En este estudio, una novedosa plataforma para investigar firmas moleculares intraneuronales de la respuesta al tratamiento en el trastorno bipolar (TB) fue desarrollado y validado. Epitelio olfativo de pacientes con TB se obtuvo a través de biopsias nasales. Entonces láser captura microdissection se combinó con Real Time RT PCR para investigar la firma molecular de la respuesta de litio en BD.
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Artículo de método
Las neuronas olfativas obtenidos por medio de biopsia nasal combinado con microdisección por láser captura: un enfoque potencial para el Estudio de la respuesta al tratamiento en los trastornos mentales
En este artículo
Resumen
Resumen
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave con fisiopatología mal entendida y típicamente tratado con el estabilizador del humor, carbonato de litio. Los estudios en animales así como estudios genéticos humanos indican que el litio afecta a dianas moleculares que están implicados en el crecimiento neuronal, la supervivencia y maduración, y en particular las moléculas que participan en la señalización de Wnt. Dado el desafío ético para la obtención de biopsias cerebrales para la investigación de cambios moleculares dinámicas asociadas con litio-respuesta en el sistema nervioso central (CNS), se puede considerar el uso de las neuronas olfativas obtenidas de tejidos para lograr este goal.The epitelio olfativo contiene neuronas receptoras olfativas en diferentes etapas de desarrollo y glial-como células de soporte. Esto proporciona una oportunidad única para estudiar los cambios dinámicos en el sistema nervioso central de los pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas, utilizando tejido olfativo obtenido con seguridad a partir de biopsias nasales. Para superar el inconveniente planteado por substcontaminación antial de tejido olfativo biopsia con las células no neuronales, un enfoque novedoso para obtener poblaciones celulares enriquecidas neuronal fue desarrollado mediante la combinación de biopsias nasales con láser de microdisección de captura. En este estudio, un sistema para la investigación de tratamiento asociada a los cambios moleculares dinámicas en el tejido neuronal fue desarrollado y validado, utilizando una pequeña muestra piloto de pacientes BD reclutados para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta al tratamiento de litio.
Introducción
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave, caracterizada por cambios patológicos en el estado de ánimo, la unidad 1 y la cognición. El litio se utiliza para el tratamiento de BD se ha demostrado que altera los niveles de estado estacionario de ARNm de un gran número de genes en estudios con animales 2, pero se desconoce si alguna de estas moléculas se asocia con la respuesta clínica en los seres humanos 2. Entender el mecanismo de respuesta de litio requeriría investigar cambios moleculares inducida por litio en los tejidos neuronales. Desafortunadamente, no es práctico para obtener biopsias cerebrales de los p....
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Protocolo
NOTA: Todos los voluntarios de la investigación en este estudio se administraron los documentos de consentimiento informado aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Howard y la Universidad Johns Hopkins. Sólo los participantes que dieron su consentimiento mediante la firma de los documentos de consentimiento informado se inscribieron en el estudio. La base de estudio para este análisis consistió en: 20 sujetos (12 BD y 10 controles, 30% varones) y edad (sd) de 38,2 (14,1) años significa.
NOTA: Rocíe todas las superficies con RNasa Zap para eliminar la contaminación RNasa de las superficies de vidrio y plástico.
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Resultados
La estrategia de protocolo y la solución de problemas en el estudio de las firmas moleculares se han optimizado con éxito. ARN de calidad y los criterios de enriquecimiento neuronales para las muestras que se utilizan en un análisis posterior aguas abajo Tiempo real-PCR fueron estandarizados. RIN y la concentración de ARN fueron examinados como factores de confusión a los niveles de expresión detectados. Basándose en el análisis de varias muestras con RINs que van desde 1 - 10, se determinó que un RIN mínimo de ~ 3,0 y .......
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Discusión
Una nueva plataforma para la obtención de capas neuronales olfatorios enriquecidos mediante la combinación de la biopsia nasal y LCM se presenta y se ha validado en este estudio. Esta técnica puede tener amplias implicaciones. Puede ser aplicado a los estudios de biomarcadores, incluyendo los de la respuesta al tratamiento, y los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para otras condiciones neuropsiquiátricas, haciendo un impacto más amplio en el campo.
Para obtener neuronas de alta calidad.......
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Divulgaciones
Los autores informan de las relaciones financieras con intereses comerciales.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones USPHS MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) y MH-096208 (K.I.), subvenciones de DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R FOUNDATIONS (A.S.), NARSAD (A.S. y K.I.), y el Fondo de Investigación de Células Madre de Maryland (A.S. y K.I.).
Apreciamos sinceramente los esfuerzos y contribuciones de Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema y Mark Christie hacia la coordinación del proceso de biopsia.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Preparación de tejidos | |||
| Tissue-Tek Moldes criomónicos | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Compuesto Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopía | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Calidad del agua tratada | biológica | 351-068-131 | |
| /fuerte> | |||
| Microscopio: Sistema MicroLáser de la serie PALM | Carl Zeiss Modelo de microscopía | : Axiovert 200M Software: Robo v3.2 | |
| No. 5 Pinza de Microdisscción Dumont | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extracción | |||
| RNAqueous Micro Kit Ambion | AM1931 | ||
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit Invitrogen | 18080-051 | ||
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Expression Assay Probes Applied | Biosystems | Varios | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix Applied | Biosystems | 4369016 | |
Referencias
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al.....
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Reimpresiones y permisos
