Summary
Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro.
Abstract
Le développement de tests in vitro prédictifs et biologiquement pertinents repose sur la promotion des systèmes de culture cellulaire polyvalents qui facilitent l'évaluation fonctionnelle des cellules ensemencées. A cet effet, la technologie de micro-cantilever offre une plate-forme permettant de mesurer les fonctions de contraction d'une gamme de types de cellules, y compris squelettique, cardiaque, et les cellules musculaires lisses, grâce à l'évaluation de la contraction induite par le substrat de pliage. Application des réseaux multiplexés en porte à faux fournit les moyens pour développer des protocoles modérée à forte capacité d'évaluation de l'efficacité des médicaments et de la toxicité, le phénotype de la maladie et de progression, ainsi que les interactions neuromusculaires et autre cellule-cellule. Ce manuscrit fournit les détails de fabrication de tableaux en porte à faux fiables à cet effet, et les méthodes requises pour mener des cellules de culture sur ces surfaces. Une description plus détaillée est fournie sur les mesures nécessaires pour effectuer anal fonctionnelleyse de types de cellules contractiles maintenu sur de tels réseaux à l'aide d'un laser selon l'invention et d'un système photo-détecteur. Les données représentatives présente les points saillants de la précision et de la nature reproductible de l'analyse de la fonction contractile possible d'utiliser ce système, ainsi que le large éventail d'études à laquelle cette technologie peut être appliquée. L'adoption généralisée de succès de ce système pourrait fournir aux enquêteurs les moyens d'effectuer des études fonctionnelles, à faible coût rapides in vitro, conduisant à des prévisions plus précises de la performance des tissus, le développement de la maladie et la réponse au traitement thérapeutique.
Protocol
1.-faux fabrication de puces
Détails illustrés des étapes de fabrication décrites sont fournies sur la figure 1.
- Placez plaques de silicium sur isolant (SOI) dans un four et cuire au four à 125 ° C pendant 20 min pour les déshydrater.
- Déposer une couche épaisse d'oxyde de silicium de 1,5 pm sur la couche de poignée de la plaquette SOI déshydraté au moyen d'un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) outil.
- Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de dispositif vers le haut. Assurez-plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. P20 amorce favorise l'adhérence du vernis photosensible à la couche de dispositif.
- Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, distribuer 2 ml de S1818 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde à obtain une épaisse couche de résine photosensible de 1,5 um.
- Placer la plaque sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 1 min.
- Effectuer une exposition Contact avec les UV dur à l'aide d'un masque d'alignement de contact de photolithographie afin de transférer le motif du masque en porte à faux de la résine photosensible sur la couche de l'appareil. Calculer le temps d'exposition en fonction de l'exposition valeur énergétique de 125 mJ / cm 2 pour S1818 résine photosensible.
- Développer la résine photosensible par immersion de la plaquette dans un MIF développeur 726 de résine photosensible pour 1 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière.
- Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD).
- Retirer la résine photosensible à partir du bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de coton trempé dans de l'acétone.
- Chargez la plaquette dans un outil Deep Reactive Ion Etch (DRIE), avec le côté de résine photosensible vers le haut, et exécuter une recette pour graver la couche de silicium motifs par la devicouche CE. Les fonctions de la couche d'oxyde enterrée comme un arrêt de gravure, de manière à effectuer une attaque chimique de 50% à 100% de cycles que l'on attend d'être nécessaire pour assurer une gravure complète.
- Placer la plaque dans une solution de bain de résine photosensible à chaud pendant 20 minutes pour enlever la résine photosensible. Transférer la tranche à une rapide décharge-Rince (QDR) pour rincer la tranche avec de l'eau DI. Après la bande de résine photosensible, charger la plaquette dans un outil de SRD à rincer et sécher la plaquette. Vérifier la plaquette sous un microscope à assurer la configuration en porte à faux apparaît comme prévu.
- Déposer une couche de 1 um d'épaisseur d'oxyde de silicium non dopé sur la couche de dispositif de la plaquette à l'aide d'un outil de PECVD. Cette fonction de couche d'oxyde en tant que couche de protection pour les leviers au cours des étapes de traitement.
- Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de poignée orientée vers le haut pour commencer le traitement de la face arrière de la plaquette. Assurer plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minutependant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec.
- Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, 2 ml de distribuer SPR220-4.5 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 2000 tours par minute pendant 45 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde pour obtenir une épaisseur de couche de 6,5 pm résine photosensible.
- Placer la plaque sur une plaque chaude de proximité pour effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 2 min.
- Utilisation d'une photolithographie de contact d'alignement capable de recto / verso alignement, aligner le masque de la fenêtre du côté arrière de la configuration en porte à faux du côté avant et effectuer une exposition aux UV de contact dure, afin de transférer le motif sur le masque de la fenêtre du côté arrière de la résine photosensible sur la couche de poignée. Utilisez un temps d'exposition calculée sur la base de l'exposition valeur énergétique de 480 mJ / cm 2 pour SPR220-4.5 résine photosensible.
- Après l'exposition aux UV, que les plaquettes restent dans une zone sombre pendant 30 min avant l'étape de traitement suivante.
- Développer la résine photosensible par trempage de la plaque enun développeur 726 MIF de résine photosensible pendant 2 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière.
- Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD).
- Placer les tranches dans un four à 90 ° C pendant 12 heures.
- Graver la couche d'oxyde de silicium sur la face arrière de la tranche en utilisant un système de RIE avec des gaz fluorés et une recette pour la gravure de l'oxyde. L'oxyde à motifs sur la face arrière de la plaquette joue le rôle d'un masque de gravure pour la suite du traitement. Inspecter les plaquettes au microscope pour s'assurer que l'oxyde de silicium exposé dans la fenêtre est complètement décapée.
- Retirer la résine photosensible sur le bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de salle blanche trempée dans de l'acétone.
- Charger la plaquette dans un outil de DRIE et de fonctionner avec une recette pour graver la couche de poignée motif jusqu'à une profondeur de 500 um avec le fonctionnement de la couche d'oxyde enterrée dans un arrêt de gravure. Diviser cette gravure en plusieurs pistes pour éviter un échauffement excessif de lagaufrette, ce qui provoque la gravure du silicium incompatible. Cette étape de gravure élimine complètement le silicium sous les encorbellements.
- Réaliser une étape de gravure humide en utilisant 25% de HF dilué agent de gravure, à enlever la couche d'oxyde enterrée en dessous des consoles et la couche protectrice d'oxyde au-dessus des consoles.
REMARQUE: Cette étape libère la surface inférieure des consoles de silicium et ouvre une nouvelle fenêtre pour fournir un accès à la sonde en porte à faux avec le laser aussi. - Rincer la plaque à l'aide d'une série de DI bains d'eau et sécher soigneusement avec de l'azote. Depuis les consoles sont pris en charge uniquement par leurs bases, ne pas utiliser de sprays d'eau puissant DI ou un gaz inerte directement sur les consoles.
- Cliver les puces individuelles à partir de la tranche le long des lignes de clivent les produits au cours de l'étape de gravure de la couche poignée.
2. culture cellulaire
- Préparer 13F lamelles selon des méthodes 17 précédemment publiés.
REMARQUE: Si 13F anserslips ne sont pas disponibles, toute surface hydrophobe avec un angle de contact au-dessus de 95 ° peut être utilisé. - Stériliser puces en porte-lamelles et 13F dans une solution d'éthanol à 70% et laisser sécher à l'air dans une hotte à flux.
- Placez puces individuelles en porte à faux au-dessus de 13F lamelles dans une plaque 12 puits standard.
- Enduire les cantilevers avec la modification d'un biopolymère ou d'une surface optimisé pour le type de cellules utilisées selon les protocoles de culture cellulaire standard.
- Re-suspendre les cellules dans leur milieu de croissance spécifique à la concentration désirée.
