Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular In Vitro

Resumen

Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.

Resumen

El desarrollo de ensayos in vitro más predictivos y biológicamente relevantes se basa en el avance de los sistemas de cultivo de células versátiles que facilitan la evaluación funcional de las células sembradas. Para ello, la tecnología voladizo microescala ofrece una plataforma con la que para medir la funcionalidad contráctil de una gama de tipos celulares, incluyendo esquelético, cardiaco, y las células de músculo liso, a través de la evaluación de la contracción inducida por sustrato flexión. Aplicación de las matrices multiplexadas en voladizo proporciona los medios para desarrollar protocolos de moderado a alto rendimiento para la evaluación de la eficacia del fármaco y la toxicidad, fenotipo de la enfermedad y la progresión, así como neuromusculares y otras interacciones célula-célula. Este manuscrito proporciona los detalles para la fabricación de matrices voladizo fiables para este fin, y los métodos necesarios para con éxito células de cultivo en estas superficies. Una descripción más detallada se proporciona en los pasos necesarios para realizar anal funcionalanalysis de tipos de células contráctiles mantuvo en tales matrices usando una novela láser y sistema de foto-detector. Los datos representativos proporcionados destaca la precisión y la naturaleza reproducible de análisis de la función contráctil posible utilizar este sistema, así como la amplia gama de estudios a los que tal tecnología se puede aplicar. Amplia adopción exitosa de este sistema podría proporcionar a los investigadores con los medios para llevar a cabo estudios funcionales rápidas y de bajo costo in vitro, lo que lleva a predicciones más exactas de rendimiento de tejidos, desarrollo de la enfermedad y la respuesta al nuevo tratamiento terapéutico.

Introducción

El cultivo in vitro de células musculares de fuentes humanas y roedoras ha sido posible durante décadas^1,2. Sin embargo, si bien las preparaciones estándar de cubreobjetos son útiles para la evaluación bioquímica, no facilitan el análisis de la producción funcional primaria de la célula (contractilidad) y, por lo tanto, tienen un valor algo limitado como medio para evaluar la maduración y el rendimiento celular. Con el fin de maximizar la cantidad de datos que se pueden obtener de estos cultivos in vitro, es necesario avanzar en el desarrollo de sistemas capaces de albergar dichas células en configuraciones que permitan la evaluación en tiempo real de su rendimiento funcional. El establecimiento de una multitud de modelos musculares tridimensionales ha hecho algunos progresos hacia la satisfacción de esta necesidad, y dichos sistemas se han utilizado en una serie de publicaciones como un medio para evaluar la capacidad contráctil de las células musculares cultivadas in vitro^3-5. Si bien estos sistemas son invaluables para el modelado de tejidos y los estudios de reconstrucción, su aplicabilidad es limitada para los estudios de respuestas de células individuales. En los casos en que son necesarios estudios de una sola fibra, las metodologías ex vivo complejas y laboriosas siguen siendo la única opción^6-10. Además, el movimiento actual hacia el desarrollo de plataformas complejas y multiorgánicas para el desarrollo de fármacos y protocolos de cribado requiere el establecimiento de sistemas que sean no invasivos, fácilmente escalables y que se integren fácilmente con las células de soporte y los modelos de tejidos¹¹.

Los voladizos a microescala ofrecen un método sencillo para evaluar la capacidad contráctil funcional de células individuales/pequeñas poblaciones de células^12,13. La técnica se basa en la tecnología modificada de microscopía de fuerza atómica (AFM)¹⁴, y utiliza un láser y un sistema de fotodetector para medir la deflexión en voladizo a microescala en respuesta a la actividad contráctil del miotubo cultivado. A continuación, se utilizan las ecuaciones de Stoney modificadas para calcular la tensión en el miotubo y la fuerza ejercida por el miotubo para generar la deflexión del sustrato observada¹⁵. Se ha escrito un programa de escaneo que permite la evaluación simultánea de matrices en voladizo multiplexadas, ofreciendo posibles aplicaciones de rendimiento moderado a alto para estudios de toxicidad/eficacia de fármacos^15,16. Esta tecnología puede resultar muy valiosa en el desarrollo de ensayos preclínicos funcionales para predecir la eficacia de los fármacos in vivo. Además, la fabricación de chips en voladizo en silicio no impide el procesamiento posterior al análisis de las células para ensayos biomoleculares estándar, como la inmunotinción, la transferencia occidental y la PCR.

