Artículo de método

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

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DOI:

10.3791/51872

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2 de agosto de 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

En este artículo

Resumen

El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.

Resumen

De alta densidad de microarrays de proteínas funcionales que contienen ~ 4200 proteínas de levadura recombinantes se examinan las interacciones proteína-proteína quinasa utilizando una proteína de fusión purificada por afinidad levadura quinasa que contiene una etiqueta V5-epítopo para leer-out. Quinasa purificada se obtiene mediante cultivo de una cepa de levadura optimizado para la producción de proteínas de copia alto que alberga un plásmido que contiene una fusión de quinasa-V5 construir bajo un promotor inducible GAL. La levadura se cultiva en medios de comunicación restrictiva con una fuente de carbono neutral durante 6 horas seguido de inducción con 2% de galactosa. A continuación, el cultivo se recoge y se purifica usando quinasa de afinidad estándar técnicas cromatográficas para obtener una proteína quinasa altamente purificada para su uso en el ensayo. La quinasa purificada se diluye con tampón de quinasa a un rango apropiado para el ensayo y los microarrays de proteínas están bloqueados antes de la hibridación con el microarray de proteínas. Después de la hibridación, los arreglos se probaron con antib V5 monoclonalody para identificar proteínas unidas por la proteína quinasa-V5. Por último, las matrices se escanean con un escáner de microarrays estándar, y los datos se extrajeron para el análisis de la informática aguas abajo 1,2 para determinar una alta confianza conjunto de interacciones de proteínas para la validación de aguas abajo en vivo.

Introducción

La necesidad de realizar análisis globales de bioquímica de proteínas y la actividad in vivo de unión se ha traducido en el desarrollo de nuevos métodos para perfiles de interacciones proteína-proteína (IBP) y las modificaciones post-traduccionales de proteomas enteros 1,3-8. Microarrays de proteínas se fabrican como los microarrays de proteínas funcionales utilizando proteínas funcionales de larga duración 4-6,8,9 o microarrays de proteínas que contienen anticuerpos analíticos 10,11. Están diseñados para contener una alta densidad de proteínas dispuestas en portaobjetos de microscopio con una variedad de químicas de superficie para facilitar una variedad de condiciones experimentales requeridas para la realización de bioquímica amplio análisis 12. Nitrocelulosa y de superficie aldehído químicas para la unión química a través de métodos de fijación de lisina o de afinidad tales como toboganes quelatos de níquel para la fijación de proteínas etiquetadas-Su y el glutatión para la fijación de afinidad entre otros 13.

El uso de microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína requiere acceso a una biblioteca de alta calidad de proteína funcional 14. S. cerevisiae es susceptible de producir tal una biblioteca a través de la vinculación de la afinidad alta copia etiquetados construcciones de proteínas con alto rendimiento técnicas de purificación cromatográfica. La gran mayoría de genoma de la levadura ha sido secuenciado y casi todo el proteoma puede ser expresada a partir de un plásmido de alta copia para la purificación y análisis bioquímicos 12. Una vez que se obtienen las proteínas y dispuestas en formato de 384 pocillos, que se imprimen en un portaobjetos de microscopio que permite un rápido análisis bioquímico multi-paramétrico paralelo e interrogatorio bioinformático 8,14-16. Microarrays de proteínas se han utilizado para ensayos enzimáticos y de las interacciones con proteínas, lípidos, moléculas pequeñas, y ácidos nucleicos, entre muchas otras aplicaciones. La accesibilidad de las proteínas en la superficie del proteomaarrays los hacen susceptibles a diferentes tipos de detección analítica, incluyendo inmune afinidad, resonancia de plasmón superficial, la fluorescencia y muchas otras técnicas. Además, permite un control preciso de la condición experimental donde podría ser difícil de hacer en vivo.

El objetivo de este protocolo es demostrar el uso apropiado de los microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína. Esta aplicación permite el análisis bioquímico paralelo de alto rendimiento de las actividades de unión a proteínas utilizando un analito altamente purificada (proteína) de interés. Un C-terminal (carboxi-terminal) etiquetada proteína cebo V5-fusión de interés se produce a partir de un plásmido de alta copia en una cepa de levadura optimizado para la purificación de proteínas. Marcado C-terminal asegura que la proteína de longitud completa se ha traducido. La proteína utilizada en este estudio es Tda1-V5 proteína de fusión de cinasa, que se purificó usando resina de afinidad de níquel a través de una etiqueta His6X. La construc fusión Tda1-V5t se purifica a través de elución serial usando un gradiente de imidazol para eluir la fracción más altamente enriquecido para su uso en el ensayo.