NOTE: Ce protocole se traduira par un nombre important de cellules tombant à travers la fenêtre en porte à faux et qui n'adhère pas à la surface du cantilever souhaitée. préparations de cellules doivent donc être faits 3-4x plus concentré que pour les préparations de lamelle standard. Par exemple, l'ensemencement de cellules satellites de muscle squelettique de rat est généralement réalisée en utilisant une densité d'ensemencement de 500 à 700 cellules / mm carré 15,16, Et sont utilisés avec des substrats en porte à faux à 2000 cellules / mm carré. des expériences d'optimisation doivent être effectuées avec de nouvelles sources de cellules pour déterminer une densité d'ensemencement appropriée. - Pipeter 200 ul de la suspension cellulaire sur la surface de la puce en porte à faux assurant la bulle de support recouvre les fenêtres entièrement en porte à faux. Si le milieu évacue à travers la fenêtre et ne forme pas de bulles statique au-dessus des consoles remplacer la lamelle couvre-13F et retenter le placage.
- Transférer la plaque contenant les jetons à un incubateur et permettent aux cellules d'adhérer pendant au moins 1 heure (de préférence 2-3 h).
- Après cette période de placage, utiliser des pinces stériles pour transférer la puce à un bien propre, sans une lamelle 13F, et haut la culture avec 1 ml de milieu de croissance.
- Retour de la plaque dans l'incubateur.
- Maintenir les cellules en fonction de leur protocole standard pour l'entretien in vitro sur des lamelles. Pour les cellules des muscles squelettiques,un commutateur de composition de milieu pour induire la formation de myotubes une fois que les cellules deviennent confluentes sera nécessaire.
3 Configuration du matériel et des logiciels d'analyse Cantilever Déviation
- Placez une boîte de culture chauffée dans le stade d'un microscope droit électrophysiologie.
- Ajouter 3 ml du milieu d'alimentation, les cellules sont mises en suspension dans le moment (+ 10 mM de HEPES) de la platine du microscope chauffée.
- Montage d'électrodes en acier inoxydable à l'intérieur de la boîte de culture chauffé à une distance de séparation de 15 mm et de les relier à un générateur d'impulsions, capable de produire des impulsions de stimulation du champ de variation de l'intensité, la fréquence et la forme d'onde, pour permettre au système de produire une stimulation de champ de cellules, le cas échéant.
- Visser un laser Hélium-Néon, monté sur des étages de translation XY, à la face inférieure de la table de microscope et de l'ajuster de telle sorte que le faisceau laser est dirigé à travers le fond de la boîte de culture chauffé à une relativ 30 ° d'anglee par rapport au plan de la console.
- Visser un module photo-détecteur à quadrants, monté sur les scènes de translation XY, à la face inférieure de la platine du microscope et régler la position de sorte que les terres de faisceau laser réfléchi dans le centre des 4 quadrants. Figure 2 donne un aperçu du matériel mis en place nécessaire pour mettre en œuvre le protocole décrit.
- Écrire un programme de logiciel pour contrôler les actionneurs linéaires qui scannent à travers les consoles. Écrire le programme de logiciel, en référence à l'organigramme présenté à la figure 3. L'interface graphique programmé pour être utilisé avec ce système est présenté à la figure 4.
4. enregistrement Cantilever Déviation données
- Allumer le matériel d'analyse en porte à faux et le logiciel associé.
- Insérez la thermistance de la scène chauffée dans le milieu et attendre pour lire 37 ° C.
- Insérez la puce en porte à faux dans la scène avec le cantilevers orientés vers le côté droit de la scène.
- Allumer la source de lumière du microscope.
- La mise au microscope pour amener les bords des consoles en vue et utiliser le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur pour positionner le faisceau laser sur la pointe du cantilever 1 REMARQUE: En supposant que les consoles sont orientés vers la droite de la scène, cantilever 1 est l'un positionné dans le coin supérieur gauche de la matrice et le nombre descendent jusqu'à 16 en bas à gauche. Cantilever 17 est dans la position en haut à droite et tourne à 32 en bas à droite (figure 5A).
- Appuyez sur "play" sur le logiciel d'enregistrement.
- Positionner le photo-détecteur de sorte que le signal indique "0" dans les deux x et y trames en ajustant les moteurs pas à pas commandant le photo-détecteur.
- Réglez cantilever 1 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur (Figure 4).