Este manuscrito proporciona instrucciones detalladas sobre la fabricación y preparación de voladizos de silicio a microescala, la configuración de hardware y software, y las directrices operativas para evaluar la funcionalidad de las células contráctiles cultivadas en estos chips. Se pueden implementar técnicas estándar de cultivo celular para la siembra y el mantenimiento de células en estas superficies, por lo tanto, cualquier tipo de célula contráctil para el que existan parámetros de cultivo confiables debería poder integrarse con este dispositivo con facilidad. Los parámetros de cultivo 2D relativamente simples utilizados en este sistema hacen que la integración de otros modelos celulares o la adición de tipos de células que puedan interactuar con el músculo (como las neuronas inervantes) sean sencillas, lo que aumenta en gran medida la aplicabilidad de este modelo en el desarrollo de ensayos funcionales in vitro más complejos y modelos multiorgánicos de sistemas de mamíferos.

Protocolo

1. Cantilever viruta Fabrication

Detalles ilustrados de los pasos de fabricación descritos se proporcionan en la Figura 1.

1. Coloque las obleas de silicio sobre aislante (SOI) en un horno y hornear a 125 ° C durante 20 minutos para deshidratar ellos.
2. Depositar una gruesa capa de óxido de silicio 1,5 m sobre la capa de mango de la oblea SOI deshidratado usando un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) de la herramienta.
3. Coloque las tabletas sobre el mandril recubridora de rotación con la capa de dispositivo hacia arriba. Asegúrese de oblea se centra, dispensan 2 ml de cebador P20 en el centro de la oblea, y centrifugado a 3.000 rpm durante 60 segundos a una aceleración de 1.000 rpm / seg. P20 imprimación promueve la adhesión de resina fotosensible a la capa de dispositivo.
4. Mientras que la oblea todavía está en el revestidor de giro del mandril, prescindir de 2 ml de S1818 fotorresistente en el centro de la oblea, y centrifugado a 3.000 rpm durante 60 segundos a una aceleración de 1000 rpm / sec a Obtain una gruesa capa de resina fotosensible 1,5 m.
5. Coloque las tabletas sobre un plato caliente y realizar una cocción suave a 115 ° C durante 1 min.
6. Realizar un disco exposición por contacto UV utilizando un alineador de máscara de fotolitografía de contacto con el fin de transferir el patrón de la máscara en voladizo a la resina fotosensible sobre la capa de dispositivo. Calcular el tiempo de exposición basado en el valor energético de la exposición de 125 mJ / cm ² para S1818 fotoprotector.
7. Desarrollar la fotoprotección mediante la inmersión de la oblea en un MIF promotoras de fotorresistencia 726 para 1 min mientras se agita suavemente la oblea de ida y vuelta.
8. Enjuague la oblea con (DI) de agua desionizada y se seca, preferiblemente usando una herramienta de secador de enjuague de centrifugado (SRD).
9. Retire la fotoprotección desde el borde de la oblea (hasta 5 mm del borde) con un bastoncillo de algodón humedecido en acetona.
10. Cargar la oblea en una herramienta de Deep Reactive Ion Etch (DRIE), con la cara de resina fotosensible, y ejecutar una receta para grabar la capa de silicio modelada a través de la Devicapa de ce. Las funciones de la capa de óxido enterrada como una parada de grabado, de modo realizar un grabado con 50% a 100% más ciclos que se espera que sea necesaria para garantizar un grabado completo.
11. Coloque las tabletas en un baño de solución fotoprotector caliente durante 20 minutos para quitar la fotoprotección. Transferir la oblea a un-dump-enjuagadora rápida (QDR) para enjuagar la oblea con agua DI. A raíz de la tira fotoprotector, cargue la oblea en una herramienta SRD para enjuagar y secar la oblea. Inspeccionar la oblea bajo un microscopio para asegurar el patrón voladizo aparece como se esperaba.