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Protocolo

1. Preparación de la sonda

  1. Cultura y purificar las sondas V5-quinasa de fusión utilizados para examinar las interacciones con otras proteínas como sigue:
    1. Utilice recién rayada cepa Y258 de levadura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) que contiene proteína V5-fusión (expresado desde GATEWAY vector pYES-DEST52). Utilice la proteína aislada como sonda en los microarrays. Placa de la levadura en completa-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrosa / Agar y crecer a 30 ° C durante 3 días a partir de cultivo congelado (-80 ° C glicerol).
    2. Inocular cultivos iniciadores (5-20 ml) de una sola colonia y crecer durante la noche en SC-ura / 2% de dextrosa en agitación plataforma (220-250 rpm) o rueda a 30 ° C.
    3. A la mañana siguiente, inocular 400 ml de la Sc-Ura / 2% cultura rafinosa con cultivo iniciador suficiente para una DO final de 600 0.1.
    4. Cultivar los inóculos a OD 600 de 0,6, seguido de galactosa inducción de la fu V5-quinasaSion constructo de expresión mediante la adición de una solución de levadura Extracto de 3x / peptona (YEP) suplementado con 6% de galactosa, mediante la adición de suficiente para diluir los medios de inducción por un factor de 3 para que concentración final de galactosa es 2%.
    5. Inducir a las células a 30 ° C durante 6 horas en una plataforma de agitación. Utilice un matraz de 2 L Erlenmeyer para asegurar la aireación adecuada.
    6. Cosecha células utilizando un rotor JA-10 (o comparable) haciendo girar 400 ml de suspensión celular a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Se lavan las células una vez con 50 ml de hielo búfer y transferir a un tubo cónico de 50 ml de PBS frío. Lavar el pellet de nuevo en hielo tampón PBS frío (sin detergentes u otros aditivos) que se utilizan para la lisis y traslado a 2 ml complemento tapa tubos para la lisis.
    8. Girar las células a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C en un precipitado y pipeta de distancia el búfer.
    9. Coloque los tubos en hielo y continúe con el paso de lisis.
    10. Lyse las células (250-350 l pellet) con 00,5 mm perlas de óxido de circonio en una proporción 1: 1: 1 volumen de sedimento celular, cuentas, y solución salina tamponada con fosfato (PBS) lisis de amortiguación y agitar la mezcla usando una plataforma de agitación 3 veces a intervalos de 2 min a 4 ° C.
    11. Centrifugar el lisado a 20.000 xg en una microcentrífuga de sobremesa durante 10 min a 4 ° C.
    12. Pipeta sobrenadante en el tubo de centrífuga de policarbonato de alta velocidad y aclarar por ulracentrufugation durante 30 minutos a 150.000 xg a 4 ° C.
    13. Transferir el lisado aclarado a un tubo que contiene resina de Ni 2+ prelavado afinidad (~ 100 l) y se incuba en un nutator durante 2 horas a 4 ° C para capturar histidina (His) 6X proteína marcada V5-fusión.
    14. Lavar la resina tres veces durante 10 minutos a 4 ° C con tampón de lavado. Se precipitan la resina usando una centrífuga de mesa durante 5 min a 1000 xg a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Añadir tampón de lavado fresca para cada lavado y devolver el tubo de la nutator para la agitación durante el lavado.
    15. Después del lavado steps son completos, aplicar la resina se lava a una columna fresca G-25 para la elución.
    16. Aplicar 25 l de tampón de elución de una manera paso a paso empezando con 100 mM de imidazol a 500 mM de imidazol en incrementos de 50 mm para un total de 9 fracciones.
    17. Ensayo de fracciones recogidas usando gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie para identificar la fracción (s) más altamente enriquecido para uso en el ensayo y añadir glicerol al 30% y se almacena a -80 ° C hasta su uso en el ensayo.

2. Sondeo los Arrays

NOTA: Por favor consulte el paso 2.6 de esta sección para preparar la solución de anticuerpos antes de comenzar el ensayo.

  1. Para detectar interacciones, diluir el anticuerpo conjugado-V5 fluoróforo (es decir AlexaFluor 647) a 260 ng / ml en tampón sonda y mezclar bien por agitación.
    NOTA: Preparar esta solución de anticuerpo 30 min antes de su uso y colocar el tubo en un nutato o rueda para asegurar una mezcla completa y una suspensión homogénea de anticuerpos.
  2. Diluir la sonda proteína V5-fusión en un rango de concentración de 5-500 g / ml.
    NOTA: Optimizado para cada ensayo interacción proteína-proteína, utilizando tampón sonda. Optimización implica la adición de más sondas para sondear tampón. Típicamente 10 mg / ml se utiliza como punto de partida y ajusta en consecuencia sobre la base de la intensidad de la señal.
  3. Retire los microarrays de proteínas del congelador (-20 ° C) y llevar a 4 ° C en el refrigerador justo antes de su uso.
  4. Añadir tampón de bloqueo directamente al soporte de diapositivas que contiene los micorarrays proteínas y cubrir la parte superior con parafilm para evitar fugas. Bloquear las matrices en tampón de bloqueo durante 1 hr por agitación a 50 rpm en un escenario a 4 ° C.
  5. Después del bloqueo, transferir los arrays a una cámara humidificada enfriado a 4 ° C, y añadir 90 l de sonda diluida directamente a la superficie de la matriz. Superposición del arrays con un resbalón elevador levantado e incubar estática (sin agitación) en la cámara húmeda a 4 ° C durante 1,5 horas.
  6. Lavar las matrices 3 veces durante 1 min cada uno en tampón de sonda en tres tubos de 50 ml cónicos. Añadir la diapositiva para tubos cónicos que contienen suficiente búfer sonda pre-enfriado para envolver completamente el portaobjetos. Deje que el deslizamiento elevador se deslice suavemente fuera de los microarrays de proteínas (no lo fuerce fuera ya que esto podría causar daños a la superficie de la matriz).
  7. Aplicar la solución de anticuerpos directamente a la matriz inmediatamente después de completar el lavado (paso 2.5) y la superposición con una hoja de levantador planteado como antes. Incubar las matrices de 30 min a 4 ° C en la cámara de humidificado.
  8. Realice el mismo paso de lavado como antes (3 veces 1 min en tampón de sonda), y centrifugado en un tubo cónico de 50 ml a 800 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Seque las matrices en un soporte de diapositivas en la oscuridad durante 30 minutos antes de la exploración de la matriz en 647 nm.