- Déplacez le laser à la pointe du cantilever 16, répéter l'étape 4.7., Et mettre cantilever 16 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
- Déplacez le laser à la pointe du cantilever 32, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 32 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
- Déplacez le laser à la pointe du cantilever 17, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 17 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
- Coupez la source de lumière du microscope et le plafonnier dans le laboratoire.
- Appuyez sur "enregistrer" sur le logiciel d'enregistrement.
- Réglez le matériel générateur d'impulsions à 40 ms, 5 V impulsions à une fréquence de 1 Hz, et allumer la machine.
NOTE: En option, emploient des protocoles de stimulation optimisés pour les sources de cellules spécifiques à ce stade, les paramètres indiqués sont des lignes directrices fondées sur des données recueillies à l'aide de sources 12,13,15,16 cellulaires humaines et de rongeurs. - En utilisant le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur, régler le matériel pour numériser à travers le réseau 32 en porte à faux, l'arrêt pendant 5 secondes à chaque sure.
- Lorsque l'analyse des 32 consoles est terminée, éteignez le stimulateur, puis arrêtez le logiciel d'enregistrement et d'élever le fichier de données.
- Examinez la trace enregistrée de chaque console de preuves de l'activité contractile. Prenez note de chaque porte à faux avec les réponses positives. Une contraction est définie comme étant un pic si la déviation est au moins de 0,1 V au-dessus de la ligne de base.
- Retirez toutes les consoles non-sensibles du protocole de numérisation sur le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur.
- Les cantilevers actifs peuvent ensuite être réanalysés sans stimulation afin d'obtenir une lecture de l'activité contractile spontanée de la cellule.
- Exécuter des analyses large avec ou sans stimulation électrique de champ, après l'addition d'un composé thérapeutique dans le milieu pour observer son effet sur la sortie fonctionnelle des cellules en culture.
- Réaliser des évaluations de la fatigue en stimulant électriquement les cellules pendant de longues périodes et les niveaux de contr de numérisation Actility de mesurer combien de temps il faut pour force maximale de descendre en dessous d'un certain seuil.
- Dans les expériences où les motoneurones sont maintenues en co-culture avec les muscles, mesurer la formation de la jonction neuromusculaire par le traitement des motoneurones-myotubes cantilever co-cultures avec un stimulant neuronal (tel que le glutamate) ou inhibiteur de la synaptique (par exemple, d-tubocurarine) et de balayage pour augmentations et les diminutions de l'activité spontanée respectivement 16.
- Effectuer des analyses spécifiques comme dicté par les besoins des expériences prévues.
5 Analyse des données Cantilever Déviation
- Utilisez modifié les équations de Stoney 15 (détaillées ci-dessous) pour convertir les données en porte à faux brut de déviation (en Volts) en une lecture de stress dans la couche de cellules ou myotubes (en Pascals), et une mesure directe de la force contractile cellulaire (en nano-Newton):
annonce / 51866 / 51866eq1.jpg "/> l'équation 1
Equation 2 - Où δ = cantilever béquillage et le stress produites par les myotubes, σ c = contrainte produite par les myotubes, en supposant un film d'épaisseur uniforme sur toute la largeur de la poutre, C détecteur = le coefficient spécifique au système concernant la tension de mesure à laser sur la photo -detector, θ = l'angle du laser et du détecteur par rapport au plan de la poutre, E Si = le module d'élasticité de silicium, t Si = l'épaisseur du cantilever, t f = épaisseur de myotubes, v Si = coefficient de poison de silicium, L = longueur en porte à faux, P = longueur du chemin laser à partir de la pointe de cantilever à détecteur, et w
- En supposant que la myotubes est un film uniforme, la force dans la myotubes est égale à la force dans le film, ce qui conduit à l'équation 3, en assimilant le calcul de la force contre le stress et la zone de section transversale de la cellule présumée qui a été utilisé pour l'application de Stoney de équation.
Équation 3 - Après la collecte de données fonctionnelles, fixer des puces en porte à faux pour l'analyse immunocytochimique ou utiliser des cellules pour l'analyse des protéines ou de l'ADN en utilisant des techniques standard.
