) balanceo de la bola de fondo-resta (4.5.1) para eliminar las variaciones espaciales en la intensidad de fondo; 2) aumento del contraste local (4.5.2).; 3) de suavizado de imagen (4.5.3); 4) Región estadística fusión (4.5.4); 5) que define elumbral de binarización de la imagen (4.5.6); y 6) el cálculo de los datos de esqueleto (4.5.8). Un paso crítico durante la esqueletización de imágenes TATS fluorescentes es la binarización de la imagen mostrada en la Figura 6. Los pasos de umbrales asociados definen en última instancia el que se detectan verdaderas estructuras de membrana para representar los componentes subyacentes frente TATS estructuras potencialmente falsos identificados por error del ruido de fondo. Identificación de la correcta umbral para el análisis de imagen binaria debe corresponder con los verdaderos TATS estructuras de membrana, que depende de un (SNR) para cada uno de los enfoques de microscopía confocal y de superresolución suficientemente alta de señal a ruido. Por lo tanto, una calidad de imagen suficiente se debe establecer en primer lugar y, posteriormente, junto con el criterio fundamental de la calidad celular individual, incluida la documentación por imágenes de campo claro como se indica. Las opciones alternativas para adaptar el protocolo de segmentación de imágenes para una salida dada datos microscopio y / o educación físicapreguntas IOLÓGICA incluyen deconvolución imagen y otros procedimientos de fijación de umbrales como "Otsu" o "Iso-datos" disponibles como plugins ImageJ. Independientemente del procedimiento de segmentación definitiva, consideramos que la comparación entre los datos extraídos y primas por superposición de imágenes de una etapa de control de calidad obligatorio. En resumen, la integridad morfológica y la membrana de los miocitos aislados individuales, tinción suficiente de las membranas intracelulares TATS, la optimización de parámetros para imágenes de fluorescencia, y control de superposición de los datos extraídos esqueleto, contribuirán a la calidad de las imágenes TATS fluorescentes y resultados cuantitativos.

Si se utilizan especies más grandes que el ratón para el aislamiento de células, los protocolos pueden adaptarse fácilmente según sea apropiado. Durante los siguientes especies más grandes, corazones de rata pueden ser canulados con un objeto contundente 14 G cánula (diámetro exterior 2,1 mm) y se perfundieron a 8 ml / min. Significativamente mayores o enfermos corazones pueden requerir tamaños de cánulas más grandes. En genral, la perfusión cardíaca puede llevarse a cabo ya sea por la presión constante, por ejemplo, utilizando una columna de agua de alta 1 m entre el depósito y la aorta o por la constante de flujo usando una bomba peristáltica. Para el aislamiento de células a partir de pequeños corazones de roedores como ratones y ratas de flujo constante puede ser ventajoso ya que la digestión de colagenasa eventualmente interrumpir los vasos de resistencia coronaria que conducen a tasas de perfusión excesivas fugas de camas de los vasos que se van a controlar en cierta medida por los protocolos de flujo constantes. En contraste, la presión de perfusión constante es ventajoso si la supervisión de la velocidad de flujo y la canulación correcta son una prioridad, que es ventajosa para los modelos de intervención con sangre alteradas comportamientos de resistencia buque, así como para la formación de los procedimientos de aislamiento de células.

Como se indica anteriormente, la calidad suficiente de células es muy importante para los estudios cuantitativos de los sistemas de membrana endógenos. Sin embargo, durante la perfusión del corazón y la digestión de colagenasa numerosos factores pueden critically afectan a la calidad del aislamiento de células, que nunca debe ser subestimada durante la optimización de protocolo o la solución de problemas ^27. En particular, la actividad de un lote de colagenasa dado debe determinarse para el tejido específico de interés, por ejemplo, aurículas o los ventrículos antes de la ejecución de los estudios de buena fe experimentales para establecer condiciones de aislamiento que se mantiene durante todo el resto del estudio. Por otra parte, la calidad del agua, el pH, la temperatura, la optimización y limpieza de la configuración de perfusión minimizarán el riesgo de daño accidental de los contaminantes y las embolias, y posibles factores adicionales que seguir de establecer condiciones óptimas homeostáticos durante el aislamiento celular. BDM (2,3-butanodiona-monoxima) un inhibidor reversible de la miosina ATPasa puentes cruzados se usa comúnmente durante la disección del tejido y la digestión para sostener la relajación del músculo cardíaco, lo que aumenta el rendimiento de aislamientos de células. Sin embargo, los investigadores necesitan to ser consciente de que BDM puede ejercer actividades de las fosfatasas no específicas que conducen a efectos fuera de la meta, por ejemplo, la inhibición de la Na ⁺ / Ca ^{2 +} corrientes de cambio en determinadas condiciones ^33. Para algunos experimentos que podría ser ventajoso sustituir BDM por blebbistatin como solución cardiopléjica, un inhibidor con una alta afinidad por la miosina a concentraciones micromolares que es, sin embargo, tóxico y relativamente caro y puede tener otros efectos fuera de objetivo. Descansar cardiomiocitos sanos no deben mostrar ningún contracciones en ausencia de estimulación eléctrica y estas células deben ser excluidos de los nuevos análisis. Por otra parte, la contracción de los miocitos cardíacos y la relajación en respuesta a la estimulación eléctrica en fisiológicos extracelulares concentraciones de Ca ^{2 +} puede ser utilizado para establecer el comportamiento contráctil normal como una medida adicional para evaluar la calidad de células funcionales y / o comportamiento anormal en la enfermedad cardíaca versus control sano células.