12. Depositar una gruesa capa de óxido de silicio dopado con un-1 m sobre la capa de dispositivo de la oblea usando una herramienta de PECVD. Esta capa de óxido funciones como una capa protectora para los voladizos durante etapas de procesamiento adicionales.
13. Coloque la oblea sobre el mandril recubridora de rotación con la capa de mango hacia arriba para comenzar el procesamiento de la parte trasera de la oblea. Asegúrese de oblea se centra, dispensan 2 ml de cebador P20 en el centro de la oblea, y centrifugado a 3000 rpmdurante 60 segundos con una aceleración de 1.000 rpm / seg.
14. Mientras que la oblea todavía está en el revestidor de giro del mandril, prescindir de 2 ml de resina fotosensible SPR220-4.5 sobre el centro de la oblea, y centrifugado a 2.000 rpm durante 45 segundos a una aceleración de 1.000 rpm / seg para obtener una capa gruesa de 6,5 micras fotoprotector.
15. Coloque la oblea en una placa caliente de proximidad para llevar a cabo una cocción suave a 115 ° C durante 2 min.
16. El uso de un alineador de contactos de fotolitografía capaz de delante / atrás alineación, alinear la máscara de la ventana trasera al patrón voladizo lado frontal y realizar un contacto dura la exposición UV con el fin de transferir el patrón de la máscara de la ventana trasera a la resina fotosensible sobre la capa de mango. Utilice un tiempo de exposición calculado con base en el valor de energía de exposición de 480 mJ / cm ² para fotoprotector SPR220-4.5.
17. Después de la exposición UV, permiten las obleas permanecen en una zona oscura durante 30 min antes de la siguiente etapa de procesamiento.
18. Desarrollar la fotoprotección sumergiendo la oblea enun desarrollador 726 MIF fotoprotector durante 2 minutos mientras se agita suavemente la oblea de ida y vuelta.
19. Enjuague la oblea con (DI) de agua desionizada y se seca, preferiblemente usando una herramienta de secador de enjuague de centrifugado (SRD).
20. Coloque las obleas en un horno a 90 ° C durante 12 horas.
21. Etch la capa de óxido de silicio en la parte trasera de la oblea utilizando un sistema RIE con gases fluorados y una receta para el grabado de óxido. El óxido de modelado en la parte trasera de la oblea actúa como una máscara de grabado para su posterior procesamiento. Inspeccionar las obleas bajo un microscopio para asegurarse de que el óxido de silicio en la ventana expuesta está completamente grabado.
22. Retire la resina fotosensible en el borde de la oblea (hasta 5 mm del borde) usando un hisopo de sala limpia sumergido en acetona.
23. Cargar la oblea en una herramienta con DRIE y ejecutar una receta para grabar la capa modelada mango a una profundidad de 500 micras con el funcionamiento capa de óxido enterrada como un tope de grabado. Dividir esta grabado en múltiples carreras para evitar un calentamiento excesivo de laoblea, lo que hace que el grabado inconsistente del silicio. Este paso elimina por completo el ataque químico de silicio por debajo de los voladizos.
24. Realizar una etapa de ataque químico en húmedo utilizando 25% grabador HF diluido, para despojar a la capa de óxido enterrada debajo de los voladizos y la capa protectora de óxido en la parte superior de los voladizos.
    NOTA: Este paso libera la superficie inferior de las palancas de silicio y también abre una ventana debajo para proporcionar un acceso a sondear el voladizo con el láser.
25. Enjuague la oblea usando una serie de baños de agua DI y secar cuidadosamente con nitrógeno. Desde los voladizos se apoyan sólo en sus bases, no utilice aerosoles contundentes de agua desionizada o gas inerte directamente en los voladizos.
26. Escindir los chips individuales de la oblea a lo largo de las líneas escinden producidos durante el paso de capa de grabado mango.