- En option, retourner les cellules à l'incubateur au lieu de préparer pour l'analyse moléculaire afin de réévaluer la performance fonctionnelle à un point de temps plus tard.
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Representative Results
Culture réussie des cellules contractiles sur des consoles est une procédure relativement simple, en utilisant des techniques classiques de culture cellulaire (figure 5). Le pourcentage de consoles supportant les cellules contractants varie en fonction du type de cellule en cours d'examen et la technique de culture spécifique utilisé. En utilisant des cellules embryonnaires primaires dérivées de membres postérieurs chez le rat, l'activité contractile a été détecté sur 12% des cantilevers étudiés (n = 4). Analyse de la fonction contractile en utilisant le système laser et photo-détecteur décrit fournit des données exactes en temps réel relatives à la maturité fonctionnelle des cellules ensemencées. Utilisation d'un logiciel d'électrophysiologie standard peut ensuite être utilisée pour analyser les données brutes, ce qui facilite le calcul des propriétés fonctionnelles pertinentes, telles que la force de pic, le temps au pic vigueur, et le temps de demi-relaxation, comme illustré sur la Figure 7. Collecte de données ultérieure de cultures traitées avec des composés thérapeutiques permetcomparaison des propriétés fonctionnelles, avec ou sans addition de médicament, ce qui permet l'évaluation de l'activité du composé et de la prévision des réactions ultérieures in vivo. En outre, les protocoles de stimulation étendus fournissent les moyens pour évaluer les taux de fatigue dans les cellules cultivées, élargissant ainsi le niveau de données physiologiques obtenues à partir de ce système (figure 8).
La culture en porte à faux peut être modifié pour inclure des neurones moteurs dans le système de culture avec les myotubes du muscle squelettique 16, de manière à permettre l'évaluation de la formation des synapses neuromusculaires in vitro (Figure 9). Dans ces cultures, les taux de l'activité contractile spontanée sont comparés aux taux d' contraction de la réponse au traitement avec un stimulant spécifique des neurones, tels que le glutamate. Toute augmentation de glutamate induite observées dans les taux de contraction suggèrent l'activation des neurones en culture, ce qui conduit à la libération d'acétylcholine et myo ultérieureactivation du tube. Le traitement avec les inhibiteurs synaptiques, tels que l'antagoniste des récepteurs de l'acétylcholine d-tubocurarine, ce qui conduit à l'arrêt de l'activité induite par le glutamate fournissent des preuves supplémentaires de la présence de synapses neuromusculaires fonctionnelles dans ces cultures 16.
Figure 1: Schéma de flux de processus de fabrication en porte à faux détaillant. Les numéros figurant dans le schéma de corrélation avec les mesures de protocole dans la section des méthodes intitulé "puce Cantilever fabrication." S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Matérieldétails du système laser / photo-détecteur utilisé pour évaluer la contraction cellulaire sur consoles. (A) Photographie du microscope électrophysiologique modifié utilisé pour l'évaluation de la console. Le laser (i) et photo-détecteur (ii) sont montés au-dessous de l'étage de translation XY étapes. Une boîte de culture transparent est monté sur l'étape (iii), qui permet le passage du laser de la matrice en porte à faux à travers la face inférieure de l'étage (B). Schéma «descendante» perspective de la platine du microscope. XY étapes de translation permettent le mouvement du laser et photo-détecteur à la fois X et Y avions (flèches rouges), faciliter le mouvement du laser à interroger chaque cantilever dans un tableau. Cantilever puces (iii) doivent être placés dans la scène avec les consoles tournées vers la droite de la scène pour que le système fonctionne correctement. (C) Close up photo du laser (i) etphoto-détecteur (ii) monté en dessous de la platine du microscope. Le laser est positionné à un angle de 30 ° par rapport au plan de la puce en porte à faux (θ). (D) fermer le haut de photographie de la boîte de culture. À large champ de stimulation électrique est appliquée au moyen d'une paire d'électrodes d'argent placé à 15 mm de distance (iv). Elément de chauffage (c) fixé à la face inférieure de la capsule est utilisée pour maintenir la culture à 37 ° C au cours de l'analyse. Contrôle de la température est dynamique, et réglée au moyen d'une thermistance placée dans le milieu (non représenté). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Organigramme de la logique qui sous-tend le logiciel de contrôle. balayage du logiciel laser et photo-détecteur Deux boucles de commande de mouvement: une boucle principale entrée de l'utilisateur et une boucle qui contrôle le mouvement de balayage. L'installation est effectuée alors que dans la boucle principale, suivie de l'activation de la deuxième boucle pour les moyennes et la collecte de données à haut débit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 Interface utilisateur graphique d'un logiciel utilisé pour commander des postes de laser et photo-détecteur lors de l'évaluation en porte à faux. (A) Les boutons pour contrôler manuellement la position de laser et photo-détecteurs à la fois X et plans Y. (B) Les commandes de réglage manuel de la position des leviers 4 d'angle (1, 16, 17, et 32), ce qui permet au logiciel deextrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau. (c) les contrôles permettant aux utilisateurs de sélectionner les cantilevers à inclure dans chaque balayage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Images d'une puce de cantilever construit sur mesure pour une utilisation dans ce système, et des images représentatives de cellules maintenues sur des surfaces similaires. (A) Photographie d'une seule puce en porte à faux, construit sur mesure. Chaque puce contient 32 consoles disposées en 2 rangées de 16 Cantilever 1 est positionné en bas à gauche de l'image et en porte à faux 32 en haut à droite. puces à-faux sont 15 x (B) l'image de contraste de phase de cellules de muscle squelettique de rat primaire 15 mm 2. cultivées sur cantilevers. Chaque console est de 750 m de long, 100 m de large et 4 um d'épaisseur. (C) tache immunocytochimique de myotubes de rat primaire maintenu sur une console. Les cellules ont été colorées en utilisant une sonde d'anticorps de chaîne lourde de myosine. Noter l'aspect strié de la fibre en culture, ce qui indique la maturation de la machinerie contractile. bords cantilever ont été mis en évidence artificiellement cette image pour fournir une indication de l'échelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 Schéma illustrant les termes utilisés dans les équations de Stoney pour la force produite par les myotubes sur consoles dériver. Δ = cantilever béquillage et le stress engendrés par la myotubes, CDétecteur = le coefficient spécifique au système concernant la tension de la position du laser sur le photo-détecteur, θ = l'angle du laser et du détecteur par rapport au plan de la poutre, E Si = le module d'élasticité de silicium, t Si = les épaisseurs cantilever, t f = épaisseur de myotubes, v Si = coefficient de poison de silicium, L = longueur de porte à faux, et la longueur P = chemin de laser de pointe en porte à faux par rapport au détecteur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7 premières données représentatives et l'analyse de la forme contractile en utilisant le système cantilever décrit. (A) Exemple d'une trace de données brutes à partir de la stimulation électrique de myotubes primaires de rat sur des consoles à large champ. Haut trace = déviation laser (en volts) dans l'axe des x, qui indique la longueur en porte à faux sur la souche. Moyen = trace déviation laser (en volts) dans l'axe Y, ce qui indique la tension de torsion dans le cantilever. Trace bas = indication de la position temporelle des impulsions électriques utilisés pour provoquer des myotubes contraction dans ce système. (B) En utilisant un logiciel d'électrophysiologie standard, il est possible de mesurer la force maximale (PF), temps du pic de force (TTP) et le temps de demi- relaxation (1/2 RT) à partir des données brutes collectées. (C) Assemblé données de contraction (n = 11) de rats primaire myotubes de muscle squelettique. Application de l'équation de mise à jour permet un Stoney calcul de la contrainte en porte à faux à partir de lectures de données brutes en Volts. De ces données, le calcul direct de la force (en Newton) peut également être généré. Les données publiées réimprimés wautorisation 13 ième. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Les données représentatives montrant l'analyse de la fatigue musculaire squelettique dans les cultures en porte à faux. Les données brutes (en Volts) a été converti en une mesure de la force de myotubes (en nano-Newton) et re-tracée. Données illustre l'ampleur des contractions de myotubes sur consoles en réponse à 1 Hz large champ électrique des impulsions après 0 min (trace noire) et 120 min (trace grise) de stimulation continue. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9 traces représentatives de l'analyse d'une co-culture de muscle-motoneurone squelettique maintenu sur des consoles, en démontrant les effets fonctionnels de stimulation des neurones moteurs avec et sans addition d'un agent bloquant neuromusculaire. Données brutes (en volts) a été converti en une mesure de myotubes force (en nano-Newtons) et re-tracée. (A) de mesure de contractions spontanées de la part des myotubes en culture sans stimulation neuronale. (B) Mesure de la contraction myotubes après une stimulation neuronale par l'addition de 200 uM de glutamate. (C) Mesure de l' myotubes contraction suivant glutamate et 12,5 uM traitement d-tubocurarine. Les données publiées réimprimé avec la permission 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les tableaux suivants répertorient les réactifs spécifiques utilisés pour des cellules en culture dans les expériences de validation décrits, ainsi que les équipements nécessaires pour effectuer l'évaluation en porte à faux. S'il vous plaît noter que les réactifs de culture utilisés ne sont pas nécessaires et ce système devrait être facilement intégrés avec les protocoles de culture de n'importe quel laboratoire le maintien des cellules contractiles in vitro. Les réactifs énumérés sont fournies devraient enquêteurs souhaitent répéter les résultats expérimentaux spécifiques décrites.
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Discussion
Les étapes essentielles de l'analyse microscopique des consoles de preuve de contraction cellulaire sont le placement de la puce de porte à faux à l'intérieur de la platine du microscope, et l'alignement ultérieur du laser et photo-détecteur à l'extrémité des leviers de coin dans la matrice. Si ce n'est pas fait correctement, le logiciel ne pourra pas extrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau, qui pourrait conduire à l'accumulation de faux négatifs lors de la collecte de données. Les opérateurs doivent veiller à ce que la puce en porte à faux est affleurant avec le fond de la boîte de culture avant de calibrer les positions laser. Si la puce se trouve à un angle dans le plat, il va modifier la trajectoire du faisceau laser dévié et confondre la collecte des données.
Une fonctionnelle air-table doit être utilisée pour annuler les vibrations de fond lors de la collecte de données. La faible épaisseur (environ 4 um) des leviers utilisés dans cette étude provides grande sensibilité à l'activité contractile, mais présente l'effet secondaire d'augmentation de la sensibilité aux vibrations. Les opérateurs doivent prendre soin de déplacer le matériel le moins possible pendant l'enregistrement de données, de réduire les lectures de fond. Enfin, lors de la passation de la puce en porte à faux dans le stade, prendre soin d'assurer la puce ne vient pas en contact avec les électrodes d'argent stimulant dans le puits de culture. Application de stimulation à large champ à l'électrode de toucher la puce modifie le trajet de courant et un impact négatif sur la capacité du système à stimuler efficacement les cellules cultivées.
Afin d'obtenir des mesures plus précises de la production de la force dans les myotubes musculaires squelettiques, il est fortement recommandé d'effectuer immunomarquage des cellules cultivées analyse la fois fonctionnel est terminé. Les équations mentionnés ont besoin entrée de la surface de la coupe transversale d'un myotubes (CSA) afin de calculer la force. Alors une valeur supposée peut être utilisé sur la base de pdonnées récédent, la mesure de la CSA exacte d'un myotubes en utilisant des techniques d'imagerie confocale fournira une estimation plus précise de la force exercée par la myotubes de passation des marchés. Données liées à la contraction premières caractéristiques physiques de la cellule en question est précieux dans les résultats de la normalisation sur plusieurs cantilevers et entre conditions expérimentales 15, et donc critique pour générer des prédictions précises de réponses tissulaires à l'ensemble un traitement médicamenteux ou d'une maladie. Les équations de Stoney assument les myotubes examinés couvrent toute la longueur de la poutre afin effort devrait être fait pour inclure uniquement les données obtenues à partir de cellules qui sont conformes à cette hypothèse. Si cela n'est pas possible, l'analyse d'éléments finis peut être utilisée pour fournir une mesure précise de la force de myotubes plus petites que 15 précédemment publié. Cette méthode d'analyse est beaucoup plus de main-d'œuvre, et donc mal adapté aux applications de débits plus élevés, mais peut être nécessaire si optimisécultures de cellules conformes aux hypothèses de Stoney ne peuvent pas être obtenus.