En resumen, los protocolos para el aislamiento de células individuales y análisis de imagen cuantitativo descrito aquí se ha aplicado con éxito para la microscopía confocal y de super-resolución de la red de membrana TATS en VM ⁹ y AM ²¹ células, así como para el análisis cuantitativo de las redes de microtúbulos en miocitos cardíacos fijos (datos no presentados). Estas y futuras aplicaciones de los protocolos puede abrir vías para una variedad de preguntas experimentales tales como la caracterización de membranas TATS en diferentes etapas de desarrollo o el análisis de las proteínas o de orgánulos estructuras asociadas a la membrana que hacen contacto con la red TATS ejercer muy localizados, la señalización de dominio específico funciones en las células de AM y VM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Chemicals and Enzymes
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania	B0753
Suero para terneros bovinos	Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	SH30073	Triple 0.1 µ m Filtrado estéril.
CaCl2	Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania	21115	Diluido 1:10 en agua MQ para obtener 100 mM de concentración de CaCl2 stock.
Colagenasa tipo II	Worthington a través de Cell Systems, Troisdorf, Alemania	a petición	La actividad enzimática depende de los lotes individuales de colagenasa. La colagenasa II y otras actividades enzimáticas (caseinasa, clostripina, trípticas) se pueden evaluar en la "herramienta de selección de lotes de colagenasa". Determine el rendimiento y la calidad de las células individualmente para cada nuevo lote de colagenasa.
Glucosa	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	HN06.1
Heparina	Rotexmedica, Trittau, Alemania	PZN-03862340	Diluida en NaCl al 0,9% e inyectada por vía subcutánea en la piel abdominal.
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	9105.4
Foreno 100% (V/V)	Abbott, Libertyville, IL, EE. UU	B506	Agente activo: isoflurano, 250 ml. Utilice aproximadamente 2 Vol% en el instrumento dispensador de aire/oxígeno.
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6781.3
KH2PO4	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	3904.2
Laminina (2 mg/ml)	BD Biosciences, Heidelberg, Alemania	354232	La laminación se describe en el paso 2.1.
MgCl2· 6H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	2189.2
MgSO4· 7H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	8283.2
Na2HPO4· 2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	4984.2
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	HN01.1
Taurin	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS	Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Alemania	D-3167	Solución madre de 2 mM en DMSO
Trypan blue	Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania	T8154	Trypan blue se mezcla suavemente 1:1 mediante una pipeta de plástico de 1 ml con suspensión de células antes del recuento de células en el citómetro de Neubauer.
Langendorff Termostato de perfusión
Circulation	Lauda, Lauda-Kö nigshofen, Alemania		Véase Louch et al. (JMCC 2011). Caliente el termostato y los tampones en el tubo de perfusión a 37 & deg; C 15 min antes de usar.
Tubo de silicona flexible Tygon para bomba peristáltica	VWR, Darmstadt, Alemania	224-2252	El tubo debe cambiarse regularmente.
Tubo de silicona flexible Tygon para termostato	VWR, Darmstadt, Alemania	228-4340
Tubo de perfusión envolvente con serpentín calefactor	Rettberg, Gö ttingen, Alemania	a medida	La bobina y los tubos de calefacción deben limpiarse a fondo con agua MQ después de su uso. No utilice detergentes. Los componentes de vidrio deben bañarse regularmente  en 10 mM de NaOH durante la noche.
Bomba peristáltica	Ismatec, Wertheim, Alemania	ISM830
Llave de paso de tres vías Discofix C Luer Lock 10 cm	Braun, Melsungen, Suiza	16500C
Llave de paso de tres vías Discofix 3SC	Braun, Melsungen, Suiza	4095146
Instruments
42 mm cubreobjetos	de vidrioMenzel Glä ser a través de Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	a petición	0,13-0,16 mm de espesor
Cánula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, EE. UU	. 304432	Cortado a una longitud de ~5 mm, desbastado con papel de lija.
Cubreobjetos para citómetro Neubauer 24 x 24 mm	Menzel Glä ser a través de Thermo Scientific, Schwerte, Alemania	bajo pedido	Pinza de Graefe de 0,38-0,42 mm de grosor
, puntas de 0,5 mm, ligera curva	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	11151-10
LSM 710 NLO	Carl Zeiss, Jena, Alemania		Objetivo de aceite 63X 1.4 NA
Citómetro mejorado Neubauer	Labor Optik, Friedrichsdorf, Alemania	1100000	Procedimiento de recuento: Limpie el citómetro y el cubreobjetos provistos con la cámara de recuento con etanol al 70 %. Presione suavemente el cubreobjetos sobre la cámara de conteo para que las dos superficies de vidrio estén en contacto y se puedan observar los anillos de Newton. Posteriormente, 10-20 µ La suspensión de celdas L se puede aplicar al borde del cubreobjetos para ser aspirado al vacío por acción capilar. Cuente los miocitos intactos frente a los defectuosos utilizando los cuadrados de la cuadrícula del citómetro que refleja 100 nl. Repita el procedimiento de conteo en la segunda cuadrícula provista en el citómetro. Calcule la densidad de las células en su suspensión celular original teniendo en cuenta las diluciones y los atajos de conteo.
Cámara de imagen POC-R2	Pecon, Erbach, Alemania		Volumen de suspensión de la celda: 800 µ l; densidad de recubrimiento deseada: ~1,000 AM y ~10,000 VM
Tijeras de resorte, hojas de 8 mm rectas, romas	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	15025-10
Pinzas Dumont #7 para estudiantes, acero inoxidable	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	91197-00
Tijeras de iris para estudiantes, curvas, 11,5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	91461-11
Tijeras para iris para estudiantes, rectas, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	91460-11
Tijeras surcigales para estudiantes, rectas, afiladas, 12 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	91402-12
Pinzas de tejido, 1 x 2 dientes, delgadas, 10 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania	11023-10

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