2. Cell Culture

1. Preparar 13F cubreobjetos de acuerdo con métodos publicados previamente ^17.
   NOTA: Si 13F calarslips no están disponibles, cualquier superficie hidrofóbica con un ángulo de contacto por encima de 95 ° se puede utilizar.
2. Esterilizar fichas en voladizo y 13F cubreobjetos en una solución de etanol al 70% y dejar secar al aire en una campana de flujo.
3. Coloque fichas individuales en voladizo en la parte superior de 13F cubreobjetos interior una placa de estándar de 12.
4. Escudo los voladizos con la modificación de biopolímeros o superficie optimizado para el tipo de células que se utilizan de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular.
5. Vuelva a suspender las células en su medio de crecimiento específico a la concentración deseada.
   NOTA: Este protocolo se traducirá en un número sustancial de células que caen a través de la ventana en voladizo y no se adhieren a la superficie en voladizo deseado. Por lo tanto, las preparaciones de células se deben hacer 3-4x más concentrada que para las preparaciones cubreobjetos estándar. Por ejemplo, la siembra de las células satélite de músculo esquelético de rata se lleva a cabo típicamente utilizando una densidad de siembra de 500 a 700 células / mm cuadrado ^15,16, Y se usan con sustratos en voladizo a 2.000 células / mm cuadrado. Experimentos de optimización deben llevarse a cabo con nuevas fuentes de células para determinar una densidad de siembra apropiada.
6. Pipetear 200 l de la suspensión celular sobre la superficie del chip en voladizo, asegurando la burbuja de medio cubre las ventanas en voladizo por completo. Si el medio absorbe a través de la ventana y no forma una burbuja estática en la parte superior de las ménsulas reemplazar el cubreobjetos 13F y reintentar el forro.
7. Transferir la placa que contiene las fichas a una incubadora y permitir que las células se adhieran durante al menos 1 hora (preferiblemente 2-3 h).
8. Después de este período de chapado, el uso de fórceps estériles para transferir el chip a un pocillo limpio, sin un cubreobjetos 13F, y la parte superior de la cultura con 1 ml de medio de crecimiento.
9. Volver a la placa de la incubadora.
10. Mantener las células de acuerdo con su protocolo estándar para el mantenimiento in vitro en cubreobjetos. Para las células del músculo esquelético,un interruptor de la composición del medio para inducir la formación de miotubos una vez que las células se vuelven confluentes será necesario.

3. Configuración de Hardware y Software para el Análisis Cantilever deflexión

1. Colocar una placa de cultivo calentado en la etapa de un microscopio de electrofisiología en posición vertical.
2. Añadir 3 ml del medio de alimentación de las células se suspenden en la actualidad (+ 10 mM HEPES) a la platina del microscopio climatizada.
3. Montar los electrodos de acero inoxidable en el interior de la placa de cultivo se calentó a una distancia de separación de 15 mm y conectarlos a un generador de impulsos, capaz de producir impulsos de estimulación campo de intensidad variable, frecuencia y forma de onda, para permitir que el sistema para producir la estimulación de campo de las células cuando sea apropiado.
4. Perno de un láser de helio-neón, montado en etapas de traslación XY, a la parte inferior de la mesa microscopio y ajustar de modo que el rayo láser se dirige a través de la base de la placa de cultivo se calentó a un ángulo de 30 ° relative al plano del voladizo.
5. Atornille un módulo fotodetector cuadrante, montado en etapas de traslación XY, en los bajos de la platina del microscopio y ajuste la posición para que las tierras rayo láser reflejado en el centro de los 4 cuadrantes. Figura 2 proporciona una visión general del hardware configurado necesarios para la aplicación del protocolo descrito.
6. Escriba un programa de software para controlar los actuadores lineales que exploran a través de los voladizos. Escribir el programa de software con referencia al diagrama de flujo proporcionado en la Figura 3. La interfaz gráfica programada para su uso con este sistema se proporciona en la Figura 4.