Comme déjà dit, les paramètres de culture peuvent être transférées à partir de préparations de lamelle standard. Cependant, il est conseillé d'envisager d'utiliser des compositions de milieux sans sérum et des substrats non-biologiques pour l'utilisation de ce système dans les applications de criblage de médicaments. En raison de la nature définie sérums animaux, l'effet de nouveaux agents thérapeutiques peut être compliquée par l'incorporation de ces additifs dans le milieu de culture. Formulations de milieux sans sérum sont disponibles pour les rongeurs et les cultures de muscles squelettiques humains 18-21 et fournir un environnement bien défini plus contrôlée pour effectuer l'évaluation de composé. De même, l'utilisation de revêtements biologiques (le collagène, la laminine, etc) sur les leviers présente la variabilité des préparations de cellules qui sont évitées par l'application de substrats non-biologiques. Le dépôt de monocouches auto-assemblées de silane sur les surfaces de culture ont été montrés extensively pour soutenir l'adhésion et le développement de plusieurs types de cellules 16,18,20,22-31, et représenter les moyens de générer des surfaces entièrement définis d'une manière fiable et reproductible.
En raison de la plage de cellules contractiles présents dans les systèmes mammifères, l'application de ce modèle pour les essais in vitro est relativement large. Bien optimisé en utilisant des cellules de muscle squelettique, le système est potentiellement applicable à cellules musculaires lisses et des cardiomyocytes ainsi, fournir les moyens de procéder à l'évaluation rapide des réponses à la dose de nouveaux traitements dans ces cellules en temps réel. Puces cantilever actuels se composent d'un ensemble de 32 consoles (figure 5A), mais peuvent être facilement modifiés pour inclure beaucoup plus. L'analyse de ces tableaux produit un nombre important de points de données à partir d'une seule culture, ce qui augmente considérablement la puissance statistique de toute différence observée. Comme le montre la figure 8, les cellules cultivéesdans ce système subir la fatigue au fil du temps, en réponse à une stimulation continue à large champ, permettant l'évaluation des effets des médicaments sur les niveaux de cellules in vitro. Ajout de neurones moteurs innervant à ce modèle de culture d'endurance permet également l'évaluation de la formation des synapses par mesure de muscle contraction en réponse à des stimulants neuronaux (figure 9). Alors que la mesure de paramètres de fonctionnement de référence dans un dosage multiplex (figure 7) a des avantages évidents par rapport à l'évaluation biomoléculaire norme de cultures in vitro, la capacité d'évaluer la fonctionnalité neuromusculaire et la capacité d'endurance des cellules ensemencées augmente considérablement l'applicabilité de ce modèle pour le criblage de médicaments et des applications de modélisation de la maladie. La technique décrite offre enquêteurs les moyens de procéder à l'évaluation fonctionnelle rapide, à faible coût de deux cellules musculaires saines et malades in vitro. La souplesse du système de culture, et l'hniveau de détail fonctionnel obtenu à partir de l'analyse des données brutes aute, devrait produire des prévisions plus précises de vivo des réponses à des tissus à de nouveaux défis pathologiques et chimiques.
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Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l'Institut national de numéros de subventions santé R01NS050452 et R01EB009429. La fabrication des puces en porte à faux a été réalisée à l'extérieur par des collaborateurs à l'installation de NanoFabrication situé à l'Université Cornell. Tout l'équipement utilisé dans le procédé de fabrication en porte à faux a été localisé dans cette installation. Un merci spécial à Mandy Esch et Jean-Matthieu Prot pour leur aide avec cantilever micro-fabrication. animation de la vidéo de la fonctionnalité de console a été généré par Charles Hughes, Alex Zelenin et Eric Imperiale du Laboratoire de réalité synthétique à l'ICU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
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