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Resultados

Se observó la actividad de interacción proteína-proteína usando un lector de chip estándar para evaluar la fusión de la proteína quinasa Tda1-V5 constructo como una proteína de cebo contra una levadura de microarrays proteína funcional que contiene aproximadamente 4.200 única S. las proteínas de fusión GST cerevisiae. Además de interrogación con el software Genepix reveló una multitud de eventos de diferentes intensidades de unión. La afinidad se mide a partir de la intensidad graduada de la señal deri...

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Discusión

El protocolo presentado se realizó originalmente con 85 proteínas únicas fusión quinasa-V5 de proteínas de levadura para comparar la actividad de unión a través de familias distintas y relacionadas de quinasas de proteínas de levadura que resulta en la identificación de nuevas redes de interacción quinasa in vivo 1. Como la tecnología de perfiles proteómicos emergentes, el desarrollo de alto rendimiento (HTP) proyección de proteomas utilizando microarrays de proteínas confiado en bibliotecas de pépti...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH. Los ensayos que se muestran en la Figura 1 fueron realizados por el Dr. Joseph Fasolo. Agradecemos al Dr. Rui Chen por sus útiles comentarios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de PetriVWRNC-10747o comparable
Extracto de levadura BactoDifco0217-17
Bacto peptonaDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DextrosaSigmaD9434
RafinosaSigmaR0514
GalactosaSigmaG0750
Sc-Ura Medios de entregaMP Bio114410622
Tubos de cultivo pequeñosVWR/Fisher
Matraz Erlenmeyer grandeCentrífuga VWR/Fisher
JA-10
Tubos de centrífuga (500 ml)
Tubo Falcon (50 ml)VWR/Fisher21008-951
PBS TabletsSigmaP4417
FastPrep Tubos (tubo de rosca de 2 ml)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Imidazol (pH = 7.4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Cóctel Completo de Inhibidores (Libre de EDTA)Roche11873580001
Cóctel de inhibidores de la fosfatasa 1sigmaP2850
BSASigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Incubadora de agitación (30 ° C)
Resina de afinidad de níquelLife TechnologiesR901-01
G25 columnaGE ciencias de la vida27-5325-01  
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Anticuerpo monoclonal V5Life TechnologiesR960-25
Alexa647 Etiquetado anticuerpo monoclonal V5Life Technologies451098
Microarrays de proteínas KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
tampón de lisis: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM de NaCl, 50 mM de imidazol (pH 7,4), cóctel completo de inhibidores de proteasas – Cóctel 1 de inhibidor de fosfatasa sin EDTA, 1 mM PMSF  (añadir justo antes de usar)		Añadir los reactivos a 1x PBS (0,01 M de tampón de fosfato, 0,0027 M de cloruro de potasio, 0,137 M de cloruro de sodio; pH 7,4) para obtener el volumen deseado de solución de lisis
Tampón de bloqueo: 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,1% Tween-20Añada los reactivos a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón
de bloqueoTampón de sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM TDT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (para quinasas), 1% BSAAgregue el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón de sonda
Tampón de lavado: 0,1% Triton X-100, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, 50 mM de imidazol (pH 7,4), 2 mM de MgCl2Agregue el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón
de sondaTampón de elución: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM de imidazol (pH 7,4), cóctel completo de inhibidores de la proteasa – Cóctel de inhibidor de fosfatasa sin EDTA 1, 1 mM PMSF (añadir justo antes de usar)Antes de comenzar, es importante tener en cuenta el gradiente de concentración de imidazol (50 – 500 mM) y crear tubos separados para cada concentración (es aconsejable crear el intervalo utilizando incrementos de 50 mM). Añadir el reactivo a 1x PBS para obtener el volumen deseado de tampón de sonda
3x YEP +6% galactosa: Disolver 30 g de extracto de levadura y 60 g de peptona en 700 ml de H2O, y autoclave. Añadir 300 ml de filtro esterilizado al 20% galactosa (peso/vol)  La galactosa no debe esterilizarse en autoclave
Rotor Zircon Beads BioSpec 11079105

Referencias

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110(2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

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