4. grabación Cantilever deflexión de datos

1. Encienda el hardware análisis voladizo y el software asociado.
2. Inserte el termistor escenario caliente en el medio y esperar a leer 37 ° C.
3. Inserte el chip en voladizo en el escenario con el cantilevers orientados hacia el lado derecho del escenario.
4. Encienda la fuente de luz del microscopio.
5. Enfocar el microscopio para que los bordes de las ménsulas a la vista y utilizar el software de control de láser / fotodetector para posicionar el haz de láser en la punta del cantilever 1. NOTA: Suponiendo que los voladizos están orientados a la derecha del escenario, en voladizo 1 es la una situada en la parte superior izquierda de la matriz y los números se extienden hasta 16 en la parte inferior izquierda. Cantilever 17 está en la posición de arriba a la derecha y corre a 32 en la parte inferior derecha (Figura 5A).
6. Pulse el botón "Play" en el software de grabación.
7. Coloque el fotodetector para que la señal se lee "0" en ambos x y marcos Y ajustando los motores paso a paso que controlan el fotodetector.
8. Establecer voladizo 1 posición en el software de control de láser / foto-detector (Figura 4).
9. Mueva el láser a la punta del cantilever 16, repita el paso 4.7., Y establecer cantilever 16 posición en el software de control de láser / foto-detector.
10. Mueva el láser a la punta del cantilever 32, repita el paso 4.7., Y establecer en voladizo 32 posición en el software de control de láser / foto-detector.
11. Mueva el láser a la punta del cantilever 17, repita el paso 4.7., Y establecer en voladizo 17 posición en el software de control de láser / foto-detector.
12. Apague la fuente de luz del microscopio y la luz del techo en el laboratorio.
13. Pulse el botón "Grabar" en el software de grabación.
14. Configure el hardware generador de impulsos a 40 ms, 5 V pulsos a una frecuencia de 1 Hz, y encender la máquina.
    NOTA: De forma opcional, emplean protocolos de estimulación optimizados para fuentes de células específicas en este punto, los ajustes indicados son directrices basadas en datos recopilados utilizando humanos y celulares de roedores fuentes ^12,13,15,16.
15. Usando el software de control de láser / foto-detector, establezca el hardware para explorar a través de la matriz 32 en voladizo, parando durante 5 segundos a cada uno ene.
16. Cuando el análisis de los 32 voladizos es completa, apague el estimulador, a continuación, detener el software de grabación y abrir el archivo de datos.
17. Examine la traza registrada de cada voladizo para la evidencia de la actividad contráctil. Tome nota de cada voladizo con respuestas positivas. Una contracción se define como un pico si la desviación es de al menos 0,1 V por encima de la línea de base.
18. Retire cualquier voladizos que no responden desde el protocolo de exploración en el software de control de láser / foto-detector.
19. Los voladizos activos pueden entonces ser analizados de nuevo sin estimulación con el fin de obtener una lectura de la actividad contráctil espontánea de la célula.
20. Ejecutar exploraciones con o sin un amplio campo de estimulación eléctrica, después de la adición de un compuesto terapéutico para el medio con el fin de observar su efecto sobre la salida funcional de las células cultivadas.
21. Llevar a cabo evaluaciones de la fatiga mediante la estimulación eléctrica de las células durante largos periodos y niveles de exploración de contr actility para medir cuánto tiempo le toma a la fuerza máxima a caer por debajo de un umbral determinado.
22. En experimentos en los que las neuronas motoras se mantienen en co-cultivo con músculo, medir la formación de la unión neuromuscular a través del tratamiento de las neuronas motoras en voladizo myotube-co-cultivos con un estimulante neuronal (tales como glutamato) o inhibidor sináptica (por ejemplo, D-tubocurarina) y escaneo para aumentos y disminuciones en la actividad espontánea, respectivamente ^16.
23. Realizar exploraciones específicas según lo dictado por las necesidades de los experimentos planeados.

5. Análisis de voladizo deflexión de datos

1. Uso modificar las ecuaciones de Stoney ¹⁵ (detallados a continuación) para convertir datos de deflexión de voladizo en bruto (en voltios) en una lectura de la tensión en la capa de células o myotube (en Pascales), y una medición directa de la fuerza contráctil celular (en nano-Newtons):
   ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> la ecuación 1
   Ecuación 2
2. Donde δ = desviación de la punta en voladizo y el estrés producidos por el myotube, σ _c = tensión producida por el myotube, suponiendo una película de espesor uniforme toda la anchura del voladizo, _detector C = el coeficiente específico del sistema de tensión relativa a la posición del láser en la foto -detector, θ = el ángulo del láser y el detector con respecto al plano del voladizo, _Si = E el módulo elástico de silicio, _Si = t Los espesores de las voladizo, t = espesor myotube _f, v = relación _{de Si} de veneno de silicio, L = longitud en voladizo, longitud P = ruta de láser desde la punta en voladizo para detector, y w _{la Figura 6.}
3. Suponiendo que el myotube es una película uniforme, la fuerza en la myotube es igual a la fuerza en la película, lo que lleva a la Ecuación 3, igualando el cálculo de la fuerza de la tensión y el área de sección transversal de células asumido que se utilizó para la aplicación de Stoney de ecuación.
   Ecuación 3
4. Tras la recogida de datos funcional, fijar los chips en voladizo para el análisis inmunocitoquímico o utilizar las células para análisis de proteína o ADN usando técnicas estándar.
5. Opcionalmente, devolver las células a la incubadora en lugar de prepararse para el análisis molecular con el fin de volver a evaluar el rendimiento funcional en un punto de tiempo después.

Resultados

Cultivo con éxito de células contráctiles en voladizos es un procedimiento relativamente sencillo, utilizando técnicas estándar de cultivo de células (Figura 5). El porcentaje de los voladizos soportan células contratantes variará dependiendo del tipo de célula que se examina y técnica de cultivo específica empleada. El uso de células embrionarias de rata primarios derivados de las extremidades posteriores, la actividad contráctil se detectó el 12% de los voladizos examinadas (n = 4). Análisis de la fun...

Discusión

Los pasos críticos en el análisis de voladizos microescala para la evidencia de la contracción celular son la colocación del chip en voladizo dentro de la platina del microscopio, y la posterior alineación del láser y foto-detector con la punta de los voladizos de las esquinas de la matriz. Si esto no se realiza con precisión, entonces el software no será capaz de extrapolar las posiciones de los voladizos restantes en la matriz, que puede conducir a la acumulación de falsos negativos durante la recogida de datos. Los o...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio primario de crecimiento
rata Medio neurobasal	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
suplemento G5	Life Technologies	17503-012	1x
Derivado de Glial Factor neurotrófico	Ciencias celulares	CRG400B	20 ng/ml
Factor neurotrófico derivado del cerebro	Ciencias celulares	CRB600B	20 ng/ml
Factor neurotrófico ciliar	celulares	CRC400A	40 ng/ml
Neurotrofina-3	Ciencias celulares	CRN500B	20 ng/ml
Neurotrofina-4	Ciencias celulares	CRN501B	20 ng/ml
Factor de crecimiento de fibroblastos ácidos Life Technologies		13241-013	25 ng/ml
Cardiotrofina-1	Ciencias celulares	CRC700B	20 ng/ml
Sulfato de heparina	Sigma	D9809	100 ng/ml
Factor Inhibidor de la Leucemia	Sigma	L5158	20 ng/ml
Vitronectina	Sigma	V0132	100 ng/ml
Medio de diferenciación muscular primario de rata
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
Equipo
Láser de diodo rojo de clase 2	Fotodetector Newport
	Industries
Modelo 2100 Pulse estimulador	A-M systems
Multiclamp 700B Digitizador	Axon Instruments
Pinza de parche Microscopio y platina	Olympus
Delta T4 controlador de placa	de cultivo Bioptechs Software de
axoscopio	Molecular Devices
Software LabVIEW	National Instruments
37 oC, 5% CO2 incubadora	NAPCO
Clase 2 campana de flujo microbiológico	Labconco
Pipetas y puntas	Eppendorf